本發(fā)明涉及一種非衍生化高效檢測人體血漿中多種氨基酸的液相質(zhì)譜方法，屬于氨基酸檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

胺類物質(zhì)是人體代謝的基礎(chǔ)，其主要代表氨基酸更是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，具有重要的生化活性。二肽是由兩個氨基酸脫水縮合形成的酰胺鍵組成的蛋白質(zhì)片段或物質(zhì)，與營養(yǎng)、荷爾蒙、酵素抑制、調(diào)節(jié)免疫、抗菌、抗病毒、抗氧化有非常緊密關(guān)系。此外，研究表明氨基酸的甲基化、乙酰化產(chǎn)物與人體健康狀況密切相關(guān)，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要特征。因此，實(shí)現(xiàn)胺類物質(zhì)進(jìn)行代謝輪廓分析，對研究人體生理狀態(tài)，疾病進(jìn)程以及療效評價等都具有重要的研究意義。

胺類物質(zhì)極性強(qiáng)，在反相液相色譜中難以保留，離子抑制嚴(yán)重，定量分析困難。目前，常用的定量分析方法是通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)檢測方法(LC-MRM)。這種方法速度快，樣品預(yù)處理簡單。但是由于不同的胺類物質(zhì)極性差異較大，許多胺類物質(zhì)色譜保留能力弱，且在離子化過程中的差異較大，許多胺類在電噴霧離子源中的離子化效率很低，造成其檢測靈敏度差。因此在實(shí)際檢測中，目前一般只能進(jìn)行定性分析，或針對高含量的氨基酸進(jìn)定量分析。為了解決這個問題，有研究者采用衍生化方法來提高離子化效率，從而達(dá)到定量分析的目的，但由于衍生化技術(shù)的操作復(fù)雜、耗時性以及缺乏特異性，無法適用于臨床血樣樣本的高通量分析。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種非衍生化檢測人體血漿中多種氨基酸的液相質(zhì)譜方法。本發(fā)明通過不斷的研究與探索，采用揮發(fā)性離子對試劑，不需要對氨基酸進(jìn)行衍生化就可以對其進(jìn)行直接分析，在本發(fā)明中，在流動相體系中加入離子對試劑，無需對對血液樣品衍生化，就可以達(dá)到較高的檢測靈敏性、特異性，由于樣品前處理簡單，分析時間也很短(20分鐘以內(nèi))，從而可以滿足臨床血樣樣本的高通量分析。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種非衍生化檢測人體血漿中多種氨基酸的液相質(zhì)譜方法，所述多種氨基酸選自天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及賴氨酸中的兩種以上或全部；包括以下步驟：

(1)取人體血漿，用磺基水楊酸進(jìn)行脫蛋白，得到含有多種氨基酸的上清液；

(2)將上述上清液與含揮發(fā)性離子化試劑的內(nèi)標(biāo)溶液混合，采用LC-MS/MS進(jìn)行分析。

進(jìn)一步地，所述步驟(1)具體為：取人體血漿樣品，置于離心管中，加入等體積的質(zhì)量濃度為1％～8％(優(yōu)選6％)的磺基水楊酸的內(nèi)標(biāo)溶液，震蕩混勻，13000rpm下離心5min，取上清液，置于干凈的離心管中，備用。

進(jìn)一步地，所述步驟(2)中，揮發(fā)性離子化試劑選自七氟丁酸、九氟戊酸或全氟庚酸，優(yōu)選全氟庚酸；揮發(fā)性離子化試劑的濃度為1.5～2.5mM；所述內(nèi)標(biāo)溶液是由0.375uM氨基葡萄糖酸溶液和0.25uM S-2氨基乙基半胱氨酸溶液混合而成的(甘氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺以及谷氨酸的內(nèi)標(biāo)物為氨基葡萄糖酸；其余氨基酸的內(nèi)標(biāo)物為S-2氨基乙基半胱氨酸)，二者體積比為0.8～1.2:0.8～1.2；上清液與含揮發(fā)性離子化試劑的內(nèi)標(biāo)溶液的體積比為1:75～85。

所述LC-MS/MS的條件為：

色譜條件：流動相A：1mM全氟庚酸水溶液；流動相B：1mM全氟庚酸乙腈溶液；梯度洗脫；色譜柱：預(yù)柱：Thermo Fisher,3um Hypercarb,4.6mm*50mm,柱溫：40℃；分析柱：Avanced Materials,2.7um HaloC18,2.1mm*100mm，柱溫：65℃；預(yù)柱和分析柱用切換伐(十通閥)連接(在預(yù)柱和分析柱中間加入一個切換伐，目的是將血漿中的雜質(zhì)盡可能的除去，使其不進(jìn)入檢測器，一方面減少對測定的影響，另一方面減少對儀器的污染)；

質(zhì)譜條件：采用正離子電噴霧離子化的多離子反應(yīng)監(jiān)測模式，氣化溫度：300℃；NEB:60psi；噴霧電壓：2100V；去溶劑溫度：350℃。

優(yōu)選的，梯度洗脫條件如表1所示。

表1 梯度洗脫條件

備注：1.7分鐘前從預(yù)柱流出的液體經(jīng)過切換伐進(jìn)入廢液瓶，1.7分鐘時切換伐切換，從預(yù)柱流出的液體進(jìn)入分析柱和質(zhì)譜檢測器分析檢測。

優(yōu)選的，MRM質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

表2 二十種氨基酸及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件條件

優(yōu)選的，一種非衍生化檢測人體血漿中多種氨基酸的液相質(zhì)譜方法，步驟如下：

(1)樣品前處理：向血清樣本中加入等體積的6％磺基水楊酸的內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋震蕩后13000rpm轉(zhuǎn)速離心5分鐘，取上清液10ul，加入800ul 2mM全氟庚酸的內(nèi)標(biāo)溶液，均勻混合，進(jìn)樣分析；

進(jìn)行樣品前處理的有益效果是：通過該處理，有效的分離沉淀蛋白，去除雜質(zhì)，減少干擾，降低基質(zhì)效應(yīng)，同時可以最大程度的保留氨基酸，并加入揮發(fā)性離子化試劑，提高質(zhì)譜檢測的靈敏性；

(2)標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：以0.1N HCL配制各氨基酸儲備液，然后用濃度為5％(單位g/ml)的BSA(牛血清白蛋白)甲醇溶液制備6個梯度(10、50、100、250、500、1000uM)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分裝于1.5mL棕色瓶中，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(3)LC-MS/MS檢測：將待測樣本通過梯度洗脫模式進(jìn)入色譜柱分離后，采用正離子電噴霧離子化的多離子反應(yīng)監(jiān)測模式，對待測物質(zhì)進(jìn)行定性(以各種氨基酸的離子對及相對保留時間作為定性依據(jù))與定量檢測(以標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線定量)。

進(jìn)一步地，進(jìn)行定量檢測時，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積比值為Y軸，進(jìn)行線性回歸分析得回歸方程，將相應(yīng)維生素峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，分別計算血清樣品中氨基酸的濃度。

本發(fā)明還提供了一種非衍生化檢測人體血漿中多種氨基酸的檢測試劑盒，具有不同梯度濃度的各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度為1％～8％的磺基水楊酸的內(nèi)標(biāo)溶液，含揮發(fā)性離子化試劑的內(nèi)標(biāo)溶液；所述揮發(fā)性離子化試劑選自七氟丁酸、九氟戊酸或全氟庚酸，揮發(fā)性離子化試劑的濃度為1.5～2.5mM；所述內(nèi)標(biāo)溶液是由0.375uM氨基葡萄糖酸溶液和0.25uM S-2氨基乙基半胱氨酸溶液混合而成的，二者體積比為0.8～1.2:0.8～1.2；1mM全氟庚酸水溶液，1mM全氟庚酸乙腈溶液。

傳統(tǒng)的氨基酸含量檢測方法有很多缺點(diǎn)，為了在色譜柱上得到理想的保留行為以及提高檢測靈敏性，通常需要進(jìn)行樣本的柱前或柱后衍生化，不但操作過程繁瑣，費(fèi)時費(fèi)力，而且操作誤差較大，影響實(shí)驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明通過在流動相體系中加入揮發(fā)性離子化試劑(用以提高氨基酸在MS中的離子化程度，實(shí)現(xiàn)多種非衍生化氨基酸的準(zhǔn)確定量)，建立了一種快速、靈敏、便捷的非衍生化血液樣品中多種氨基酸測定方法，特別是同時測定血清中天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及賴氨酸的方法。采用本發(fā)明可以同時檢測人血清中20種基本氨基酸的含量，并進(jìn)行精確的定性和定量分析，是一種樣本處理簡單、快速、通量高、結(jié)果可靠的檢測方法。

天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及賴氨酸是人體內(nèi)重要的氨基酸，任何一種氨基酸的缺乏或升高都會導(dǎo)致相應(yīng)的疾病。本發(fā)明可以同時檢測這二十種氨基酸，一是降低了檢測成本，二是節(jié)省時間，三是減少采集被檢測人的血量，四是可以對一些相關(guān)臨床疾病診斷提供依據(jù)。

本發(fā)明的方法，在樣品及流動相體系中加入揮發(fā)性離子化試劑樣品，分析時間短，提高了分析的效率，離子化試劑取代以往的衍生化反應(yīng)，不僅操作簡單，而且提高了實(shí)驗結(jié)果的準(zhǔn)確性(因為避免了衍生化反應(yīng)中的人為誤差)。本發(fā)明采用LC-MS/MS檢測人體血漿中二十種氨基酸，特異性強(qiáng)，靈敏性高，通量高，操作簡單，樣品處理簡單，檢測時間短，尤其適合臨床普及應(yīng)用。

附圖說明

圖1：血漿樣品1的色譜圖。

圖2：血漿樣品2的色譜圖。

圖3：丙氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。

圖4：精氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。

圖5：天冬酰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。

圖6：天冬氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。

圖7：胱氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。

圖8：谷氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。

圖9：谷氨酰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。

圖10：甘氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。

圖11：組氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。

圖12：異亮氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。

圖13：亮氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。

圖14：賴氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。

圖15：蛋氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。

圖16：苯丙氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。

圖17：脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。

圖18：絲氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。

圖19：蘇氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。

圖20：色氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。

圖21：酪氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。

圖22：纈氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

下述實(shí)施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實(shí)驗方法，檢測方法等。

實(shí)施例1非衍生化檢測人體血漿中二十種氨基酸的液相質(zhì)譜方法

步驟如下：

(1)制備待測樣本：向血清樣本中加入等體積的6％磺基水楊酸的內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋震蕩后13000rpm轉(zhuǎn)速離心5分鐘，取上清液10ul，加入800ul 2mM全氟庚酸的內(nèi)標(biāo)溶液，均勻混合；所述內(nèi)標(biāo)溶液是由0.375uM氨基葡萄糖酸溶液和0.25uM S-2氨基乙基半胱氨酸溶液混合而成的，二者體積比為1:1。本實(shí)施例制備了樣品1、樣品2兩份樣品。

(2)LC-MS/MS檢測：待測樣本通過梯度洗脫模式進(jìn)入色譜柱分離，液相色譜條件如下：

色譜柱：預(yù)柱：Thermo Fisher,3um Hypercarb,4.6mm*50mm,柱溫：40℃；分析柱：Avanced Materials,2.7um HaloC18,2.1mm*100mm，柱溫：65℃；預(yù)柱和分析柱用切換伐(十通閥)連接。

進(jìn)樣體積：5ul；

流速：0.30-0.35ml/min；

流動相A：1mM全氟庚酸水溶液；

流動相B：1mM全氟庚酸乙腈溶液；

梯度洗脫條件如表1所示。

質(zhì)譜檢測條件如表2所示。

(3)計算結(jié)果：

標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：以0.1N HCL配制各氨基酸儲備液，然后用濃度為5％(單位g/ml)的BSA(牛血清白蛋白)甲醇溶液制備6個梯度(10、50、100、250、500、1000uM)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分裝于1.5mL棕色瓶中，-20℃保存?zhèn)溆?，?biāo)準(zhǔn)品參與樣品處理。

應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為Y軸；進(jìn)行線性回歸分析得回歸方程。將相應(yīng)氨基酸峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，分別計算血清樣品中二十種氨基酸的濃度，結(jié)果如表3所示。

用本發(fā)明方法測定二十種氨基酸10～1000uM的標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖3～22所示)，人血樣中的氨基酸含量在此范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，檢測色譜圖見圖1、2，通過方程可知該樣本各氨基酸含量，如表3(附保留時間)。

表3 人體血樣中二十種氨基酸檢測結(jié)果