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      一種TROP2蛋白表達量的檢測方法及試劑盒與流程

      文檔序號:12591703閱讀:2881來源:國知局
      一種TROP2蛋白表達量的檢測方法及試劑盒與流程

      本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,特別涉及一種TROP2蛋白表達量的檢測方法及試劑盒。



      背景技術(shù):

      膀胱癌是最常見的惡性腫瘤之一,2013年在美國大約有72570例新發(fā)病例,15210人死于膀胱癌。初診時約80%的膀胱癌為非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,縮寫為NMIBC),可通過聯(lián)合尿道切除術(shù)和膀胱灌注治療。然而,大約50%~70%的NMIBC病人會在初診后的兩年內(nèi)加重并復(fù)發(fā),其中又有20%~30%的病人會發(fā)展成為肌層浸潤性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,縮寫為MIBC)。

      復(fù)發(fā)和進展是NMIBC的主要特點。到目前為止,已經(jīng)建立并常規(guī)應(yīng)用的預(yù)示腫瘤復(fù)發(fā)和進展的標(biāo)志物主要是依靠腫瘤TNM分期和腫瘤分化程度。然而,應(yīng)用腫瘤TNM分期的一大限制是分期和分化等級相似的腫瘤其生物學(xué)表型常常有顯著的差異。因此,需要找到新的預(yù)測NMIBC復(fù)發(fā)的腫瘤標(biāo)志物。

      人滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原TROP2(trophoblastic cell surface antigen 2),也稱作GA733-1或EGP-1,是一種單次跨膜的表面糖蛋白,可以調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘附。已經(jīng)表明TROP2編碼基因?qū)儆谀[瘤相關(guān)鈣信號傳感器基因家族。盡管TROP2的調(diào)節(jié)還不太清楚,但是其細(xì)胞質(zhì)部分的尾端及保守的酪氨酸和絲氨酸位點的磷酸化被認(rèn)為在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起主要作用。一些研究表明TRop2作為一個真實的癌基因可以導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和侵襲。并且已經(jīng)證明TROP2通過活化ERK和MAPK信號通路引起腫瘤的發(fā)生。

      許多研究報道在正常組織中TROP2不表達或低水平表達,而在人類多種類型的惡性腫瘤中TROP2都有過量表達。并且,高水平的TROP2常與腫瘤進展和預(yù)后差密切相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明TROP2不僅是一個潛在的腫瘤標(biāo)志物,而且還是一個非常有前途的腫瘤治療的靶標(biāo)。然而,到目前為止尚缺乏一種科學(xué)的檢測TROP2蛋白表達量的方法。同時TROP2在膀胱癌中的表達和預(yù)后作用還未被檢測。



      技術(shù)實現(xiàn)要素:

      有鑒于此,本發(fā)明提供了一種TROP2蛋白表達量的檢測方法及試劑盒。該檢測方法能夠科學(xué)的檢測TROP2蛋白表達量,發(fā)現(xiàn)TROP2蛋白在NMIBC中高表達,TROP2是NMIBC的獨立的預(yù)后因素。

      為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的,本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:

      本發(fā)明提供了一種TROP2蛋白表達量的檢測方法,包括:

      采用免疫組化技術(shù)對正常組織和待測樣本組織進行染色,檢測染色濃度和染色范圍;

      根據(jù)染色濃度得到染色濃度分?jǐn)?shù):染色濃度顯示為陰性時為0分;染色濃度顯示弱時為1分;染色濃度顯示中等時為2分;染色濃度顯示強時為3分;

      根據(jù)染色范圍得到染色范圍分?jǐn)?shù):染色范圍占0%時為0分;染色范圍占1%~10%時為1分;染色范圍占11%~50%時為2分;染色范圍占51%~100%時為3分;

      染色指數(shù)SI=染色濃度分?jǐn)?shù)×染色范圍分?jǐn)?shù);

      根據(jù)染色指數(shù)SI,獲得TROP2蛋白表達量。

      在本發(fā)明提供的實施例中,染色指數(shù)SI>1,則TROP2蛋白高表達;染色指數(shù)SI≤1,則TROP2蛋白低表達。

      在本發(fā)明提供的實施例中,根據(jù)染色濃度得到染色濃度分?jǐn)?shù)時,在染色為棕色情況下,染色濃度為強;在染色為深黃色情況下,染色濃度為中等;在染色為淺黃色情況下,染色濃度為弱。

      在本發(fā)明提供的實施例中,采用免疫組化技術(shù)對正常組織和待測樣本組織進行染色具體為:

      取正常組織或待測樣本組織,與TROP2抗體進行第一孵育,然后與生物素標(biāo)記的第二抗體進行第二孵育,再與鏈霉親和素-辣根過氧化物酶進行第三孵育;以DAB為顯色劑進行顯色,再用蘇木精復(fù)染。

      作為優(yōu)選,第一孵育的溫度為4℃,時間為8~12h。

      作為優(yōu)選,第二孵育的溫度為37℃,時間為60min。

      作為優(yōu)選,第三孵育的溫度為37℃,時間為30min。

      作為優(yōu)選,TROP2蛋白表達量用于腫瘤分級、腫瘤分期及檢測非浸潤性膀胱癌無復(fù)發(fā)生存期。

      在本發(fā)明提供的實施例中,正常組織為正常膀胱組織。

      在本發(fā)明提供的實施例中,待測樣本組織為膀胱移行細(xì)胞癌組織。

      本發(fā)明還提供了一種試劑盒,包括TROP2抗體、生物素標(biāo)記的第二抗體、鏈霉親和素-辣根過氧化物酶、DAB和蘇木精。

      本發(fā)明提供了一種TROP2蛋白表達量的檢測方法及試劑盒。該檢測方法包括:采用免疫組化技術(shù)對正常組織和待測樣本組織進行染色,檢測染色濃度和染色范圍;根據(jù)染色濃度得到染色濃度分?jǐn)?shù),根據(jù)染色范圍得到染色范圍分?jǐn)?shù);根據(jù)染色濃度分?jǐn)?shù)和染色范圍分?jǐn)?shù)得到染色指數(shù)SI;根據(jù)染色指數(shù)SI,獲得TROP2蛋白表達量。本發(fā)明具有如下有益效果:

      1、本發(fā)明檢測方法能夠科學(xué)的檢測TROP2蛋白表達量,研究顯示TROP2蛋白在NMIBC中高表達;

      2、本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)TROP2蛋白高表達與腫瘤分級(p=0.001)、分期(p<0.001)和復(fù)發(fā)(p=0.03)顯著相關(guān)。然而,TROP2的蛋白表達與其他臨床病理特征如年齡、性別、腫瘤大小及數(shù)量等并不相關(guān);

      3、本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)歷過復(fù)發(fā)的NMIBC病人其TROP2表達比沒有復(fù)發(fā)過的病人樣本要高(p=0.03)。Kaplan–Meier分析發(fā)現(xiàn)膀胱癌中TROP2表達的與無復(fù)發(fā)生存期顯著相關(guān)(p=0.0012);log-rank檢驗進一步表明在TROP2表達高的組和表達量低的組,其生存時間有顯著差異,這表明TROP2的高水平表達與較短的生存期密切相關(guān);利用多變量分析中的Cox比例風(fēng)險模型分析包括性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、分級、分期和TROP2之間的相關(guān)性,結(jié)果表明:TROP2的高表達與膀胱癌的復(fù)發(fā)顯著相關(guān),提示TROP2可作為NMIBC病人復(fù)發(fā)的獨立的預(yù)后指標(biāo)。

      附圖說明

      圖1示膀胱組織中TROP2免疫組化染色結(jié)果;其中,A示TROP2在膀胱上皮細(xì)胞中染色為陰性,B示TROP2在膀胱癌中中等表達,C示TROP2在膀胱癌膜上強表達;D示TROP2在膀胱癌細(xì)胞質(zhì)中強表達;

      圖2示按照TROP2的表達對無復(fù)發(fā)生存(左)及進展生存(右)NMIBC病人進行Kaplan–Meier生存分析。

      具體實施方式

      本發(fā)明公開了一種TROP2蛋白表達量的檢測方法及試劑盒,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容,適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是,所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的,它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述,相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當(dāng)變更與組合,來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

      本發(fā)明所述的高表達是指TROP2染色指數(shù)SI>1。

      本發(fā)明提供的TROP2蛋白表達量的檢測方法及試劑盒中所用生物材料、試劑或儀器均可由市場購得。

      下面結(jié)合實施例,進一步闡述本發(fā)明:

      實施例1

      一、材料和方法

      1、病人和組織樣本

      為了做免疫組化檢測,共收集了**醫(yī)院2003年1月至2005年12月份的102例石蠟包埋的膀胱移行細(xì)胞癌和23例正常膀胱組織標(biāo)本。收集的標(biāo)準(zhǔn)是膀胱移行細(xì)胞癌的組織病理學(xué)診斷,初診和未經(jīng)治療的,沒有其他腫瘤的歷史,并有隨訪隨訪的可能。原位癌排除在本研究之外。臨床樣本僅用于研究,預(yù)先征得病人同意并且經(jīng)過**醫(yī)院倫理道德委員會批準(zhǔn)。

      臨床樣本的信息在表1中有詳細(xì)描述。病人包括67名男性和35名女性,年齡在41歲到88歲之間,平均年齡為66.1歲。所有病人都做了經(jīng)尿道切除手術(shù),所有病人都用膀胱內(nèi)絲裂霉素C(mitomycin C,MMC)和吡柔比星(pirarubicin,THP)輸液,前8周每周一次,之后每月一次直到滿一年。治療的前兩年每隔3個月做一次膀胱鏡檢查和尿細(xì)胞學(xué)檢查,之后每6個月檢查一次。在分析的時候?qū)τ贜MIBC患者隨訪時間為6~103個月,平均隨訪時間為47個月。通過組織學(xué)的肌層浸潤(病理T2期或更高)或可檢測的遠端轉(zhuǎn)移證實有更低或相同的病理分期和組織學(xué)進展,定義為NMIBC復(fù)發(fā)。本研究的組織病理學(xué)分級和臨床分期是根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)和第六版的pTNM國際抗癌聯(lián)盟(UICC,2002)的標(biāo)準(zhǔn)來定義的。由**醫(yī)院的兩位高級病理學(xué)家對所有腫瘤的組織學(xué)類型和分級重新進行了評估。

      2、免疫組化

      福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片(5μm)經(jīng)脫蠟后復(fù)水,接著用0.3%的H2O2處理10分鐘失活內(nèi)源性的過氧化物酶。切片在96℃的抗原修復(fù)液(1mmol/L EDTA/PBS[pH 9.0])中處理30分鐘進行抗原修復(fù)。切片用羊多抗TROP2抗體在4℃的濕盒內(nèi)孵育過夜,再用生物素標(biāo)記的抗羊二抗孵育30分鐘。接下來用鏈霉親和素-辣根過氧化物酶孵育玻片。DAB被用作發(fā)色原,再用蘇木精復(fù)染切片。用正常血清孵育的樣本作為陰性對照。

      3、免疫染色評估

      由兩位病理學(xué)家對臨床指標(biāo)未知的每張切片的5個區(qū)域進行獨立的評估和確認(rèn)。如果二人意見不一致,他們將使用雙透鏡對標(biāo)本重新進行評估,直到最后雙方無異議。染色濃度被分別被評為0分(陰性)、1分(弱)、2分(中等)、和3分(強)。染色范圍分別被評為0分(0%)、1分(1-10%)、2分(11-50%)和3分(51-100%)。染色指數(shù)(Staining index,SI)=染色濃度分?jǐn)?shù)×染色范圍分?jǐn)?shù)。根據(jù)上述評估方法,通過確定正常膀胱上皮和惡性病灶的SI來評估TROP2的表達,得到其SI分別為0、1、2、3、4、6和9分。為了統(tǒng)計評估,當(dāng)腫瘤的最終SI>1分時,本研究認(rèn)為TROP2高表達。

      4、統(tǒng)計學(xué)分析

      用χ2檢驗評估TROP2蛋白的表達和臨床病理參數(shù)之間相的關(guān)系的顯著性。通過Kaplan–Meier方法計算無復(fù)發(fā)生存期曲線和無進展生存期曲線,并通過log-rank檢驗進行比較。無復(fù)發(fā)生存期和無進展生存期各變量的顯著性采用多因素分析的Cox比例風(fēng)險模型分析。用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析。P<0.05,認(rèn)為有顯著差異。

      二、結(jié)果

      1、NMIBC病人TROP2高表達

      為了分析TROP2在膀胱癌和正常膀胱組織間的表達差異,本研究用免疫組化方法檢測了102例膀胱癌患者的石蠟切片和23例正常膀胱組織的石蠟切片。正常膀胱上皮細(xì)胞無染色或弱染色(圖1A)。而在50例(49%)膀胱癌組織中TROP2有高表達(p<0.001)。值得注意的是,TROP2染色主要集中在膀胱癌細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(圖1B-1D)。

      2、TROP2蛋白表達和臨床病理特征的相關(guān)性

      表1NMIBC病人TROP2表達和臨床病理特征之間的相關(guān)性

      如表1所示,TROP2蛋白高表達與腫瘤分級(p=0.001)、分期(p<0.001)、和復(fù)發(fā)(p=0.03)顯著相關(guān)。然而,TROP2的蛋白表達與其他臨床病理特征如年齡、性別、腫瘤大小及數(shù)量等并不相關(guān)。

      3、TROP2在NMIBC預(yù)后中的意義

      表2無復(fù)發(fā)及無進展NMIBC病人單變量分析

      表3無復(fù)發(fā)及無進展NMIBC病人多變量Cox模型分析

      本研究評估了TROP2在預(yù)示NMIBC復(fù)發(fā)中的意義。經(jīng)歷過復(fù)發(fā)的NMIBC病人其TROP2表達比沒有復(fù)發(fā)過的病人樣本要高(p=0.03)。Kaplan–Meier分析發(fā)現(xiàn)膀胱癌中TROP2表達量與無復(fù)發(fā)生存期顯著相關(guān)(p=0.0012)(表2)。log-rank檢驗進一步表明在TROP2表達高的組和表達量低的組,其生存時間有顯著差異,這表明TROP2的高水平表達與較短的生存期密切相關(guān)(圖2)。利用多變量分析中的Cox比例風(fēng)險模型分析包括性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、分級、分期和TROP2之間的相關(guān)性。結(jié)果表明,TROP2的高表達與膀胱癌的復(fù)發(fā)顯著相關(guān),提示TROP2可作為NMIBC病人復(fù)發(fā)的獨立的預(yù)后指標(biāo)(p=0.043)(表3)。

      以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式,應(yīng)當(dāng)指出,對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說,在不脫離本發(fā)明原理的前提下,還可以做出若干改進和潤飾,這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。

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