本發(fā)明屬于新型功能材料與生物傳感檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于納米NiCo₂O₄@AD雙功能催化劑的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

前列腺素E1 (PGE1)，廣泛存在于體內(nèi)的生物活性物質(zhì)，是前列腺素家族中的重要成員，其對多器官系統(tǒng)中細(xì)胞功能有著多樣化及強(qiáng)大的作用。作為一種環(huán)氧合酶的花生四烯酸代謝產(chǎn)物，PGE1與炎前和抗炎作用及骨質(zhì)疏松癥相關(guān)，一些研究發(fā)現(xiàn)PGE1能減少脊髓損傷引起的的壓迫損傷并且其對骨質(zhì)疏松癥治療理有一定的有益效果。PGE1，作為一種有效的血管擴(kuò)張劑，具有擴(kuò)張血管、改善末梢循環(huán)和抑制血小板聚集、防止血栓形成作用，其通過增加心輸出量和降低充盈壓和肺血管阻力對嚴(yán)重心臟衰竭患者具有有益的血流動力學(xué)效應(yīng)。PGE1與血管疾病和肺部疾病密切相關(guān)，它在監(jiān)測和量化人體前列腺素水平中有著關(guān)鍵的作用，因此在臨床研究上，發(fā)展一種快速、簡便、靈敏和低成本的PGE1的檢測方法有著巨大的需求及重要的意義。

電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，利用抗原與抗體之間的特異性結(jié)合的一類生物傳感器，具有靈敏度高、選擇性好、操作簡便、易于小型化、可連續(xù)快速、自動化檢測分析等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明制備了一種基于NiCo₂O₄@AD雙功能催化劑的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，并實(shí)現(xiàn)對前列腺素E1的高靈敏檢測。已有文獻(xiàn)報道有著多種價態(tài)的過渡金屬的氫氧化物或氧化物，如Co₃O₄, NiO, Ni(OH)₂ and NiCo₂O₄，對析氧反應(yīng)過程有一定的催化作用。其中，由于Ni²⁺/Ni³⁺及Co²⁺/Co³⁺氧化還原電對的貢獻(xiàn)，NiCo₂O₄具有更好的電子傳導(dǎo)能力及電化學(xué)活性。本發(fā)明通過將金剛烷修飾到NiCo₂O₄納米片表面進(jìn)而制得雙功能催化劑NiCo₂O₄@AD，由于該復(fù)合物具有大比表面積及良好的生物相容性，可提供更多電活性位點(diǎn)及生物分子固定位點(diǎn)，其修飾電極對析氧反應(yīng)過程展示了優(yōu)異的催化性能并能顯著提高S₂O₈^2?電化學(xué)發(fā)光體系的靈敏度及穩(wěn)定性?；贜iCo₂O₄@AD優(yōu)異的生物相容性及高催化性能，所制得的免疫傳感器具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好、檢測限低等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是基于納米NiCo₂O₄@AD材料，構(gòu)建一種無標(biāo)記，穩(wěn)定性好，靈敏度高的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備。

本發(fā)明的目的之二是將該電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器應(yīng)用于前列腺素E1的高靈敏檢測。

為實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

1.一種基于NiCo₂O₄@AD雙功能催化劑的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法：

（1） 玻碳電極（GCE）首先在鋪有氧化鋁粉末的麂皮上機(jī)械打磨拋光，用二次水洗去表面殘留粉末，再移入超聲水浴中清洗，直至清洗干凈，最后依序用乙醇，稀酸和水徹底洗滌；

（2） 滴加3μL 濃度為 0.5 mg/mL 的NiCo₂O₄@AD懸浮液于干凈的玻碳電極表面，紅外燈下烘干，冷卻至室溫，制得NiCo₂O₄@AD修飾玻碳電極；

（3） 滴加30 μL 濃度為 2.0 wt%的戊二醛溶液于NiCo₂O₄@AD修飾電極表面活化1 h；

（4） 滴加30 μL前列腺素E1抗體（anti-PGE1）溶液于修飾電極表面并在4°C冰箱中孵育40 min，用去離子水洗去物理吸附的anti-PGE1，制得NiCo₂O₄@AD/ anti-PGE1修飾玻碳電極；

（5） 取40μL 濃度為1.0 wt.%的BSA 滴加到修飾電極表面4°C冰箱中孵育1 h，以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，用去離子水沖洗電極表面洗去物理吸附，并保存在4°C冰箱中；

（6） 取30 μL濃度為0.1 fg/ml–1.0 ng/ml的前列腺素E1標(biāo)準(zhǔn)溶液滴于NiCo₂O₄@AD/ anti-PGE1修飾電極表面并在4°C冰箱中孵育40 min，用pH7.5的 PBS緩沖溶液沖洗電極表面，制得一種基于納米NiCo₂O₄@AD雙催化劑的PGE1電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。

2.上述NiCo₂O₄@AD材料的制備：1.0 mL 濃度為1.0 mg/mL 的NiCo₂O₄與1.0 mL 濃度為1.0wt %的3-氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES) 混合振蕩12h，離心收集氨基功能化的NiCo₂O₄產(chǎn)物并重新分散在2.0 mL的去離子水中；然后將（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）（EDC）及N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）活化的1-金剛烷甲酸與氨基功能化的NiCo₂O₄產(chǎn)物混合振蕩2h，制得金剛烷修飾的NiCo₂O₄ (NiCo₂O₄@AD), 離心收集NiCo₂O₄@AD產(chǎn)物并重新分散在2.0 mL的去離子水中。

3.上述NiCo₂O₄材料的制備：用20 mL 乙醇及40 mL 去離子水配制濃度為1 mmol 的 Ni(NO₃)₂·6H₂O溶液, 濃度為2 mmol的Co(NO₃)₂·6H₂O 溶液及濃度為4.5 mmol 的六亞甲基四胺的混合溶液，將混合溶液轉(zhuǎn)移到 100 mL 聚四氟乙烯反應(yīng)釜內(nèi)襯中，90 oC下磁力攪拌24 h后冷卻至室溫，通過離心收集沉淀物并用去離子水及乙醇洗滌數(shù)次，在烘箱中60 oC下烘干12 h，最后，在空氣中350 oC 煅燒2 h 獲得介孔NiCo₂O₄ 納米片。

4.本發(fā)明上述方法制備的一種基于納米NiCo₂O₄@AD雙功能催化劑的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。

5.前列腺素E1的檢測步驟：

（1）使用電化學(xué)工作站采用三電極體系進(jìn)行測定，以上述制備的一種基于納米NiCo₂O₄@AD雙催化劑的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑絲電極為對電極，在0.1mol/ml K₂S₂O₈的pH 8.0的 PBS緩沖溶液中進(jìn)行測試；

（2）采用循環(huán)伏安電壓對不同濃度的前列腺素E1標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，掃描電壓范圍為0.8V–-1.8 V，掃描速率為100 mV/s，通過電致化學(xué)發(fā)光設(shè)備采集電致化學(xué)發(fā)光信號，光電倍增管電壓為900V，通過所得的電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與前列腺素E1標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線；

（3）待測樣品溶液代替前列腺素E1標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，檢測的結(jié)果可通過工作曲線查得。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)為：

(1)由于Ni²⁺/Ni³⁺及Co²⁺/Co³⁺氧化還原電對的貢獻(xiàn)，NiCo₂O₄具有優(yōu)異的電子傳導(dǎo)性及電化學(xué)活性，同時具有大比表面積及介孔結(jié)構(gòu)的NiCo₂O₄納米片可提供更多電活性位點(diǎn)及生物分子固定位點(diǎn)。金剛烷具有大比表面積及較好的供電子能力。本發(fā)明通過將金剛烷修飾到NiCo₂O₄納米片表面制得雙功能催化劑NiCo₂O₄@AD，該復(fù)合物修飾電極對析氧反應(yīng)過程展示了優(yōu)異的催化性能并能顯著提高S₂O₈^2?電化學(xué)發(fā)光體系的靈敏度及穩(wěn)定性，本發(fā)明制備的免疫傳感器具有較高的靈敏度。

(2)NiCo₂O₄@AD具有大比表面積及良好的生物兼容性有利于抗體在電極表面的固定，本發(fā)明制備的免疫傳感器具有較好的穩(wěn)定性。

(3)本發(fā)明利用抗原、抗體的免疫反應(yīng)，提高了檢測方法的特異性。

附圖說明

圖1A為NiCo₂O₄ 納米片的電子發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）圖。

圖1B為NiCo₂O₄ 納米片的透射電子顯微鏡（TEM）圖。

圖1B插圖為NiCo₂O₄ 納米片的高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）圖。

圖2為NiCo₂O₄@AD的紅外光譜（IR）圖。

圖3為免疫傳感電極的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)信號與前列腺素E1標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的線性關(guān)系圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明用下列實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于下列實(shí)施例。

實(shí)施例1

1.一種基于納米NiCo₂O₄@AD雙功能催化劑的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備：

（1） 玻碳電極（GCE）首先在鋪有氧化鋁粉末的麂皮上機(jī)械打磨拋光，用二次水洗去表面殘留粉末，再移入超聲水浴中清洗，直至清洗干凈，最后依序用乙醇，稀酸和水徹底洗滌；

（2） 滴加3μL 濃度為 0.5 mg/mL 的NiCo₂O₄@AD懸浮液于干凈的玻碳電極表面，紅外燈下烘干，冷卻至室溫，制得NiCo₂O₄@AD修飾玻碳電極；

（3） 滴加30 μL 濃度為 2.0wt %的戊二醛溶液于NiCo₂O₄@AD修飾電極表面活化1 h；

（4） 滴加30 μL前列腺素E1抗體（anti-PGE1）溶液于修飾電極表面并在4°C冰箱中孵育40 min，用去離子水洗去物理吸附的anti-PGE1，制得NiCo₂O₄@AD/ anti-PGE1修飾玻碳電極；

（5） 取40μL 濃度為1.0 wt.%的BSA 滴加到修飾電極表面4°C冰箱中孵育1 h，以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，用去離子水沖洗電極表面洗去物理吸附，并保存在4°C冰箱中；

（6） 取30 μL濃度為0.1 fg/ml–1.0 ng/ml的PGE1標(biāo)準(zhǔn)溶液滴于NiCo₂O₄@AD/ anti-PGE1修飾電極表面并在4°C冰箱中孵育40 min，用pH7.5的 PBS緩沖溶液沖洗電極表面，制得一種基于納米NiCo₂O₄@AD雙催化劑的PGE1電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。

實(shí)施例2

NiCo₂O₄材料的制備：

用20 mL 乙醇及40 mL 去離子水配制濃度為1 mmol 的 Ni(NO₃)₂·6H₂O溶液, 濃度為2 mmol 的 Co(NO₃)₂·6H₂O 溶液及濃度為4.5 mmol 的六亞甲基四胺的混合溶液，將混合溶液轉(zhuǎn)移到 100 mL 聚四氟乙烯反應(yīng)釜內(nèi)襯中，90 oC下磁力攪拌24 h后冷卻至室溫，通過離心收集沉淀物并用去離子水及乙醇洗滌數(shù)次，在烘箱中60 oC下烘干12 h，最后，在空氣中350 oC 煅燒2 h 獲得介孔NiCo₂O₄ 納米片。NiCo₂O₄ 納米片的電子發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）圖及透射電子顯微鏡（TEM）圖，如圖1A及圖1B所示，表明NiCo₂O₄納米片是由NiCo₂O₄納米粒子單元相互連接構(gòu)成，形成大量的粒間孔隙，這樣的多孔結(jié)構(gòu)將極大地增加電活性位點(diǎn)。高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）圖，如圖1B中插圖所示，可見清晰的約0.25 nm的晶格條紋，與尖晶石NiCo₂O₄（311）晶面一致。

實(shí)施例3

NiCo₂O₄@AD材料的制備：

1.0 mL 濃度為1.0 mg/mL 的NiCo₂O₄與1.0 mL 濃度為1.0 wt%的3-氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES) 混合振蕩12h，離心收集氨基功能化的NiCo₂O₄產(chǎn)物并重新分散在2.0 mL的去離子水中；然后將（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）（EDC）及N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）活化的1-金剛烷甲酸與氨基功能化的NiCo₂O₄產(chǎn)物混合振蕩2h，制得金剛烷修飾的NiCo₂O₄ (NiCo₂O₄@AD), 離心收集NiCo₂O₄@AD產(chǎn)物并重新分散在2.0 mL的去離子水中。NiCo₂O₄@AD的紅外光譜（IR）圖，如圖2所示，在1666 cm^-1和3185 cm^-1處有吸收峰出現(xiàn)，這是典型的酰胺基團(tuán)中C = O及N-H基團(tuán)的伸縮振動吸收峰，表明了NiCo₂O₄@AD的成功制備。

實(shí)施例4

前列腺素E1的檢測步驟：

（1）使用電化學(xué)工作站采用三電極體系進(jìn)行測定，以所制備的一種基于納米NiCo₂O₄@AD雙催化劑的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑絲電極為對電極，在0.1mol/ml K₂S₂O₈的pH 8.0的 PBS緩沖溶液中進(jìn)行測試；

（2）采用循環(huán)伏安電壓對不同濃度的前列腺素E1標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，掃描電壓范圍為0.8V–-1.8 V，掃描速率為100 mV/s，通過電致化學(xué)發(fā)光設(shè)備采集電致化學(xué)發(fā)光信號，光電倍增管電壓為900V，通過所得的電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與前列腺素E1標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線，圖3為免疫傳感電極的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)信號與前列腺素E1標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的線性關(guān)系圖；

（3）待測樣品溶液代替前列腺素E1標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，檢測的結(jié)果可通過工作曲線查得。