本發(fā)明涉及維生素檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種同時(shí)檢測(cè)血液中維生素A和25-羥基維生素D的方法。
背景技術(shù)：
：維生素A(VA)是脂溶性的醇類(lèi)物質(zhì)，有多種分子形式，是最早被發(fā)現(xiàn)的維生素，其中維生素A1(VA1)主要存在于動(dòng)物肝臟、血液和眼球的視網(wǎng)膜中，又叫視黃醇，熔點(diǎn)64℃，分子式C20H30O，見(jiàn)化學(xué)結(jié)構(gòu)式(1)；維生素A2(VA2)主要在淡水魚(yú)中存在，熔點(diǎn)只有17～19℃，分子式C20H28O，又稱(chēng)視黃醛。維生素A是構(gòu)成視覺(jué)細(xì)胞中感受弱光的視紫紅質(zhì)的組成成分，人體缺乏維生素A，影響暗適應(yīng)能力，如兒童發(fā)育不良、皮膚干燥、干眼病、夜盲癥，老年斑等。維生素D(vitaminD，簡(jiǎn)稱(chēng)VD)為固醇類(lèi)衍生物，具抗佝僂病作用，又稱(chēng)抗佝僂病維生素。目前認(rèn)為VD也是一種類(lèi)固醇激素。VD均為不同的維生素D原(動(dòng)物皮下的7-脫氫膽固醇，酵母細(xì)胞中的麥角固醇都是維生素D原)經(jīng)紫外照射后的衍生物。VD家族成員中最重要的成員也是對(duì)健康關(guān)系較密切的D2(麥角鈣化醇)和VD3(膽鈣化醇)。它們有以下三點(diǎn)特性：它存在于部分天然食物中；人體皮下儲(chǔ)存有從膽固醇生成的7-脫氫膽固醇，受紫外線的照射后，可轉(zhuǎn)變?yōu)閂D3。適當(dāng)?shù)娜展庠∽阋詽M足人體對(duì)VD的需要，從食物中得來(lái)的VD，與脂肪一起吸收，吸收部位主要在空腸與回腸，膽汁幫助其吸收。吸收的VD與乳糜微粒相結(jié)合，由淋巴系統(tǒng)運(yùn)輸，但也可與VD運(yùn)輸?shù)鞍?α-球蛋白部分)相結(jié)合在血漿中運(yùn)輸，有些與β-脂蛋白相結(jié)合，當(dāng)VD運(yùn)到肝臟中，在微粒體中經(jīng)單氧酶系統(tǒng)作用，將其25位羥基化形成25-羥基維生素D(25-hydroxyvitaminD，簡(jiǎn)稱(chēng)25-(OH)VD)，肝外的其他組織也可吸取VD及25-(OH)VD，因此組織中VD及25-(OH)VD及其總量比血漿中多。血漿中25-(OH)VD3在注射后1～3天達(dá)到高峰，其濃度可達(dá)到20～40ng/ml，最高可達(dá)80ng/ml。濃度與攝入量有一定的關(guān)系，小于4ng/ml，臨床上可發(fā)生佝僂病及骨質(zhì)軟化。25-OH-VD3的經(jīng)驗(yàn)分子式(希爾表示法)是C27H44O2，分子量400.64，見(jiàn)化學(xué)結(jié)構(gòu)式(2)。25-OH-VD2的經(jīng)驗(yàn)分子式(希爾表示法)是C28H44O2，分子量412.65，見(jiàn)化學(xué)結(jié)構(gòu)式(3)。目前，測(cè)定維生素的方法包括分光光度法、層析法、氣相色譜法、高效液相色譜法和液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法等，其中，液相色譜法為測(cè)定維生素的首選方法。現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)維生素的檢測(cè)多采用高效液相色譜(HPLC)分離后與多波長(zhǎng)吸收或聯(lián)合吸收或熒光吸收相結(jié)合的檢測(cè)方法，現(xiàn)有色譜方法或液相質(zhì)譜檢測(cè)方法存在特異性差、樣品處理復(fù)雜導(dǎo)致樣本處理期間維生素含量的變化、分析時(shí)間長(zhǎng)，方法特異性差，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題，且用液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)血液中維生素A和25-羥基維生素D文獻(xiàn)很少。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種同時(shí)檢測(cè)血液中維生素A和25-羥基維生素D的方法，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定血液中維生素A和25-羥基維生素D，該方法特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度和靈敏度高、分析時(shí)間短。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種同時(shí)檢測(cè)血液中維生素A(視黃醇)和25-羥基維生素D的方法，包括如下步驟：(一)將全血樣本離心，取上清液得血清或血漿，備用；(二)標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定：三個(gè)以上濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液200ul分別和10ul混合內(nèi)標(biāo)工作液渦旋混勻，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液；所述標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液在檢測(cè)前必須進(jìn)行紫外分光光度計(jì)重新標(biāo)定維生素A(視黃醇)的準(zhǔn)確濃度；所述標(biāo)準(zhǔn)品為視黃醇、25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3，所述混合內(nèi)標(biāo)工作液為維生素A同位素內(nèi)標(biāo)和25-羥基維生素D同位素內(nèi)標(biāo)的混合液；(三)樣品前處理：(1)精密移取步驟(二)中所述混合內(nèi)標(biāo)工作液加入到步驟(一)中所述血清或血漿中，渦旋混勻；(2)再加入純水或甲酸水稀釋后加入乙醇、甲醇或乙腈溶液，渦旋混勻后高速離心；(3)再加入正己烷萃取，渦旋混勻后離心；(4)然后取上清液后常溫N2吹干；(5)加復(fù)溶液，渦旋混勻，超聲，高速離心后取上清液樣品待測(cè)；(四)取步驟(三)中處理后的待測(cè)上清液樣品80μL放入自動(dòng)進(jìn)樣瓶中經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行分析，同時(shí)定量檢測(cè)血液中維生素A和25-羥基維生素D的含量；液相色譜條件：色譜柱：ZORBAXXDBC82.1*50mm5μm；等度或梯度洗脫：流動(dòng)相為甲醇和水，甲醇和水均含體積比為0.1％甲酸分析時(shí)間：4min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μl；流速:0.35ml/min；串聯(lián)質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源ESI或大氣壓化學(xué)離子源APCI，正離子模式，選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，霧化氣溫度：350℃；霧化氣氣流：6L/min；霧化氣壓：35psi；毛細(xì)管電壓：4500v；DeltaEMV(+):300。本發(fā)明所述的同時(shí)檢測(cè)血液中維生素A(視黃醇)和25-羥基維生素D的方法，其中，步驟(二)中25-羥基維生素D包括25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3，所述視黃醇、25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3的同位素內(nèi)標(biāo)分別為[2H3]視黃醇、[2H3]25-OH-VD2和[2H6]25-OH-VD3。本發(fā)明所述的同時(shí)檢測(cè)血液中維生素A(視黃醇)和25-羥基維生素D的方法，其中，步驟(三)中所述血清、乙醇和正己烷的體積比為1：1：6。本發(fā)明所述的同時(shí)檢測(cè)血液中維生素A(視黃醇)和25-羥基維生素D的方法，其中，步驟(二)中標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定，包括以下步驟：(1)維生素A的標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備：制備濃度分別為0.014mg/L、0.028mg/L、0.056mg/L、0.113mg/L、0.225mg/L、0.45mg/L和0.90mg/L的維生素A標(biāo)準(zhǔn)工作液；(2)25-羥基維生素D的標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備：25-OH-VD2的濃度分別為1.5ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml，160ng/ml和320ng/ml；25-OH-VD3的濃度分別為1.5ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml，160ng/ml和320ng/ml；(3)混合內(nèi)標(biāo)工作液的配制：制備含有400ng/ml的[2H3]視黃醇、73.5ng/ml的[2H3]25-OH-VD2和108.5ng/ml的[2H6]25-OH-VD3混合內(nèi)標(biāo)工作液。本發(fā)明所述的同時(shí)檢測(cè)血液中維生素A(視黃醇)和25-羥基維生素D的方法，其中，步驟(四)中所述流動(dòng)相中甲醇和水的體積比為87：13。本發(fā)明所述的同時(shí)檢測(cè)血液中維生素A(視黃醇)和25-羥基維生素D的方法，其中，步驟(5)中所述復(fù)溶液為甲醇、乙醇或乙腈。本發(fā)明所述的同時(shí)檢測(cè)血液中維生素A(視黃醇)和25-羥基維生素D的方法，其中，步驟(一)中離心速度為3500-4000r/min，離心時(shí)間為10-15min。本發(fā)明所述的同時(shí)檢測(cè)血液中維生素A(視黃醇)和25-羥基維生素D的方法，特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度和靈敏度高、前處理過(guò)程簡(jiǎn)單且儀器分析時(shí)間短，為臨床上診斷血液中維生素A和維生素D的缺乏或過(guò)量提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為干眼病、兒童反復(fù)呼吸道感染、佝僂病、產(chǎn)前診斷及優(yōu)生優(yōu)育等提供了可靠的臨床數(shù)據(jù)。本發(fā)明所述的同時(shí)檢測(cè)血液中維生素A(視黃醇)和25-羥基維生素D的方法能夠大幅度提高加樣回收率，從而大大提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，消除系統(tǒng)誤差；以同位素內(nèi)標(biāo)為內(nèi)標(biāo)，使得目標(biāo)化合物的識(shí)別更為準(zhǔn)確，特異性高，定量結(jié)果準(zhǔn)確。附圖說(shuō)明圖1為維生素A(視黃醇)及其同位素內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖；圖2為維生素A(視黃醇)及其同位素內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖；圖3為維生素A(視黃醇)及其同位素內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜圖；圖4為25-羥基維生素D及其同位素內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖；圖5為25-羥基維生素D及其同位素內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖；圖6為25-羥基維生素D及其同位素內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜圖；圖7為血清樣本中維生素A(視黃醇)、25-羥基維生素D及其同位素內(nèi)標(biāo)的總離子流圖；圖8為血清樣本中維生素A(視黃醇)、25-羥基維生素D及其同位素內(nèi)標(biāo)的色譜圖；圖9為血清樣本中維生素A(視黃醇)、25-羥基維生素D及其同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜圖。下面將結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。具體實(shí)施方式一種同時(shí)檢測(cè)血液中維生素A和25-羥基維生素D的方法，包括以下步驟：(一)將全血樣本離心，離心速度為3500r/min，離心時(shí)間為10min，取上清液得血清，所述血清置于4℃-8℃冷藏避光條件下保存(24h內(nèi))至分析前備用，或置于-20℃冷凍避光條件下(避免反復(fù)凍融)保存(72h內(nèi))至分析前備用，或置于-80℃冷凍避光條件下(避免反復(fù)凍融)保存(30天內(nèi))至分析前備用；(二)標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定七種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液200ul分別和10ul混合內(nèi)標(biāo)工作液以1500r/min渦旋混勻30s，充分混勻，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液；所述標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液在檢測(cè)前必須進(jìn)行紫外分光光度計(jì)重新標(biāo)定維生素A(視黃醇)的準(zhǔn)確濃度；所述標(biāo)準(zhǔn)品為視黃醇、25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3，所述混合內(nèi)標(biāo)工作液為維生素A同位素內(nèi)標(biāo)和25-羥基維生素D同位素內(nèi)標(biāo)的混合液，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液經(jīng)液相色譜法分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(1)維生素A(視黃醇)的標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備：a.維生素A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：精確稱(chēng)取視黃醇標(biāo)準(zhǔn)品10mg，置于10ml容量瓶，用乙醇溶解，并定容于10ml，得到維生素A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-80℃避光(避免反復(fù)凍融)條件下保存，有效期3個(gè)月。b.維生素A標(biāo)準(zhǔn)校正液的配制：移取維生素A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液20μL，置于5ml容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，混勻，用紫外分光光度計(jì)重新標(biāo)定其濃度，在325nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)比吸光系數(shù)，按照公式(1)和(2)計(jì)算出維生素A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的實(shí)際濃度，維生素A的1％比吸光系數(shù)為1835。避光操作。采用以下公式(1)(2)計(jì)算：稀釋倍數(shù)＝10000*5ml/20μl………………………(2)式中：CX—待標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)溶液的實(shí)際濃度值；g/100mLA—給定波長(zhǎng)處測(cè)定的待標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度平均值；E—待標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的1％比吸光系數(shù)。c.維生素A標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：將維生素A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋得到的濃度為1.8mg/L的溶液用乙醇等比稀釋?zhuān)玫綕舛确謩e為0.014mg/L、0.028mg/L、0.056mg/L、0.113mg/L、0.225mg/L、0.45mg/L和0.90mg/L的維生素A標(biāo)準(zhǔn)工作液，-80℃避光(避免反復(fù)凍融)條件下保存，有效期3個(gè)月。(2)25-羥基維生素D的標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備表125-羥基維生素D的標(biāo)準(zhǔn)品列表分別精密量取25-OH-VD2和25-OH-VD3標(biāo)準(zhǔn)品溶液100μl，標(biāo)準(zhǔn)品見(jiàn)表1，并分別用甲醇-水(V:V＝70:30)溶液稀釋至1.0ml，分別作為25-OH-VD2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和25-OH-VD3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，同時(shí)將25-OH-VD2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和25-OH-VD3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液混合稀釋得到25-羥基維生素D的標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中，25-OH-VD2的濃度分別為1.5ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml，160ng/ml和320ng/ml；25-OH-VD3的濃度分別為1.5ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml，160ng/ml和320ng/ml，備用。(3)混合內(nèi)標(biāo)工作液的配制a.維生素A(視黃醇)同位素內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：精確稱(chēng)取維生素A同位素內(nèi)標(biāo)[2H3]視黃醇2mg，置于10ml容量瓶，用乙醇溶解，并定容于10ml，得到維生素A同位素內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(濃度為200ug/ml)，-80℃避光(避免反復(fù)凍融)條件下保存，有效期3個(gè)月。b.5-羥基維生素D同位素內(nèi)標(biāo)的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：表225-羥基維生素D同位素內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)品列表精密量取25-羥基維生素D2同位素內(nèi)標(biāo)[2H3]25-OH-VD2的標(biāo)準(zhǔn)品溶液50μl，標(biāo)準(zhǔn)品見(jiàn)表2，用甲醇-水(V:V＝70:30)溶液稀釋至1.0ml，作為[2H3]25-OH-VD2的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(濃度為4.9ug/mL)。精密稱(chēng)量25-羥基維生素D3同位素內(nèi)標(biāo)[2H6]25-OH-VD3的標(biāo)準(zhǔn)品0.5mg，用甲醇-水(V:V＝70:30)溶液溶解并稀釋至10ml，從該溶液中精密量取220μl，用甲醇-水(V:V＝70:30)溶液稀釋至5ml，作為[2H6]25-OH-VD3的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(濃度為2.17ug/mL)。c.維生素A同位素內(nèi)標(biāo)和25-羥基維生素D同位素內(nèi)標(biāo)的混合內(nèi)標(biāo)工作液的配制：精密量取[2H3]視黃醇的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5ul，加入甲醇-水(V:V＝70:30)溶液稀釋至500ul得到濃度為2000ng/ml的[2H3]視黃醇溶液。精密量取400ul濃度為2000ng/ml的[2H3]視黃醇溶液、30ul[2H3]25-OH-VD2的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和100ul[2H6]25-OH-VD3的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液混合后加入甲醇-水(V:V＝70:30)溶液稀釋?zhuān)謩e得到含有濃度為400ng/ml的[2H3]視黃醇、73.5ng/ml的[2H3]25-OH-VD2和108.5ng/ml的[2H6]25-OH-VD3的混合內(nèi)標(biāo)工作溶液。-80℃避光(避免反復(fù)凍融)條件下保存，有效期3個(gè)月。(三)樣品前處理(1)精密移取10ul混合內(nèi)標(biāo)工作液于2ml離心管中，加入200ul步驟(1)中所述血清，1500r/min渦旋混勻30秒；(2)再加入200ul乙醇于上述離心管中，2000r/min渦旋混勻3min，去除蛋白；(3)再加入1200ul正己烷，2500r/min渦旋混勻5min，以達(dá)到充分萃取的目的，然后12000r/min高速離心10min；(4)然后移取1000μl上清液到2ml離心管中，常溫下氮?dú)饩徛蹈桑?5)加入100μl復(fù)溶液，所述復(fù)溶液為甲醇、乙醇或乙腈，2000r/min渦旋混勻1min，超聲1min，12000r/min高速離心3min，得到處理后取上清液待測(cè)；(四)取步驟(2)中處理后的上清液80μL放入自動(dòng)進(jìn)樣瓶中經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行分析，同時(shí)定量檢測(cè)血液中維生素A(視黃醇)和25-羥基維生素D(25-羥基維生素D2、25-羥基維生素D3)，所述液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定條件如下：色譜柱：ZORBAXXDBC82.1*50mm5μm；等度洗脫：流動(dòng)相87v％甲醇-13v％水，甲醇和水均含體積比為0.1v％的甲酸；分析時(shí)間：4min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μl；流速:0.35ml/min；質(zhì)譜參數(shù)(或LC檢測(cè)波長(zhǎng))：采用電噴霧離子源ESI或大氣壓化學(xué)離子源APCI，正離子模式，選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，霧化氣溫度：350℃；霧化氣氣流：6L/min；霧化氣壓：35psi；毛細(xì)管電壓：4500v；DeltaEMV(+):300。本實(shí)施例中技術(shù)方法論證如下：一、該方法的線性關(guān)系將上述配制的200μl的各個(gè)濃度的維生素A標(biāo)準(zhǔn)工作液和25-羥基維生素D標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行混合，再加10μl混合內(nèi)標(biāo)工作液，混勻30s，加入80μl復(fù)溶液，混勻進(jìn)樣20μl，按本實(shí)施例測(cè)定條件濃度由低到高進(jìn)行測(cè)定，以定量離子峰面積一濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明維生素A、25-OH-VD2和25-OH-VD3的線性范圍如下：維生素A在0.1mg/L到4.0mg/L范圍內(nèi)，線性良好，相關(guān)系數(shù)R2﹥0.995；25-OH-VD2在1.4ng/mL到340.0ng/mL范圍內(nèi)，線性良好，相關(guān)系數(shù)R2﹥0.995；25-OH-VD3在1.4ng/mL到340.0ng/mL范圍內(nèi)，線性良好，相關(guān)系數(shù)R2﹥0.995。二、該方法的回收率和精密度分別取維生素A和維生素D標(biāo)準(zhǔn)工作液配制成高、中、低3種濃度進(jìn)行加樣回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，按本實(shí)施例方法進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)分析測(cè)定6批次，維生素A和維生素D的回收率和精密度分別如表3和表4，維生素D為25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3。由表3可見(jiàn)，維生素A：低、中、高三個(gè)濃度的加樣回收率均在90％-95％之間；由表4可見(jiàn)，25-OH-VD：低、中、高三個(gè)濃度的加樣回收率均在90％-105％之間，大幅度提高了加樣回收率，從而大大提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，消除系統(tǒng)誤差。表3.維生素A加樣回收率和精密度加標(biāo)樣本濃度0.60mg/L2.38mg/L4.76mg/L平均回收率92.1％94.0％90.3％精密度RSD1.02％2.74％4.35％表4.25-OH-VD加樣回收率維生素A(視黃醇)及其同位素內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖、色譜圖和質(zhì)譜圖分別如圖1、圖2和圖3所示，維生素A的標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間為1.77min(見(jiàn)圖2)；25-羥基維生素D及其同位素內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖、色譜圖和質(zhì)譜圖分別如圖4、圖5和圖6所示，25-OH-VD2和25-OH-VD3的標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間分別為1.71min和1.67min(見(jiàn)圖5)；血清樣本中維生素A(視黃醇)、25-羥基維生素D及其同位素內(nèi)標(biāo)的總離子流圖、色譜圖和質(zhì)譜圖分別如圖7、圖8和圖9所示。由圖1-圖9可見(jiàn)，血清樣本中的維生素A、25-OH-VD2和25-OH-VD3的保留時(shí)間和相對(duì)豐度均與其標(biāo)準(zhǔn)工作溶液一致，該方法的特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度和靈敏度高，以同位素內(nèi)標(biāo)為內(nèi)標(biāo)，使得目標(biāo)化合物的識(shí)別更為準(zhǔn)確，特異性高，定量結(jié)果準(zhǔn)確。以上所述的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)確定的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3