本發(fā)明涉及牛肝菌化學(xué)成分測(cè)定方法，具體涉及一種牛肝菌中煙堿的手性分析方法。
背景技術(shù)：
：牛肝菌，又名白牛肝菌、大腳菇、黃蕎巴，是一種大型食用真菌。中國(guó)是牛肝菌的全球主要產(chǎn)區(qū)之一，據(jù)粗略統(tǒng)計(jì)，中國(guó)牛肝菌每年平均產(chǎn)量約5萬(wàn)噸（鮮重），除少量?jī)?nèi)銷外，絕大部分出口。中國(guó)牛肝菌的主銷市場(chǎng)是歐盟、瑞士、美國(guó)和中國(guó)香港等國(guó)家和地區(qū)，其中歐盟是中國(guó)牛肝菌產(chǎn)品的第一出口市場(chǎng)，約占整個(gè)出口市場(chǎng)份額的90%。然而自2008年9月1日起，德國(guó)率先執(zhí)行歐盟（EC）No.396/2005的規(guī)定，即牛肝菌樣品中煙堿限量標(biāo)準(zhǔn)為0.01mg/kg（折成干品為0.12mg/kg），歐盟其他進(jìn)口商也紛紛要求增加對(duì)煙堿的抽檢。2008年11月17日，德國(guó)巴登符騰堡州內(nèi)政部從市場(chǎng)上抽查了26個(gè)牛肝菌樣品，其中22個(gè)樣品被檢出煙堿含量超標(biāo)，這些被抽檢樣品大部分來自中國(guó)。雖然2010年4月，歐盟消費(fèi)者保護(hù)總司以立法的形式對(duì)法案（EC）No.396/2005進(jìn)行了修訂，將牛肝菌干品中煙堿的最高限量調(diào)整為2.3mg/kg，中國(guó)牛肝菌仍有部分產(chǎn)品煙堿含量超標(biāo)。這一風(fēng)波不僅嚴(yán)重影響了中國(guó)牛肝菌產(chǎn)品的出口，也引起了人們對(duì)通過牛肝菌攝入煙堿的健康風(fēng)險(xiǎn)的廣泛關(guān)注。煙堿，也叫尼古丁，是一種存在于茄科植物中的生物堿，也是煙草的重要成分，牛肝菌等野生菌類中也含有煙堿，中國(guó)國(guó)家質(zhì)檢總局對(duì)牛肝菌中煙堿來源的調(diào)查認(rèn)為煙堿是真菌類物種生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的一種普遍存在的次生代謝產(chǎn)物。煙堿分子含有一個(gè)手性中心，即四氫吡咯環(huán)上的2位碳原子，所以煙堿有兩個(gè)對(duì)映體：S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿。煙堿的兩個(gè)對(duì)映體具有完全不同含量、代謝機(jī)理和生理特性。S-(-)-煙堿的生理活性和毒性都要高于R-(+)-煙堿，例如相對(duì)于煙堿乙酰膽堿受體，S-(-)-煙堿比R-(+)-煙堿的親和性高10-100倍。因此進(jìn)行牛肝菌中煙堿的手性分析對(duì)了解經(jīng)牛肝菌攝入煙堿的健康風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。目前關(guān)于煙堿的手性分析，主要是針對(duì)煙草和煙草制品中煙堿的手性分析方法研究，尚未有關(guān)于牛肝菌中煙堿的手性分析方法。牛肝菌中煙堿的含量遠(yuǎn)低于煙草中的含量，這給牛肝菌中煙堿手性分析帶來了挑戰(zhàn)。因此有必要開發(fā)一種靈敏度高、精密度好、適合準(zhǔn)確定量牛肝菌中S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明以煙堿為研究對(duì)象，對(duì)牛肝菌樣品進(jìn)行了前處理方法研究，建立了基于自動(dòng)固相微萃取-多維氣相氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)的牛肝菌中煙堿旋光異構(gòu)體的分析方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)牛肝菌中煙堿旋光對(duì)映體S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的準(zhǔn)確測(cè)定。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一種牛肝菌中煙堿的手性分析方法，將牛肝菌樣品干燥、粉碎和過篩，加入萃取液萃取并過濾，經(jīng)自動(dòng)固相微萃取后進(jìn)行多維氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（MDGCMS）分析；具體步驟如下：1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別稱取100.0mg的S-(-)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)品、50.0mg的R-(+)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷配制S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿濃度分別為100μg/mL和50μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為100μg/mL的S-(-)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為100μg/mL的R-(+)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。2）牛肝菌樣品的混勻：將牛肝菌樣品置于40℃烘箱中，1小時(shí)后將牛肝菌樣品取出，粉碎后過0.45毫米孔徑標(biāo)準(zhǔn)篩；3）牛肝菌樣品的萃?。悍Q取約5g牛肝菌粉末，置于100mL錐形瓶中，加入20mL水，40mL正己烷和10mL2mol/L氫氧化鈉溶液，具塞震蕩萃取1h后，將萃取液避光靜置30min；取上層有機(jī)相，2000g離心10min后過0.22μm濾膜至螺紋瓶中待進(jìn)樣。4)多維氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析：將步驟3）的過濾液再經(jīng)自動(dòng)固相微萃取后進(jìn)行多維氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，具體條件如下：①自動(dòng)固相微萃取條件：自動(dòng)萃取纖維首次使用時(shí)需要進(jìn)行老化，條件如下：固定相PDMS/DVB(聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯)，250℃老化30min；樣品加熱溫度30℃，預(yù)熱3min，萃取時(shí)間5min，解吸5min，進(jìn)樣后在250℃烤針10min。②一維分析條件：色譜柱：30m×0.25mm×0.25μm5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷毛細(xì)管色譜柱(Rtx-5MS色譜柱或其他等效柱)。進(jìn)樣口溫度：250℃。載氣：氦氣（純度≥99.999%)，恒壓進(jìn)樣：117.9kPa。升溫程序：初始溫度80℃，平衡時(shí)間1min，以10℃/min的速率至200℃，保持10min。檢測(cè)器：火焰離子化檢測(cè)器（FID）；溫度：280℃；氫氣：40mL/min；空氣：400mL/min；尾吹：10mL/min；切割壓力為50.0kPa。③二維分析條件：色譜柱：30m×0.25mm×0.25μm環(huán)糊精毛細(xì)管色譜柱(InertCapCHIRAMIX色譜柱或其他等效柱)。升溫程序：初始溫度50℃，保持3min，以2℃/min的速率升至130℃，之后以3℃/min的速率升至180℃，保持1min。檢測(cè)器：電子轟擊源（EI）；離子源溫度：200℃；接口溫度：220℃；檢測(cè)器電壓相對(duì)于調(diào)諧結(jié)果0kV；溶劑延遲：3min；檢測(cè)模式：選擇離子檢測(cè)模式（SIM）；定量離子84。5）采用對(duì)照標(biāo)樣與牛肝菌樣品煙堿色譜峰的保留時(shí)間及特征離子進(jìn)行S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的定性分析，對(duì)定量離子峰面積進(jìn)行歸一化定量S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿占總煙堿的比例。本發(fā)明提供了一種牛肝菌中煙堿的手性分析方法，具有以下優(yōu)良效果：1.本發(fā)明方法采用液液萃取和固相微萃取的前處理方法，前處理過程簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便快速，且前處理效果較好。2.本發(fā)明方法采用多維氣相氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，能實(shí)現(xiàn)對(duì)S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的較好分離，R-(+)-煙堿的檢出限（LOD）為0.25%，能夠滿足牛肝菌樣品中煙堿的手性分析。3.本發(fā)明方法采用了高靈敏度和強(qiáng)抗干擾能力的質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，因此具有操作準(zhǔn)確、檢出限低、回收率及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。附圖說明圖1為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖，圖2為牛肝菌1#樣品的色譜圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明通過以下具體實(shí)施例作進(jìn)一步描述，但不限制本發(fā)明。1.儀器和試劑MDGCMS-QP2010Ultra多維氣質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津公司），自動(dòng)進(jìn)樣器AOC-5000（日本島津公司），自動(dòng)固相微萃取纖維進(jìn)樣針，65μmPDMS/DVB（聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯）固定相萃取纖維頭（美國(guó)Supelco），Rtx-5MS色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm，日本島津公司），InertCapCHIRAMIX色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm，日本島津公司），AE163電子天平（感量：0.0001g，瑞士Mettler公司），HY-8調(diào)速振蕩器（常州國(guó)華電器有限公司），高速粉碎機(jī)（武漢銀彩科技有限公司），德國(guó)SIGMA3-30K-高速臺(tái)式冷凍型離心機(jī)。正己烷（色譜純），氫氧化鈉（分析純），S-(-)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：54-11-5），R-(+)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：25162-00-9）。2.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制稱取約100.0mg的S-(-)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷稀釋定容到50mL棕色容量瓶中，配制成濃度約為2.0mg/mL的S-(-)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；稱取約50.0mg的R-(+)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷稀釋定容到50mL棕色容量瓶中，配制成濃度約為1.0mg/mL的R-(+)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；各取50μLS-(-)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和R-(+)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用正己烷稀釋定容至100mL棕色容量瓶中，配制S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿濃度分別為1μg/mL和0.5μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，另外分別稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液得到1μg/mL的S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。3.煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的手性分析取10mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按照上述自動(dòng)固相微萃取-多維氣相氣質(zhì)分析條件進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿能在此條件下實(shí)現(xiàn)較好分離；取10mLS-(-)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行自動(dòng)固相微萃取-多維氣相氣質(zhì)分析，另將10mLR-(+)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行多維氣相氣質(zhì)分析，最終通過S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的保留時(shí)間，確定S-(-)-煙堿先于R-(+)-煙堿出峰。4.R-(+)-煙堿的檢出限煙堿的手性組成通常以R-(+)-煙堿占總煙堿的百分比來表示。為評(píng)估R-(+)-煙堿的檢出限，本發(fā)明方法在S-(-)-煙堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入R-(+)-煙堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液。結(jié)果表明，S-(-)-煙堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液中即可觀察到R-(+)-煙堿的響應(yīng)信號(hào)，對(duì)定量離子峰面積進(jìn)行歸一化后，S-(-)-煙堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液中R-(+)-煙堿的比例為0.25%（峰面積相對(duì)于總煙堿峰面積），以此作為本方法R-(+)-煙堿的檢出限。5.牛肝菌樣品中煙堿的手性分析實(shí)例將牛肝菌樣品置于40℃烘箱中，1小時(shí)后將牛肝菌樣品取出，粉碎后過0.45毫米孔徑標(biāo)準(zhǔn)篩；稱取約5g牛肝菌粉末，置于100mL錐形瓶中，加入20mL水，40mL正己烷和10mL2mol/L氫氧化鈉溶液，具塞震蕩萃取1h后，將萃取液避光靜置30min；取上層有機(jī)相，2000g離心10min后過0.22μm濾膜，經(jīng)自動(dòng)固相微萃取后進(jìn)行多維氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析；采用對(duì)照標(biāo)樣與牛肝菌樣品煙堿色譜峰的保留時(shí)間及特征離子進(jìn)行S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的定性分析，對(duì)定量離子峰面積進(jìn)行歸一化定量S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿占總煙堿的比例。采用該方法對(duì)6個(gè)牛肝菌樣品進(jìn)行了分析，結(jié)果見表1。表1.牛肝菌中煙堿的手性分析結(jié)果序號(hào)S-(-)-煙堿R-(+)-煙堿牛肝菌1#95.27%4.73%牛肝菌2#98.27%1.73%牛肝菌3#96.54%3.46%牛肝菌4#96.47%3.53%牛肝菌5#96.60%3.40%牛肝菌6#95.37%4.63%6.分析方法的精密度取同一牛肝菌樣品進(jìn)行5次日內(nèi)和日間平行測(cè)定，考察了本發(fā)明方法的精密度，結(jié)果見表2和表3。結(jié)果表明，牛肝菌樣品中R-(+)-煙堿的日內(nèi)和日間測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)分別為1.96%和3.35%，精密度較好。表2.實(shí)驗(yàn)方法的日內(nèi)精密度樣品第1次第2次第3次第4次第5次平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（%）牛肝菌1#4.84%4.62%4.79%4.65%4.74%4.73%0.09%1.96%表3.實(shí)驗(yàn)方法的日間精密度樣品第1次第2次第3次第4次第5次平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（%）牛肝菌1#4.73%4.92%4.49%4.75%4.64%4.71%0.16%3.35%采用具體實(shí)施方式中的方法對(duì)上述6個(gè)牛肝菌樣品進(jìn)行了檢測(cè)。檢測(cè)得到的色譜圖如圖1和圖2所示，圖1為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖，圖2為牛肝菌1#樣品的色譜圖。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3