本發(fā)明屬于中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)領(lǐng)域，特別涉及一種安年顆粒鑒別及含量測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
：更年期綜合征是指婦女絕經(jīng)前后由于內(nèi)分泌系統(tǒng)失去平衡導(dǎo)致雌激素分泌減少，由此所致的一系列軀體及精神心理癥狀。近年來由于生活、工作壓力的增大，其發(fā)病年齡有所提前，且發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)；更年期婦女的癥狀明顯，患者背負(fù)了沉重的精神壓力，嚴(yán)重影響了家庭生活的和諧。目前對(duì)于更年期綜合征多采用補(bǔ)充雌激素治療或服用具有安神鎮(zhèn)靜功效類藥物，但其臨床癥狀改善率并不理想，而且長(zhǎng)期服用對(duì)身體還有一定的毒副作用。安年顆粒是一種針對(duì)更年期綜合征的中藥制劑，具有溫腎陽、補(bǔ)腎精、瀉相火、調(diào)沖任的功能。安年顆粒的處方為：淫羊藿714g、仙茅714g、當(dāng)歸714g、巴戟天714g、知母714g、黃柏714g。制法為取以上六味藥材，加水煎煮兩次。第一次加12倍量水，浸泡30分鐘，煮沸1小時(shí)，濾過；第二次加10倍量水，煎煮30分鐘，濾過，濾液合并，濃縮至相對(duì)密度1.12～1.13(50℃～60℃)，冷卻至室溫，加入乙醇使含醇量至60％，攪勻，靜置使沉淀，取上清液，減壓回收乙醇(溫度：65℃±2，真空度：0.08MPa)，并濃縮至清膏相對(duì)密度1.15-1.20(60℃±2)，取清膏加輔料適量，制成1000g顆粒，即得。但是目前對(duì)于安年顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并未有研究涉及。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種安年顆粒鑒別及含量測(cè)定方法，該方法能使安年顆粒的活性成分得到有效控制，且方法穩(wěn)定可靠，專一性強(qiáng)，大大提升了安年顆粒的整體質(zhì)量，保證了療效，具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的一種安年顆粒鑒別及含量測(cè)定方法，包括：(1)鑒別仙茅：取安年顆粒加水溶解，離心，取上清液，用乙醚提取，棄去乙醚液，水液加碳酸氫鈉，超聲溶解，用乙酸乙酯提取，提取液洗滌后，置水浴上蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴ト芙?，作為供試品溶液；另取仙茅苷?duì)照品，加乙酸乙酯制成溶液，作為對(duì)照品溶液；吸取上述兩種溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開，取出，晾干，噴顯色液；供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；(2)鑒別當(dāng)歸：取安年顆粒加乙醇，水浴加熱，過濾，蒸干濾液，殘?jiān)铀芙猓靡颐烟崛?，除去乙醚，殘?jiān)右掖既芙?，作為供試品溶液；另取阿魏酸?duì)照品，加乙醇制成溶液，作為對(duì)照品溶液；吸取上述兩種溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開，取出，晾干，噴顯色液；供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；(3)鑒別知母：取安年顆粒加乙醇，加熱，過濾，濾液加鹽酸，加熱回流，回收乙醇至干，殘?jiān)铀暼芙?，用三氯甲烷提取，三氯甲烷液用水洗滌后置水浴上蒸干，殘?jiān)尤燃淄槿芙猓鳛楣┰嚻啡芤?；另取菝葜皂苷元?duì)照品，加三氯甲烷制成溶液，作為對(duì)照品溶液；吸取上述兩種溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開，取出，晾干，噴顯色液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰；供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；(4)鑒別黃柏：取安年顆粒加甲醇，超聲處理，取安年顆粒，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓∩锨逡鹤鳛楣┰嚻啡芤?；另取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成溶液，作為對(duì)照品溶液；吸取上述兩種溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，置氨蒸氣飽和的層析缸內(nèi)展開，取出，晾干，置紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；(5)檢測(cè)淫羊藿含量：取安年顆粒加入乙醇，超聲處理，過濾，得供試品溶液；另取淫羊藿苷對(duì)照品，加甲醇制成溶液，作為對(duì)照品溶液；吸取上述兩種溶液注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。所述步驟(1)中的展開采用體積比為10:1:0.1的乙酸乙酯-甲醇-甲酸混合溶液作為展開劑。所述步驟(1)中的顯色液為體積比為1:1的2％鐵氰化鉀溶液-2％三氯化鐵混合溶液。所述步驟(2)中的展開采用體積比為20:10:1的苯-乙酸乙酯-甲酸混合溶液作為展開劑。所述步驟(2)中的顯色液為2％的三氯化鐵乙醇溶液。所述步驟(3)中的展開采用體積比為9:1的苯-丙酮混合溶液作為展開劑。所述步驟(3)中的顯色液為硫酸乙醇溶液。所述步驟(4)中的展開采用體積比為6:3:1.5:1.5:0.5的苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨混合溶液作為展開劑。所述步驟(5)中的測(cè)定條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以體積比為27:73的乙腈-水為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm；理論塔板數(shù)按淫羊藿計(jì)不低于2500；流速為1ml/min；柱溫為25℃。有益效果本發(fā)明綜合的質(zhì)量控制方法能使安年顆粒的活性成分得到有效控制，且方法穩(wěn)定可靠，專一性強(qiáng)，大大提升了安年顆粒的整體質(zhì)量，保證了療效，具有良好的應(yīng)用前景。附圖說明圖1為安年顆粒仙茅薄層色譜圖；其中，1為仙茅空白對(duì)照；2為仙茅對(duì)照藥材；3為仙茅苷對(duì)照品；4為安年顆粒(批號(hào)031201)；5為安年顆粒(批號(hào)031205)；6為安年顆粒(批號(hào)031209)；圖2為安年顆粒當(dāng)歸薄層色譜圖；其中，1為當(dāng)歸空白對(duì)照；2為阿魏酸對(duì)照品；3為當(dāng)歸對(duì)照藥材；4為安年顆粒(批號(hào)031201)；5為安年顆粒(批號(hào)031205)；6為安年顆粒(批號(hào)031209)；圖3為安年顆粒知母薄層色譜圖；其中，1為菝葜皂苷元對(duì)照品；2為知母對(duì)照藥材；3為知母空白對(duì)照；4為安年顆粒(批號(hào)031201)；5為安年顆粒(批號(hào)031205)；6為安年顆粒(批號(hào)031209)；圖4為安年顆粒黃柏薄層熒光圖；圖5為淫羊藿苷對(duì)照品HPLC圖譜(270nm)；圖6為安年顆粒供試品HPLC圖譜(270nm)；圖7為淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖8為供試品溶液HPLC圖譜(除淫羊藿以外的其余藥味，270nm)；圖9為空白溶液HPLC圖譜(除淫羊藿以外的其余藥味，270nm)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1安年顆粒含有以下六味藥：淫羊藿、仙茅、當(dāng)歸、巴戟天、知母和黃柏。(1)鑒別仙茅：取安年顆粒5g，加水50ml，加熱使溶解，離心，取上清液，用乙醚50ml振搖提取，棄去乙醚液，水液加碳酸氫鈉2g，超聲使溶解，用乙酸乙酯50ml振搖提取，提取液用水30ml洗滌后，置水浴上蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴?ml使溶解，作為供試品溶液；另取仙茅苷對(duì)照品(購于中國藥品生物制品檢定所批號(hào):0771-200203(鑒別用))，加乙酸乙酯制成每1ml中含50μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上(山東煙臺(tái)芝罘黃務(wù)硅膠試驗(yàn)廠)，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(體積比10:1:0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2％鐵氰化鉀溶液-2％三氯化鐵溶液(體積比1:1)。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，結(jié)果見圖1。(2)鑒別當(dāng)歸：取安年顆粒5g，加水50ml，加熱使溶解，離心，取上清液，用乙醚50ml振搖提取，棄去乙醚液，水液加碳酸氫鈉2g，超聲使溶解，用乙酸乙酯50ml振搖提取，提取液用水30ml洗滌后，置水浴上蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴?ml使溶解，作為供試品溶液；另取阿魏酸對(duì)照品(購于中國藥品生物制品檢定所批號(hào):0773-9910(含量測(cè)定用))，加乙酸乙酯制成每1ml中含50μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(體積比10:1:0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2％鐵氰化鉀溶液-2％三氯化鐵溶液(體積比1:1)。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，結(jié)果見圖2。(3)鑒別知母：取安年顆粒2g，加乙醇20ml，加熱回流40分鐘，過濾，濾液加鹽酸1ml，加熱回流1小時(shí)，回收乙醇至干，殘?jiān)铀?0ml超聲使溶解，用三氯甲烷20ml振搖提取，三氯甲烷液用水10ml洗滌后置水浴上蒸干，殘?jiān)尤燃淄?ml使溶解，作為供試品溶液；另取菝葜皂苷元對(duì)照品(購于中國藥品生物制品檢定所批號(hào):1100744-200407(含量測(cè)定用))，加三氯甲烷制成每1ml中含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-丙酮(體積比9:1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以硫酸乙醇溶液(1→10)，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，結(jié)果見圖3。(4)鑒別黃柏：取安年顆粒2g，加甲醇20ml，超聲處理30分鐘(220V，50HZ)，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，取上清液作為供試品溶液；另取鹽酸小檗堿對(duì)照品(購于中國藥品生物制品檢定所批號(hào):713-940(鑒別用))，加甲醇制成每1ml中含0.25mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液(體積比6:3:1.5:1.5:0.5)為展開劑，置氨蒸氣飽和的層析缸內(nèi)，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，結(jié)果見圖4。(5)檢測(cè)淫羊藿含量：①儀器與試藥：高效液相色譜儀為Agilent1100HPLC；色譜柱為ThermoHypersilC18ODS(250×4.6,5μm)；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。②對(duì)照品純度及來源：淫羊藿苷為中國藥品生物制品檢定所提供，為含量測(cè)定用批號(hào)：110737-200312。③液相色譜條件：測(cè)定淫羊藿苷的色譜條件為用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水(30：70)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm；經(jīng)過多次試驗(yàn)乙腈-水的比例為27：73時(shí)，分離較好。所以確定色譜條件為流動(dòng)相：乙腈-水(27：73)；流速：1ml/min；柱溫：25℃。理論塔板數(shù)確定的依據(jù)：在上述測(cè)試條件下，在系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中規(guī)定理論板數(shù)不得低于2500。④對(duì)照品溶液的制備：精密稱取105℃干燥至恒重的淫羊藿苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml中含20μg的溶液，搖勻，即得。⑤供試品溶液的制備：取本品顆粒約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇20ml，密塞，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45μm的濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得(見圖5，6)。⑥線性關(guān)系的考察：分別吸取一系列不同濃度的對(duì)照品溶液10μl進(jìn)樣并按擬定的色譜條件測(cè)定，得峰面積，以對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，測(cè)定結(jié)果如表1，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖7。表1線性關(guān)系考察結(jié)果含量C(μg)峰面積A0.003757.50.0187537.30.09375179.80.375650.70.751358.41.52717.2回歸方程為y＝1809.64x-1.63r＝0.9999，表明淫羊藿苷在0.00375μg～1.5μg范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。⑦空白試驗(yàn)：按照處方組成，稱取除淫羊藿以外的其余藥味并按照工藝條件制備成缺淫羊藿的供試品。同供試品溶液的制備方法制備成空白溶液。取空白溶液10μl，按照供試品溶液相同的色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定，在色譜圖淫羊藿苷相應(yīng)的保留時(shí)間處無色譜峰，說明空白溶液無干擾(見圖8,9)。⑧穩(wěn)定性試驗(yàn)：將某供試品溶液測(cè)定后，間隔一定時(shí)間再重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明，供試品溶液在9小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，見表2。表2穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果⑨精密度試驗(yàn)：對(duì)同一對(duì)照品溶液依法測(cè)定5次，RSD＝0.55％，結(jié)果說明進(jìn)樣的精密度及儀器精密度均較好。見表3。表3精密度試驗(yàn)結(jié)果⑩重現(xiàn)性試驗(yàn)：取同一批號(hào)供試品5份，按照正文含量測(cè)定方法操作并測(cè)定，RSD＝1.53％，表明操作的重現(xiàn)性較好。見表4。表4重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果回收率試驗(yàn)：準(zhǔn)確量取淫羊藿苷對(duì)照品加入到已知含量的供試品(批號(hào)031201)中，按照正文含量測(cè)定項(xiàng)下操作并測(cè)定，結(jié)果見表5。表5回收率測(cè)定結(jié)果回收率(％)＝(測(cè)得淫羊藿苷量-已知淫羊藿苷量)/加入淫羊藿苷量×100％。供試品含量測(cè)定：按照正文方法對(duì)十批制劑進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見表6。表6含量測(cè)定結(jié)果批號(hào)含量(mg/袋)04062921.105040517.9005040620.2805040719.7505120120.706040120.906040220.606040320.906040420.206040520.1含量限度的制定：根據(jù)上述測(cè)定結(jié)果，十批供試品平均含量為20.18mg/袋，按照平均含量80％計(jì)算，應(yīng)為16.0mg/袋，考慮到生產(chǎn)批量較少可能與實(shí)際大生產(chǎn)有差距，暫定本品每袋含淫羊藿以淫羊藿苷(C33H40O15)計(jì)不得少于15.0mg/袋。當(dāng)前第1頁1 2 3