本發(fā)明涉及一種冰結(jié)構(gòu)蛋白的冰晶觀察方法。

背景技術(shù)：

冰結(jié)構(gòu)蛋白(ice structuring proteins,ISPs)，又稱(chēng)為不凍蛋白、抗凍蛋白(antifreeze proteins,AFPs)，是一類(lèi)由某些魚(yú)類(lèi)、昆蟲(chóng)、植物、真菌和細(xì)菌為抵抗外界環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)所產(chǎn)生的多肽，具有阻止冰晶形成、修飾冰晶形態(tài)及抑制重結(jié)晶的能力，它具有一定的熱滯活性，即能夠以非依數(shù)性形式降低溶液的冰點(diǎn)，但對(duì)熔點(diǎn)的影響較小，從而使溶液的冰點(diǎn)與熔點(diǎn)之間出現(xiàn)差值。冰結(jié)構(gòu)蛋白特有的性質(zhì)保證生物在低溫條件下得以生存。2006年，我國(guó)衛(wèi)生部公布冰結(jié)構(gòu)蛋白可作為新型食品添加劑應(yīng)用于冷藏食品中；冰結(jié)構(gòu)蛋白具有吸附冰晶表面改變冰晶形態(tài)的特點(diǎn)，可使冰晶產(chǎn)生各種不同形狀，且大小不一，主要形態(tài)為四邊形、五邊形、六角形、菱形、橢圓形、梭形、棒狀和針狀等。

現(xiàn)有技術(shù)對(duì)冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液冰晶形態(tài)的觀察一般采用生物低溫顯微鏡技術(shù)或改進(jìn)的低溫顯微鏡技術(shù)。低溫顯微鏡是利用液態(tài)乙烷來(lái)快速冷凍蛋白溶液，儀器及其維護(hù)成本高昂，限制了低溫顯微鏡的推廣。改進(jìn)的低溫顯微技術(shù)，是將其冷源系統(tǒng)采用液氮冷卻；或是在顯微鏡上加裝獨(dú)立的溫度控制冷熱臺(tái)裝置；或改進(jìn)普通光學(xué)顯微鏡為控溫載玻片。利用以上技術(shù)觀察冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液的冰晶時(shí)，儀器設(shè)備繁瑣受限，成本高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)中冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液冰晶形態(tài)的觀察只能通過(guò)生物低溫顯微鏡進(jìn)行，設(shè)備繁瑣受限，成本高的問(wèn)題，提出了一種冰結(jié)構(gòu)蛋白的冰晶觀察方法。

本發(fā)明冰結(jié)構(gòu)蛋白的冰晶觀察方法按以下步驟進(jìn)行：

一、樣品的準(zhǔn)備

取冰結(jié)構(gòu)蛋白粉，溶解于水或磷酸鹽緩沖溶液中，配成濃度為10～30mg/mL的冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液，離心處理，用移液槍取30μL上清液置于血球計(jì)數(shù)板上，于-18℃冰箱冷凍20～30min；所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為6.0～8.5，磷酸根濃度為10～150mmol/L。

二、冰晶的觀察

從冰箱中取出冷凍的血球計(jì)數(shù)板，在5～10s內(nèi)轉(zhuǎn)移至于普通光學(xué)顯微鏡下，首先在10×鏡下，調(diào)節(jié)光源，尋找目標(biāo)物，待目標(biāo)物清晰，轉(zhuǎn)40×鏡觀察，拍照；其中，由于冰結(jié)構(gòu)蛋白大多是白色略帶顏色，其溶液是無(wú)色或淺色形成，在觀察冰晶形態(tài)時(shí)，要適當(dāng)調(diào)低光源亮度。

本發(fā)明具備以下有益效果：

1、冰結(jié)構(gòu)蛋白具有吸附冰晶表面改變冰晶形態(tài)的特點(diǎn)，可使冰晶產(chǎn)生各種不同形狀，且大小不一，主要形態(tài)為四邊形、五邊形、六角形、菱形、橢圓形、梭形、棒狀和針狀等；本發(fā)明利用該特點(diǎn)并結(jié)合普通光學(xué)顯微鏡，很好地觀察到了冰結(jié)構(gòu)蛋白的冰晶形態(tài)，方法簡(jiǎn)便，使用普通光學(xué)顯微鏡即可進(jìn)行冰晶觀察，觀察效果好，解決了必須借助于專(zhuān)用儀器設(shè)備如低溫顯微鏡觀察冰晶的難題，克服了儀器設(shè)備昂貴，檢測(cè)方法復(fù)雜的缺點(diǎn)；

2、本發(fā)明方法中采用的血球計(jì)數(shù)板為優(yōu)質(zhì)厚玻璃制成，玻璃載片厚、凹槽深，利用血球計(jì)數(shù)板觀察液體的冰晶形態(tài)，便于室溫下保持冰凍液體的溫度，有利于觀察；

3、氯化鈉和蔗糖是常用的冷凍保護(hù)劑。氯化鈉和蔗糖溶液的冰晶形態(tài)特點(diǎn)是冰晶小、數(shù)量多，而水的冰晶非常大，這些都是常見(jiàn)的冰晶形態(tài)；本發(fā)明觀察時(shí)利用氯化鈉、蔗糖和水進(jìn)行對(duì)照是可以驗(yàn)證冰結(jié)構(gòu)蛋白冰晶的形態(tài)豐富多樣，對(duì)冰晶形態(tài)的修飾作用顯著，同時(shí)也是對(duì)本發(fā)明實(shí)用性和冰晶觀察結(jié)果的驗(yàn)證；

4、冰結(jié)構(gòu)蛋白的抗凍活性特性包括修飾冰晶形態(tài)、數(shù)量及重結(jié)晶形態(tài)，利用本發(fā)明方法可以應(yīng)用普通光學(xué)顯微鏡對(duì)其抗凍活性進(jìn)行鑒定，并且鑒定結(jié)果真實(shí)可靠，準(zhǔn)確性與低溫顯微鏡相同；

5、利用本發(fā)明冰晶觀察方法可以了解液體溶液的固化過(guò)程，在此過(guò)程中冰晶的形成與生長(zhǎng)，冰晶的再結(jié)晶凍結(jié)過(guò)程中冰晶的生長(zhǎng)屬性和生長(zhǎng)機(jī)理，掌握冰晶的形態(tài)與凍結(jié)過(guò)程。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈五邊形或梭形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖2為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈柱形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖3為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈五邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖4為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈四邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖5為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈四邊形的冰晶形態(tài)的另一張40x顯微照片；

圖6為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈三邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖7為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈六棱錐形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖8為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈四邊形或五邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖9為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈六邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖10為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈四邊形或六邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖11為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈六棱錐形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖12為實(shí)施例1水中呈圓形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖13為實(shí)施例1水中呈梭形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖14為實(shí)施例1蔗糖溶液中呈圓形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖15為實(shí)施例1蔗糖溶液中呈圓形的冰晶形態(tài)的另一張40x顯微照片；

圖16為實(shí)施例1NaCl溶液中呈圓形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖17為實(shí)施例1NaCl溶液中呈梭形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖18為實(shí)施例1NaCl溶液中呈梭形的冰晶形態(tài)的另一張40x顯微照片；

圖19為實(shí)施例1寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈水滴形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖20為實(shí)施例1寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈梭形或水滴形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖21為實(shí)施例1寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈梭形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖22為實(shí)施例1寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈圓形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；

圖23為實(shí)施例1寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈棒狀的冰晶形態(tài)40x顯微照片。

具體實(shí)施方式：

本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意合理組合。

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式冰結(jié)構(gòu)蛋白的冰晶觀察方法按以下步驟進(jìn)行：

一、樣品的準(zhǔn)備

取冰結(jié)構(gòu)蛋白粉，溶解于水或磷酸鹽緩沖溶液中，配成濃度為10～30mg/mL的冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液，離心處理，用移液槍取30μL上清液置于血球計(jì)數(shù)板上，于-18℃冰箱冷凍20～30min；

二、冰晶的觀察

從冰箱中取出冷凍的血球計(jì)數(shù)板，在5～10s內(nèi)轉(zhuǎn)移至于普通光學(xué)顯微鏡下，首先在10×鏡下，調(diào)節(jié)光源，尋找目標(biāo)物，待目標(biāo)物清晰，轉(zhuǎn)40×鏡觀察，拍照；其中，由于冰結(jié)構(gòu)蛋白大多是白色略帶顏色，其溶液是無(wú)色或淺色形成，在觀察冰晶形態(tài)時(shí)，要適當(dāng)調(diào)低光源亮度。

本實(shí)施方式具備以下有益效果：

1、冰結(jié)構(gòu)蛋白具有吸附冰晶表面改變冰晶形態(tài)的特點(diǎn)，可使冰晶產(chǎn)生各種不同形狀，且大小不一，主要形態(tài)為四邊形、五邊形、六角形、菱形、橢圓形、梭形、棒狀和針狀等；本實(shí)施方式利用該特點(diǎn)并結(jié)合普通光學(xué)顯微鏡，很好地觀察到了冰結(jié)構(gòu)蛋白的冰晶形態(tài)，方法簡(jiǎn)便，使用普通光學(xué)顯微鏡即可進(jìn)行冰晶觀察，觀察效果好，解決了必須借助于專(zhuān)用儀器設(shè)備如低溫顯微鏡觀察冰晶的難題，克服了儀器設(shè)備昂貴，檢測(cè)方法復(fù)雜的缺點(diǎn)；

2、本實(shí)施方式方法中采用的血球計(jì)數(shù)板為優(yōu)質(zhì)厚玻璃制成，玻璃載片厚、凹槽深，利用血球計(jì)數(shù)板觀察液體的冰晶形態(tài)，便于室溫下保持冰凍液體的溫度，有利于觀察；

3、氯化鈉和蔗糖是常用的冷凍保護(hù)劑。氯化鈉和蔗糖溶液的冰晶形態(tài)特點(diǎn)是冰晶小、數(shù)量多，而水的冰晶非常大，這些都是常見(jiàn)的冰晶形態(tài)；本實(shí)施方式觀察時(shí)利用氯化鈉、蔗糖和水進(jìn)行對(duì)照是可以驗(yàn)證冰結(jié)構(gòu)蛋白冰晶的形態(tài)豐富多樣，對(duì)冰晶形態(tài)的修飾作用顯著，同時(shí)也是對(duì)本實(shí)施方式實(shí)用性和冰晶觀察結(jié)果的驗(yàn)證；

4、冰結(jié)構(gòu)蛋白的抗凍活性特性包括修飾冰晶形態(tài)、數(shù)量及重結(jié)晶形態(tài)，利用本實(shí)施方式方法可以應(yīng)用普通光學(xué)顯微鏡對(duì)其抗凍活性進(jìn)行鑒定，并且鑒定結(jié)果真實(shí)可靠，準(zhǔn)確性與低溫顯微鏡相同；

5、利用本實(shí)施方式冰晶觀察方法可以了解液體溶液的固化過(guò)程，在此過(guò)程中冰晶的形成與生長(zhǎng)，冰晶的再結(jié)晶凍結(jié)過(guò)程中冰晶的生長(zhǎng)屬性和生長(zhǎng)機(jī)理，掌握冰晶的形態(tài)與凍結(jié)過(guò)程。

具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是：步驟一所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為6.0～8.5，磷酸根濃度為10～150mmol/L。其他步驟和參數(shù)與具體實(shí)施方式一相同。

具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一或二不同的是：步驟一所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為6.0～8.5，磷酸根濃度為40mmol/L。其他步驟和參數(shù)與具體實(shí)施方式一或二相同。

具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至三之一不同的是：步驟一所述離心處理時(shí)，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為4000～6000r/min。其他步驟和參數(shù)與具體實(shí)施方式一至三之一相同。

具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至四之一不同的是：步驟一所述離心處理時(shí)，離心時(shí)間為10～15min。其他步驟和參數(shù)與具體實(shí)施方式一至四之一相同。

具體實(shí)施方式六：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至五之一不同的是：步驟一所述取冰結(jié)構(gòu)蛋白粉，溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，配成濃度為30mg/mL的冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液，離心處理，用移液槍取30μL上清液置于血球計(jì)數(shù)板上，于-18℃冰箱冷凍20min。其他步驟和參數(shù)與具體實(shí)施方式一至五之一相同。

實(shí)施例1

本實(shí)施例苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白的冰晶觀察方法按以下步驟進(jìn)行：

一、樣品的準(zhǔn)備

取苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白粉，溶解于水或磷酸鹽緩沖溶液中，配成濃度為30mg/mL的冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液，于4000r/min下離心10min，用移液槍取30μL上清液置于血球計(jì)數(shù)板上，于-18℃冰箱冷凍20min；所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為8.0，磷酸根濃度為40mmol/L；

二、冰晶的觀察

從冰箱中取出冷凍的血球計(jì)數(shù)板，在10s內(nèi)轉(zhuǎn)移至于普通光學(xué)顯微鏡下，首先在10×鏡下，調(diào)節(jié)光源，尋找目標(biāo)物，待目標(biāo)物清晰，轉(zhuǎn)40×鏡觀察，拍照；其中，由于冰結(jié)構(gòu)蛋白大多是白色略帶顏色，其溶液是無(wú)色或淺色形成，在觀察冰晶形態(tài)時(shí)，要適當(dāng)調(diào)低光源亮度。

取水、30mg/mL的NaCl溶液、30mg/mL的蔗糖溶液和30mg/mL的寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液作為對(duì)照，將水、30mg/mL的NaCl溶液、30mg/mL的蔗糖溶液和30mg/mL的寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液分別置于-18℃冰箱冷凍20min；然后置于40×光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照；

本實(shí)施例制備的苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液的冰晶形態(tài)40x顯微照片如圖1～11所示；其中，圖1為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈五邊形或梭形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖2為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈柱形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖3為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈五邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖4為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈四邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖5為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈四邊形的冰晶形態(tài)的另一張40x顯微照片；圖6為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈三邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖7為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈六棱錐形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖8為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈四邊形或五邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖9為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈六邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖10為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈四邊形或六邊形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖11為實(shí)施例1苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈六棱錐形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；由圖1～11可知，苜蓿蛋白溶液的冰晶體積對(duì)比水的冰晶體積要小但是比蔗糖溶液冰晶體積大，但冰晶形態(tài)豐富，部分是與NaCl冰晶相似的柱形冰晶；部分呈梭形、四邊形、五邊形的冰晶形態(tài)、六邊形冰晶和立體的六棱錐形的冰晶；

本實(shí)施例獲得的水的冰晶形態(tài)40x顯微照片如圖12～13所示；其中，圖12為實(shí)施例1水中呈圓形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖13為實(shí)施例1水中呈梭形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；由圖12～13可知，水的冰晶形態(tài)是較大的圓形，排列緊密；

本實(shí)施例獲得的蔗糖溶液的冰晶形態(tài)40x顯微照片如圖14～15所示；其中，圖14為實(shí)施例1蔗糖溶液中呈圓形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖15為實(shí)施例1蔗糖溶液中呈圓形的冰晶形態(tài)的另一張40x顯微照片；由圖14～15可知，蔗糖溶液冰晶的體積對(duì)比水的冰晶體積要很多小，且形態(tài)單一，和水的冰晶形態(tài)相似，多為圓形；

本實(shí)施例獲得的NaCl溶液的冰晶形態(tài)40x顯微照片如圖16～18所示；其中，圖16為實(shí)施例1NaCl溶液中呈圓形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖17為實(shí)施例1NaCl溶液中呈梭形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖18為實(shí)施例1NaCl溶液中呈梭形的冰晶形態(tài)的另一張40x顯微照片；由圖16～18可知，NaCl溶液的冰晶體積較小，數(shù)量較多，但形態(tài)較為單一；

本實(shí)施例獲得的寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶的冰晶形態(tài)40x顯微照片如圖19～23所示；其中，圖19為實(shí)施例1寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈水滴形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖20為實(shí)施例1寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈梭形或水滴形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖21為實(shí)施例1寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈梭形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖22為實(shí)施例1寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈圓形的冰晶形態(tài)40x顯微照片；圖23為實(shí)施例1寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液中呈棒狀的冰晶形態(tài)40x顯微照片。由圖19～23可知，寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液的冰晶形態(tài)大多呈水滴形和圓形，分布均勻，也出現(xiàn)多邊形，短棒形或針形。