本發(fā)明屬于寵物疾病臨床診斷領(lǐng)域，具體涉及一種用免疫層析技術(shù)檢測犬NT-proBNP的試紙條及其制備方法。
背景技術(shù)：
：傳統(tǒng)上，人們通過心電圖，放射學及超聲心動監(jiān)查來完成對心臟功能的評估。然而這些檢查不僅相對費時，而且價格昂貴，就超生心動描記檢查而言，它就不可能被所有病人接受。在過去的10年中，心臟生物標志物——主要指腦鈉肽，已經(jīng)成為人類心臟疾病診斷和監(jiān)測的一項主要依據(jù)。進來的獸醫(yī)學研究為這些血液心臟生物標志物在獸醫(yī)臨床犬上的應(yīng)用提供了很好的啟示。N-末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）是BNP激素原（proBNP）分裂后無活性的N端片段，相對于BNP，NT-proBNP具有更長的血漿半衰期。主要在心肌細胞受到容量負荷和壓力負荷增高時由左心室分泌。NT-proBNP在血液中的分泌和存在具有累積作用，試劑存在比BNP的濃度更高，更容易被檢測到，即檢測的敏感度提高。犬血清和血漿中NT-proBNP的測定可作為一種對疑似患充血性心力衰竭個體的診斷和監(jiān)測輕度心臟功能障礙的輔助手段。據(jù)Boswood等報道，NT-proBNP在患有心臟病、心臟衰竭及原發(fā)性呼吸系統(tǒng)疾病的犬之間存在顯著差異?；?10pmol/L的臨界值，NT-proBNP在預(yù)測犬心臟病或心臟衰竭方面，有94%的陽性預(yù)測率和77%的陰性預(yù)測率。這意味著94%的NT-proBNP檢驗陽性犬可能患有心臟病或心里衰竭，同時NT-proBNP陰性犬有77%的可能沒有心臟病或心里衰竭。在Oyama等用119只患有二尖瓣疾病的犬，18只有擴張性心肌病的犬和40只健康對照犬進行的另一項研究中，以445pmol/L為臨界值，血清NT-proBNP檢驗在鑒別心臟病犬和健康犬方面，其陽性預(yù)測率達到了97%，陰性預(yù)測率也達到了61%。另據(jù)報道，NT-proBNP的水平與心率、呼吸率、超聲心動圖心臟大小以及腎功能有關(guān)。此外，采用680pmol/L的臨界值，NT-proBNP可用于鑒別哪些犬患有臨床上顯著的X線檢查心臟擴張、哪些犬沒有。這些研究說明，NT-proBNP檢測能夠結(jié)合其他診斷方法，包括體格檢查，X線和超聲心動圖檢查，用于犬心臟疾病的診斷。在市場上，用于診斷犬類NT-proBNP的試劑非常少，而且大多是酶聯(lián)免疫試劑，這種試劑不穩(wěn)定且檢測效率低，在實際應(yīng)用中還同時存在檢測時間過長、重復性差等缺點。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：現(xiàn)有技術(shù)中用于檢測犬類NT-proBNP的試劑少，且存在不穩(wěn)定、檢測效率低、檢測時間長和重復性差的缺點。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種方便、快捷且高靈敏度的檢測犬NT-proBNP的試紙條和及其制備方法。本發(fā)明提供的一種檢測犬NT-proBNP的試紙條，包括：反應(yīng)膜，其兩端各設(shè)有一連接段，兩連接段中間為檢測段，所述檢測段表面設(shè)有檢測帶，所述檢測帶上噴涂有包被用鼠抗犬NT-proBNP單克隆抗體；樣本墊，其一端設(shè)有連接段，所述樣本墊的連接段覆蓋并固定于所述硝酸纖維素膜的一連接段上，樣本墊上噴涂有標記物，標記物中含有乳膠熒光微球標記的標記用鼠抗犬NT-proBNP單克隆抗體；吸收墊，其一端設(shè)有連接段，所述吸收墊的連接段覆蓋并固定于所述硝酸纖維素膜的另一連接段上，其中，所述檢測帶上噴涂的包被用鼠抗犬NT-proBNP單克隆抗體與所述樣本墊上噴涂的標記用鼠抗犬NT-proBNP單克隆抗體結(jié)合NT-proBNP的不同表位。作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述反應(yīng)膜的檢測段還設(shè)有質(zhì)控帶，所述質(zhì)控帶位于所述檢測段上靠近所述吸收墊的一側(cè)，而檢測帶位于所述檢測段上靠近所述樣本墊的一側(cè)；其中，所述質(zhì)控帶上覆有特異性抗體；所述標記物中還含有乳膠熒光微球標記的與所述特異性抗體結(jié)合的抗原。作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述抗原為兔IgG，所述特異性抗體為羊抗兔IgG。作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述標記物中乳膠熒光微球標記的標記用鼠抗犬NT-proBNP單克隆抗體與乳膠熒光微球標記的所述抗原的體積比為0.5:1~2:1。作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述標記物中乳膠熒光微球標記的標記用鼠抗犬NT-proBNP單克隆抗體與所述乳膠熒光微球標記的兔IgG的體積比為1.5:1。作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述樣本墊為玻璃纖維素膜，所述反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜，所述吸收墊為吸水紙。作為優(yōu)選技術(shù)方案，上述的檢測犬NT-proBNP的試紙條，還包括底板，所述反應(yīng)膜、樣本墊和吸收墊均固定于所述底板上。本發(fā)明提供上述的檢測犬NT-proBNP的試紙條的制備方法，包括如下步驟：1）包被液制備：取包被用鼠抗犬NT-proBNP單克隆抗體加入磷酸鹽緩沖液中，制成檢測帶包被液；取所述特異性抗體加入磷酸鹽緩沖液中，制成質(zhì)控帶包被液；2）反應(yīng)膜的處理：反應(yīng)膜的檢測段上標記檢測帶和質(zhì)控帶，在檢測帶上噴覆檢測帶包被液，在質(zhì)控帶上噴覆質(zhì)控帶包被液，然后干燥；3）樣本墊的預(yù)處理：將樣本墊浸泡于樣本墊處理液中，然后干燥（預(yù)處理能夠降低背景信號，提高有效光信號，同時減小變異。）；4）乳膠熒光微球標記的標記用鼠抗犬NT-proBNP單克隆抗體：乳膠熒光微球的分散液，離心，棄上清液后，用標記緩沖液復溶，并且同時加入碳二亞胺、標記用鼠抗犬NT-proBNP單克隆抗體和N-羥基琥珀酰亞胺，攪拌反應(yīng)，隨后加入賴氨酸，攪拌，然后離心，棄上清液，最后用標記稀釋液復溶；5）乳膠熒光微球標記的所述抗原：取乳膠熒光微球的分散液，離心，棄上清液后用標記緩沖液復溶，并且同時加入碳二亞胺、所述抗原、N-羥基琥珀酰亞胺，攪拌反應(yīng)，隨后加入賴氨酸，攪拌，然后離心，棄上清液，最后用標記稀釋液復溶；6）取步驟4）得到的混合液與步驟5）得到的混合液混合，得到標記物混合液，然后噴覆在步驟3）得到的預(yù)處理后的樣本墊的上表面，干燥；7）步驟6）得到的樣本墊的連接段的下表面覆蓋并且固定于所述反應(yīng)膜的一連接段上，吸收墊的連接段覆蓋并且固定于所述反應(yīng)膜的另一連接段上。作為優(yōu)選技術(shù)方案，步驟3）中所述樣本墊處理液的配方如下：2.5g蔗糖，2g牛血清白蛋白，0.8g氯化鈉，0.8g聚乙烯吡咯烷酮，0.02g氯化鉀，溶于100mL水中。作為優(yōu)選技術(shù)方案，，步驟4）和步驟5）中，所述標記緩沖液的配方為：碳酸鈉4.33g、碳酸氫鈉2.96g，溶于1000mL水中；所述標記稀釋液的配方為：磷酸二氫鈉9.9g、磷酸氫二鈉51.7g、溶于1000mL水中。本發(fā)明提供的檢測犬NT-proBNP的試紙條，操作方便、快捷且靈敏度高。附圖說明圖1：本發(fā)明檢測犬NT-proBNP的干式熒光免疫層析試紙條縱向截面結(jié)構(gòu)示意圖；圖2：本發(fā)明檢測犬NT-proBNP的干式熒光免疫層析試紙條俯視圖；圖3：犬不同NT-proBNP濃度的檢測試紙條在紫外光照射下所拍照片，從左到右依次為0ng/mL、6ng/mL、12ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。具體實施方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。如圖1和圖2所示，本發(fā)明提供的檢測犬NT-proBNP的試紙條，包括：反應(yīng)膜2（硝酸纖維素膜），其兩端各設(shè)有一連接段（如圖所示第一連接段20、第二連接段22），兩連接段中間為檢測段21，檢測段21表面設(shè)有檢測帶5，檢測帶5上噴涂有包被用鼠抗犬NT-proBNP單克隆抗體；樣本墊1（玻璃纖維素膜），其一端設(shè)有連接段10，樣本墊的連接段10覆蓋并固定于反應(yīng)膜的第一連接段20上；樣本墊1上噴涂有標記物8，標記物8中含有乳膠熒光微球標記的標記用鼠抗犬NT-proBNP單克隆抗體，具體在一實施方式中，是在靠近連接段10附近（距連接段2mm，標記物沿反應(yīng)膜長度方向的長度為5mm）噴涂標記物8，乳膠熒光微球標記的標記用鼠抗犬NT-proBNP單克隆抗體。吸收墊3（吸水紙），其一端設(shè)有連接段30，吸收墊的連接段30覆蓋并固定于反應(yīng)膜2的第二連接段22上；底板4，反應(yīng)膜2、樣本墊1和吸收墊3均固定于底板上。在實際應(yīng)用中，反應(yīng)膜的檢測段還設(shè)有質(zhì)控帶7，質(zhì)控帶7位于檢測段21上靠近吸收墊3的一側(cè)，而檢測帶5位于檢測段21上靠近樣本墊1的一側(cè)；其中，質(zhì)控帶7上覆有一特異性抗體層60；乳膠熒光微球?qū)又羞€含有乳膠熒光微球標記的與交聯(lián)特異性抗體結(jié)合的抗原?？紤]到檢測靈敏性，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，抗原為兔IgG，特異性抗體為羊抗兔IgG，樣本墊中乳膠熒光微球標記的標記用鼠抗犬NT-proBNP單克隆抗體與乳膠熒光微球標記的抗原的體積比為0.5:1~2:1。最優(yōu)選地，樣本墊中乳膠熒光微球標記的標記用鼠抗犬NT-proBNP單克隆抗體與乳膠熒光微球標記的兔IgG的體積比為1.5:1?？紤]到，檢測時的層析效果、檢測時的靈敏度以及使用時的方便性，本發(fā)明的試紙條為矩形，其各部件的尺寸設(shè)置如下：樣品墊1，長度為24mm，樣品墊的連接段10長度為3mm;反應(yīng)膜2，長度為25mm，第一連接段20長度為3mm，第二連接段22長度為2mm；檢測帶5距第一連接段20的距離為6mm，質(zhì)控帶7距第一連接段20的距離為12mm，檢測帶5和質(zhì)控帶7垂直于硝酸纖維素膜的長度方向，檢測帶5和質(zhì)控帶7沿反應(yīng)膜的長度方向的寬度為3.8mm；吸收墊3，長度為26mm，吸收墊的連接段長度為2mm；底板4為PVC板，其長度為70mm。樣品墊1、反應(yīng)膜2、吸收墊3和底板4的寬度均為3.8mm。實施例1：檢測犬NT-proBNP的干式熒光免疫層析試紙條的制備包被緩沖液：稱取磷酸二氫鈉0.99g、磷酸氫二鈉5.16g，加純化水定容至1000mL。將包被用鼠抗犬NT-proBNP單克隆抗體用包被緩沖液稀釋至2mg/mL，作為試紙條檢測帶包被液，同時將羊抗兔IgG稀釋至2mg/mL，作為質(zhì)控帶包被液。通過劃膜噴金儀，將檢測帶包被液以0.6μL/cm劃至如圖1和圖2所示的檢測帶處，隨后將質(zhì)控帶包被液以0.6μL/cm劃至如圖1和圖2所示的質(zhì)控帶處，劃好后移入濕度<35%的干燥間進行干燥處理2小時。標記物所需溶液：標記緩沖液（CB溶液）：稱取碳酸鈉4.33g、碳酸氫鈉2.96g，加純化水定容至1000mL。標記稀釋液（LM溶液）：稱取磷酸二氫鈉9.9g、磷酸氫二鈉51.7g，加純化水定容至1000mL。樣本墊處理液：稱取2.5g蔗糖，2g牛血清白蛋白，0.8g氯化鈉，0.8g聚乙烯吡咯烷酮，0.02g氯化鉀，溶于100mL水中。樣本墊的預(yù)處理：將玻璃纖維素膜浸泡于樣本墊處理液中2小時，隨后取出移入濕度<35%的干燥間進行干燥處理8小時備用。進一步的，標記用鼠抗犬NT-proBNP單克隆抗體或兔IgG的氨基端與乳膠熒光微球（羧基乳膠微球）的羧基端交聯(lián)步驟：取濃度為0.01g/mL的乳膠熒光微球10mL（167nm乳膠熒光微球），離心30分鐘，轉(zhuǎn)速為10000r/min，棄上清液后用0.05mol/L的CB溶液10mL復溶，并且同時加入10mg碳二亞胺（EDC）、2mg標記用鼠抗犬NT-proBNP單克隆抗體、10mgN-羥基琥珀酰亞胺（NHS），在室溫下攪拌1小時，隨后加入5mg賴氨酸后室溫下攪拌15分鐘，然后將其在10000r/min的條件下離心15分鐘，棄上清液，最后用0.06mol/L的LM溶液復溶即可。取濃度為0.01g/mL的乳膠熒光微球5mL，離心30分鐘，轉(zhuǎn)速為10000r/min，棄上清液后用0.05mol/L的CB溶液5mL復溶，并且同時加入5mg碳二亞胺（EDC）、1mg兔IgG、5mgN-羥基琥珀酰亞胺（NHS），在室溫下攪拌1小時，隨后加入2.5mg賴氨酸后室溫下攪拌15分鐘，然后將其在10000r/min的條件下離心15分鐘，棄上清液，最后用10mL的0.06mol/L的LM溶液復溶即可。標記完成后將乳膠熒光微球標記的標記用鼠抗犬NT-proBNP單克隆抗體與乳膠熒光微球標記的兔IgG以1.5:1的體積比混合，通過劃膜噴金儀，將混合溶液以15μL/cm噴于玻璃纖維素膜上，噴好后移入濕度<35%的干燥間進行干燥處理2小時。試紙條中間品的組裝：將干燥好的玻璃纖維素膜、硝酸纖維素膜、吸收墊依次貼于PVC底板上，如圖1所示。裁剪：將試紙條中間品按照圖2所示尺寸裁剪成單個試紙條。裝殼：將試紙條裝到塑料卡底殼中，蓋上塑料卡上殼，壓緊，隨后將其裝入鋁箔袋中，并加入獨立包裝的干燥劑后封口即可。定量檢測方法：將試紙條、待測校準品、樣本平衡至室溫（20-25℃），拆開試紙條的鋁箔袋后將其放置在平整的表面上，取50μL校準品/樣本加入試紙條樣本孔（滴加于樣品墊1上，樣本由于毛細滲透作用向上層析，若樣本中含有目的抗原，則會結(jié)合標記物中的抗體一起層析，然后在檢測帶會被固相抗體抓住。從而組成固相抗體-抗原-檢測抗體復合物，就可以判斷結(jié)果），15分鐘后用熒光免疫層析分析儀檢測即可。1、用以上方法繪制標準曲線，結(jié)果如下：表一：不同犬NT-proBNP的濃度所測得的T/C的值（圖片見圖3）單位（ng/mL）0612255010010.030.0850.1750.3240.6241.15820.040.0790.1650.3350.6841.21530.040.0840.1720.3070.5851.13540.050.0950.1680.3580.5981.05850.040.0800.1590.3450.6251.254平均值0.040.08460.16780.33380.62321.1655標準差=0.00710.00630.00620.01950.03810.0871變異系數(shù)=17.68%7.5%3.71%5.85%6.11%7.47%將理論濃度與所測得的T/C值進行四參數(shù)Logistic曲線擬合，方程y=（A-D）/[1+(X/C)B+D]，其中，A=4.73870,B=-1.3161，C=276.67423，D=0.03488，將此曲線錄入熒光免疫層析分析儀中。2、犬NT-proBNP的干式熒光免疫層析試紙條重復性和準確性配制12ng/mL和50ng/mL的犬NT-proBNP的標準品，采用本試紙條進行檢測，各濃度分別檢測10次，分別計算測定均值和標準差。計算變異系數(shù)作為重復性檢測，計算相對偏差作為準確性檢測，結(jié)果如表二：表二，犬NT-proBNP的干式熒光免疫層析試紙條重復性和準確性序號標準值12ng/mL標準值50ng/mL111.5258.37213.7858.89311.0040.17414.9254.68511.4252.95614.2257.38712.6449.61812.9350.47913.5447.451013.0151.60平均值=12.9052.16標準差=1.285.71變異系數(shù)=10%11%相對偏差=7%4%3、臨床比對：選擇30只經(jīng)臨床診斷為健康的犬作為對照組，選擇15只心臟衰竭犬犬作為實驗組，結(jié)果如表三所示。表三，健康犬與心臟衰竭犬的NT-proBNP結(jié)果：從上表中可以看出，30例健康犬的NT-proBNP的測值分布在1.46-7.49ng/mL（平均值為4.45ng/mL），如果將正常范圍定為＜10ng/mL，則15例心臟衰竭犬檢出14例（平均值15.75ng/mL）。由此可以看出本試紙條能夠很好的診斷病變?nèi)?，且具有其他技術(shù)所不具有的檢測效率，即重復性好，檢測所需時間少。實施例2本實施例的檢測犬NT-proBNP的干式熒光免疫層析試紙條的制備方法與實施例1相同，區(qū)別僅在于乳膠熒光微球?qū)又形⑶虻捏w積比例：標記完成后將乳膠熒光微球標記的標記用鼠抗犬NT-proBNP單克隆抗體與乳膠熒光微球標記的兔IgG以0.5:1的體積比混合，通過劃膜噴金儀，將混合溶液以15μL/cm噴于玻璃纖維素膜上，噴好后移入濕度<35%的干燥間進行干燥處理2小時。對本實施例的檢測犬NT-proBNP的干式熒光免疫層析試紙條的重復性和準確性進行檢測，檢測方法同實施例1。結(jié)果如表四：表四序號標準值12ng/mL標準值50ng/mL111.6850.34211.4361.4339.3935.74414.5254.59510.5936.71612.7362.2479.6663.79810.9352.13911.7253.441014.6163.74平均值=11.7353.41標準差=1.7910.33變異系數(shù)=15%19%相對偏差=2%7%實施例3本實施例的檢測犬NT-proBNP的干式熒光免疫層析試紙條的制備方法與實施例1相同，區(qū)別僅在于乳膠熒光微球?qū)又形⑶虻捏w積比例：標記完成后將乳膠熒光微球標記的標記用鼠抗犬NT-proBNP單克隆抗體與乳膠熒光微球標記的兔IgG以2:1的體積比混合，通過劃膜噴金儀，將混合溶液以15μL/cm噴于玻璃纖維素膜上，噴好后移入濕度<35%的干燥間進行干燥處理2小時。對本實施例的檢測犬NT-proBNP的干式熒光免疫層析試紙條的重復性和準確性進行檢測，檢測方法同實施例1。結(jié)果如表五：表五序號標準值12ng/mL標準值50ng/mL110.7350.82213.9539.99311.3846.00411.3059.2759.5552.66610.2450.5779.4448.1689.0838.00914.9455.711010.6435.13平均值=11.1347.63標準差=1.927.85變異系數(shù)=17%16%相對偏差=7%5%以上所述實施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實施例，本發(fā)明的保護范圍不限于此。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護范圍以權(quán)利要求書為準。當前第1頁1 2 3