本發(fā)明涉及一種檢測人巨細胞病毒（HCMV）IgG和IgM抗體的ELISA檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

人巨細胞病毒（human cytomegalovirus， HCMV）可通過口腔、生殖道、胎盤、授乳以及輸血或器官移植等多途徑傳播。人群感染HCMV的顯著特點是感染率高，正常成人HCMV抗體陽性率為76.7%－95.8%，我國也是HCMV感染高度流行國家之一。

HCMV初次感染可無明顯癥狀，但病毒從此長期潛伏體內(nèi)。當(dāng)機體免疫功能低下時，潛伏病毒開始復(fù)制并大量增殖，繼發(fā)活動性感染并表現(xiàn)多種臨床癥狀。HCMV感染是導(dǎo)致出生缺陷的重要因素之一，并且有研究顯示HCMV感染與糖尿病、動脈粥樣硬化及一些惡性腫的發(fā)病密切相關(guān)。臨床活動性HCMV感染多見于孕婦，新生兒、輸血患者、惡性腫瘤和艾滋病患者以及器官移植等使用免疫抑制劑的患者。孕婦活動性感染可通過胎盤、產(chǎn)道或授乳傳給胎兒，導(dǎo)致流產(chǎn)，死胎，胎兒形態(tài)畸形，器官功能障礙。先天感染的新生兒出生時可伴有黃疸、瘀斑、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、小頭畸形等，而無癥狀的部分新生兒，隨著發(fā)育才逐漸被發(fā)現(xiàn)聽覺、視力低下，智力發(fā)育遲緩，運動障礙等。在惡性腫瘤、艾滋病、器官移植等免疫功能減弱或受抑制的患者HCMV的活動性感染常并發(fā)間質(zhì)性肺炎、視網(wǎng)膜炎、食管炎、結(jié)腸炎和腦膜腦炎等多器官臟器損害的各種臨床綜合征，是患者致死或移植術(shù)失敗的重要原因。

無論是初次感染還是潛伏病毒的繼發(fā)活動性感染，病毒大量復(fù)制、出現(xiàn)癥狀的早期機體會產(chǎn)生IgM型抗體。IgM相對于IgG的特點是產(chǎn)生早、消失快。所以IgM的檢出代表近期感染、機體可能尚處于病毒大量復(fù)制狀態(tài)。加之IgM的檢測多采用簡便快速價格低廉的ELISA方法，所以盡管存在被檢出的時間段較短，依然是臨床常用的初步判斷感染與否的檢測方法。而目前檢測HCMV IgM的試劑多以HCMV全病毒裂解蛋白作為包被抗原。其抗原成分復(fù)雜且潛在宿主細胞蛋白污染的可能，也潛在結(jié)合皰疹病毒科其他病毒抗體產(chǎn)生假陽性信號的可能，并且試劑的制作過程因需要培養(yǎng)病毒而操作繁瑣。少數(shù)HCMV IgM抗體檢測試劑雖以HCMV的重組蛋白為包被抗原，試劑制作經(jīng)濟簡便，但是試劑的穩(wěn)定性較差，敏感性和特異性也有待提高。所以研制制作過程簡單、費用低廉、敏感性和特異性更好的HCMV IgM抗體檢測試劑依然具有實際意義。

檢測IgG抗體了解人群感染率，對HCMV相關(guān)疾病的預(yù)防、管理控制及相關(guān)政策的制定具有重要意義。而明確個體HCMV已感染狀態(tài)則利于臨床確定個體治療方案，如AIDS及器官移植術(shù)患者，需要檢測HCMV IgG抗體，從而確定是否需要跟蹤其IgM抗體水平，以便及時抗HCMV治療。所以HCMV IgG抗體的檢測雖然只能代表曾感染、體內(nèi)潛伏有HCMV，并非病毒活動性感染的指證，但是仍然具有市場需求。目前市售檢測HCMV IgG抗體的試劑多以HCMV全病毒裂解物作為包被抗原，其抗原成分復(fù)雜且潛在宿主細胞蛋白污染的可能，也潛在結(jié)合皰疹病毒科其他病毒抗體產(chǎn)生假陽性信號的可能，并且試劑的制作過程因需要培養(yǎng)病毒而操作繁瑣。少數(shù)HCMV IgG抗體檢測試劑則以HCMV的重組蛋白為包被抗原，這種試劑制作經(jīng)濟簡便但是試劑的穩(wěn)定性較差，敏感性和特異性也有待提高，而進口的此類試劑價格過高。

綜上所述，需要一種制作過程簡單、費用低廉、敏感性和特異性更好的HCMV IgG和HCMV IgM抗體檢測試劑。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種基于PP65蛋白檢測HCMV IgG和IgM的試劑盒，至少具有特異性、敏感性、穩(wěn)定性更高的特點。

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種基于PP65蛋白檢測HCMV IgG和IgM的試劑盒，包括

——包被有重組HCMV PP65_322-561蛋白抗原的酶標(biāo)板；

——酶標(biāo)二抗，包括用于檢測IgG的HRP-抗人IgG抗體和用于檢測IgM的HRP-抗人IgM抗體。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的包被有重組HCMV PP65_322-561蛋白抗原的酶標(biāo)板的制備方法包括步驟：原核表達并純化HCMV被膜磷蛋白PP65_322-561；包被液稀釋重組PP65_322-561蛋白抗原為10μg/ml，每孔100μl加入酶標(biāo)板中，37℃ 1小時，再4℃包被12~24小時；棄去孔內(nèi)液體，PBST洗后拍干，使用含1%BSA的PBS封閉液每孔100μl， 37℃封閉2h，PBST洗后拍干。

上述試劑盒可用于檢測HCMV IgG抗體和HCMV IgM抗體。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的HRP-抗人IgG抗體選自HRP-羊抗人IgG抗體、HRP-兔抗人IgG抗體、HRP-鼠抗人γ鏈抗體中的一種。所述的HRP-抗人IgM抗體選自HRP-羊抗人IgM抗體、HRP-兔抗人IgM抗體、HRP-鼠抗人μ鏈抗體中的一種。

含HCMV強免疫原性抗原表位的重組蛋白可代替全病毒用于HCMV特異性抗體的檢測。HCMV PP65蛋白是HCMV眾多結(jié)構(gòu)蛋白中可以特異性激發(fā)B 細胞、細胞毒性 T 細胞( CTL)和輔助性 T 細胞( Th) 免疫的主要靶蛋白，不同HCMV病毒株中, HCMV pp65基因高度保守，本發(fā)明所用PP65_332～561片段是富含T細胞表位和B細胞表位的PP65第322到561位氨基酸序列。PP65蛋白是HCMV被膜磷蛋白而非糖基化蛋白，無需真核表達的糖基化和折疊過程，在原核細胞表達就可獲得高免疫活性蛋白片段。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種檢測人巨細胞病毒IgG抗體的方法，采用了上述試劑盒。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述檢測人巨細胞病毒IgG抗體的方法包括步驟：稀釋的待檢血清，于酶標(biāo)板孔內(nèi)加樣37℃孵育，洗板；加酶標(biāo)二抗HRP-抗人IgG抗體37℃孵育，洗板；加底物顯色液，室溫顯色；加終止液，酶標(biāo)儀檢測OD₄₅₀值。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種檢測人巨細胞病毒IgM抗體的方法，采用了上述試劑盒。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的檢測人巨細胞病毒IgM抗體的方法包括步驟：將IgG-RF吸附劑與待測血清混勻，室溫放置；稀釋經(jīng)吸附劑處理過的待測血清，于酶標(biāo)板孔內(nèi)加樣，37℃孵育后PBST洗板，拍干；加酶標(biāo)二抗HRP-抗人IgM抗體 37℃孵育，洗板；加底物顯色液，室溫顯色；加終止液，酶標(biāo)儀檢測OD₄₅₀值。待測血清樣品中針對包被抗原的特異性IgM常常與特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM的測定。同時，類風(fēng)濕因子（RF）也會干擾檢測結(jié)果。因此在血清樣品測定前，須加入IgG-RF吸附劑以消除IgG、RF干擾。本發(fā)明實驗探明將IgG-RF吸附劑與待測血清1:1混勻，室溫放置30 min可去除干擾。

本發(fā)明利用重組PP65_332～561蛋白建立了檢測HCMV IgG抗體和HCMV IgM抗體的間接ELISA檢測方法，證明試劑具有較好的特異性、敏感性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，且試劑制作過程簡單、標(biāo)準(zhǔn)易于控制。上述檢測方法僅獲得中間結(jié)果，該結(jié)果與疾病的診斷或健康狀況無直接必然聯(lián)系。對于IgG檢測方法，陽性僅能說明曾經(jīng)感染過，主要用于流行病學(xué)調(diào)查，以利于疾控部門制定政策參考。對于IgM檢測方法，如果是陽性，還需要結(jié)合其他必要指標(biāo)才能確定是否處于感染狀態(tài)，檢測群體IgM陽性率也常用于人群近期感染現(xiàn)狀的流行病學(xué)調(diào)查。

以廣為應(yīng)用的、業(yè)界認為敏感性和特異性均較好的意大利德賽公司檢測試劑作為相對參考試劑，檢測結(jié)果表明，檢測HCMV IgG抗體與其符合率為95%，檢測HCMV IgM抗體與其符合率為81%，且本發(fā)明的陽性檢出率高于此試劑，敏感性更高。為臨床快速檢測HCMV IgG和HCMV IgM抗體，明確既往感染和潛伏感染提供了一種新選擇，也為人群HCMV感染狀態(tài)的流行病學(xué)調(diào)查和常規(guī)監(jiān)測提供了新的備選方案。

具體實施方式

需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。下面將參考具體實施例來詳細說明本發(fā)明。

實施例1

基于PP65 _322-561蛋白檢測IgG的試劑，包括包被有重組HCMV PP65_322-561蛋白抗原的酶標(biāo)板、HRP-抗人IgG、PBST洗滌液、底物顯色液和終止液。

其中，HCMV PP65_322-561蛋白抗原的酶標(biāo)板的制備方法是原核表達并純化HCMV被膜磷蛋白PP65_322-561；包被液稀釋重組PP65_322-561蛋白抗原為10μg/ml，每孔100μl加入酶標(biāo)板中，37℃ 1小時，再4℃包被12~24小時；棄去孔內(nèi)液體，PBST洗3次，拍干，使用含1%BSA的PBS封閉液每孔100μl， 37℃封閉2h，PBST洗3次，拍干。

PBST洗滌液的配方為：0.15M KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，NaCl 8.0g， KCl 0.2g，0.05％ Tween-20 0.5ml，加蒸餾水至40ml；

底物顯色液是在臨用前由底物液A和底物緩沖液B各一半混合而成。底物液A主要成份是四甲基聯(lián)苯胺（TMB)：TMB 20mg，無水乙醇10ml，加蒸餾水至100ml；底物緩沖液B主要成份是PH5.0的磷酸檸檬酸：0.2M Na₂HPO₄ 25.7ml，0.1M 檸檬酸24.3ml，加蒸餾水至100ml；

終止液主要成份是2M H₂SO₄：蒸餾水178.3ml，逐滴加入98％的濃硫酸21.7ml；

封板膜為與酶標(biāo)板的板面大小一致的透明塑料膜。

以上所述的HRP-抗人IgG抗體選自HRP-羊抗人IgG抗體、HRP-兔抗人IgG抗體、HRP-鼠抗人γ鏈抗體中的一種，但不限于此。

實施例2

基于PP65 _322-561蛋白檢測IgM的試劑盒，包括包被有重組HCMV PP65_322-561蛋白抗原的酶標(biāo)板、HRP-抗人IgM、PBST洗滌液、底物顯色液和終止液。

其中，HCMV PP65_322-561蛋白抗原的酶標(biāo)板的制備方法是原核表達并純化HCMV被膜磷蛋白PP65_322-561；包被液稀釋重組PP65_322-561蛋白抗原為10μg/ml，每孔100μl加入酶標(biāo)板中，37℃ 1小時，再4℃包被12~24小時；棄去孔內(nèi)液體，PBST洗3次，拍干，使用含1%BSA的PBS封閉液每孔100μl， 37℃封閉2h，PBST洗3次，拍干。

PBST洗滌液的配方為：0.15M KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，NaCl 8.0g， KCl 0.2g，0.05％ Tween-20 0.5ml，加蒸餾水至40ml；

底物顯色液是在臨用前由底物液A和底物緩沖液B各一半混合而成。底物液A主要成份是四甲基聯(lián)苯胺（TMB)：TMB 20mg，無水乙醇10ml，加蒸餾水至100ml；底物緩沖液B主要成份是PH5.0的磷酸檸檬酸：0.2M Na₂HPO₄ 25.7ml，0.1M 檸檬酸24.3ml，加蒸餾水至100ml；

終止液主要成份是2M H₂SO₄：蒸餾水178.3ml，逐滴加入98％的濃硫酸21.7ml；

封板膜為與酶標(biāo)板的板面大小一致的透明塑料膜。

以上所述的HRP-抗人IgM抗體選自HRP-羊抗人IgG抗體、HRP-兔抗人IgG抗體、HRP-鼠抗人μ鏈抗體中的一種，但不限于此。

實施例3

人巨細胞病毒IgG抗體的檢測方法，該方法采用實施例1提供的試劑。用封閉液1:400稀釋的待檢血清，于酶標(biāo)板孔內(nèi)加樣，每孔100μl，37℃孵育1h后PBST洗板3次，拍干；加封閉液1:4000稀釋的HRP-羊抗人IgG，每孔100μl，37℃1h，PBST洗板3次；加底物顯色液每孔100μl，室溫顯色15min；加終止液50μl，酶標(biāo)儀檢測OD₄₅₀值。

本實施例與意大利德塞公司HCMV-IgG ELISA試劑分別對100份樣品的檢測結(jié)果見下表。分別檢出89例和86例陽性，陽性率分別為89%和86%。兩種試劑的符合率為95%。

本實施例對HSV-Ⅰ型、HSV-Ⅱ型以及EBV IgG陽性血清的檢測結(jié)果顯示OD₄₅₀均值分別為0.097、0.084、0.101，均小于臨界值0.135，證實無交叉反應(yīng)，排除了自制試劑非特異結(jié)合皰疹病毒科其他病毒抗體的可能。用PP65 McAb對PP65_322-561蛋白片段Western Blot的鑒定結(jié)果也說明自制試劑具有良好的特異性。

本實施例批內(nèi)變異系數(shù)介于2.1%～5.1%，批間變異系數(shù)介于3.4%～6.4%，均小于10%，說明檢測體系穩(wěn)定，穩(wěn)定性和可重復(fù)性良好。

實施例4

人巨細胞病毒IgM抗體的檢測方法，該方法采用實施例2提供的試劑。將IgG-RF吸附劑與待測血清1:1混勻，室溫放置30 min；1:200稀釋經(jīng)吸附劑處理過的待測血清，于酶標(biāo)板孔內(nèi)加樣，每孔100μl，37℃孵育1h后PBST洗板3次，拍干；加封閉液1:2000稀釋的HRP-羊抗人IgM每孔100μl，37℃孵育1h，洗板3次；加底物顯色液每孔100μl，室溫顯色15min；加終止液每孔50μl，酶標(biāo)儀檢測OD₄₅₀值。

在血清樣品測定前，須加入IgG-RF吸附劑以消除IgG、RF干擾。本發(fā)明實驗探明將IgG-RF吸附劑與待測血清1:1混勻，室溫放置30 min可去除干擾。另外，利用β-巰基乙醇解聚IgM多聚體結(jié)構(gòu)的功能，將等量0.2 mol/L的β-巰基乙醇37 ℃處理待測樣品1 h，發(fā)現(xiàn)5份HCMV IgM抗體陽性血清檢測結(jié)果全部轉(zhuǎn)為陰性，而1份僅HCVM IgG抗體陽性的血清無變化，說明本發(fā)明所測抗體為IgM。

本實施例對HSV-Ⅰ型、EBV IgM陽性血清的檢測結(jié)果顯示OD₄₅₀均小于臨界值0.179，證實本發(fā)明與HSV-1型、EBV IgM均無交叉反應(yīng)，特異性良好。

精密度分析結(jié)果顯示：批內(nèi)變異系數(shù)為5.3%～8.3%，批間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)為2.3%～7.9%，均小于10%，說明檢測體系穩(wěn)定，有較好的可重復(fù)性。

本實施例與意大利德塞公司HCMV-IgM ELISA試劑分別對100份臨床疑似HCMV感染血清的檢測結(jié)果見下表。分別檢出58例和51例陽性，陽性率分別為58%和51%，本實施例敏感性高于德賽公司試劑。兩種試劑的符合率為81%。

實施例5

人巨細胞病毒IgG抗體的檢測方法，該方法采用實施例1提供的試劑。用封閉液1:400稀釋的待檢血清，于酶標(biāo)板孔內(nèi)加樣，每孔100μl，37℃孵育1h后PBST洗板3次，拍干；加封閉液1:4000稀釋的HRP-兔抗人IgG，每孔100μl，37℃1h，PBST洗板3次；加底物顯色液每孔100μl，室溫顯色15min；加終止液50μl，酶標(biāo)儀檢測OD₄₅₀值。

實施例6

人巨細胞病毒IgM抗體的檢測方法，該方法采用實施例2提供的試劑。將IgG-RF吸附劑與待測血清1:1混勻，室溫放置30 min；1:200稀釋經(jīng)吸附劑處理過的待測血清，于酶標(biāo)板孔內(nèi)加樣，每孔100μl，37℃孵育1h后PBST洗板3次，拍干；加封閉液1:2000稀釋的HRP-兔抗人IgM每孔100μl，37℃孵育1h，洗板3次；加底物顯色液每孔100μl，室溫顯色15min；加終止液每孔50μl，酶標(biāo)儀檢測OD₄₅₀值。

同上檢測方法，加HRP-鼠抗人γ鏈抗體檢測人巨細胞病毒IgG抗體，加HRP-鼠抗人μ鏈抗體檢測人巨細胞病毒IgM抗體。本發(fā)明要求保護的范圍不限于以上具體實施方式，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，本發(fā)明可以有多種變形和更改，凡在本發(fā)明的構(gòu)思與原則之內(nèi)所作的任何修改、改進和等同替換都應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。