本發(fā)明涉及一種電化學發(fā)光分析檢測技術領域，更具體地說是一種以適合于電化學發(fā)光分析的三維紙基轉化器的制備。

背景技術：

正常細胞在致癌因素作用下，細胞內基因會發(fā)生改變，細胞的生長調控也因此發(fā)生改變，進而會導致單克隆性異常增生，引起正常細胞的癌變。近幾年來，癌癥發(fā)病率以及死亡率日增不減，人們對其充滿著恐懼與擔憂，因此，癌癥的早期預警成為科研工作者的重大研究目標。

腫瘤標志物，是一類反應腫瘤存在與否的物質，其存在和量變可以提供腫瘤的性質，因此，腫瘤標志物的檢測在基礎醫(yī)療研究領域以及在臨床診斷中發(fā)揮著重要作用。目前，腫瘤標志物的檢測方法主要有：熒光方法、化學發(fā)光方法、表面等離子體共振法、電化學方法以及電化學發(fā)光方法等。電化學發(fā)光方法是電化學方法和化學發(fā)光方法有效結合產生的一種方法，它具有靈敏度高、線性范圍寬以及操作簡單等特點。目前腫瘤標志物識別包含適配體、肽類以及蛋白質。由于篩選與腫瘤標志物相關的特異性的適配體和肽類過程中存在很多困難，因此，抗體成為腫瘤標志物中常用的識別元素。通常采用抗體作為識別元素所構建的體系導電性能不佳以及測試過程中信號放大方式有限使得測試靈敏度較低，因此急需尋找和建立一種新的研究手段來提高腫瘤標志物檢測的靈敏度，擴大其檢測范圍。

分子轉化技術通常應用于核酸的檢測中，也就是將輸入的目標DNA或RNA信號轉化為特定的單鏈DNA的輸出，通過測定分子轉化過程中相應信號的改變，來實現(xiàn)目標物的檢測。此種研究方法具有測定結果準確度高，線性范圍寬等優(yōu)點。

為了解決蛋白質檢測過程中存在的導電性差且缺少特定的目標識別元素的問題，進一步擴大腫瘤標志物的檢出限，我們將分子轉化技術引入到腫瘤標志物的檢測中，將輸入的蛋白質信號轉化為輸出的適配體鏈的信號，同時聯(lián)合紙芯片的廉價、便于攜帶、易于修飾等特點，借助電化學發(fā)光手段實現(xiàn)低濃度腫瘤標志物的檢測。

技術實現(xiàn)要素：

針對目前存在的問題，本發(fā)明制作了一種低成本便攜式的紙基電化學發(fā)光轉化器并將其應用到腫瘤標志物的檢測中。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明是通過以下措施來實現(xiàn)的：一種紙基電化學發(fā)光轉化器的制備及在癌胚抗原檢測中的應用，其特征是包括以下步驟：

(1)在計算機上設計如附圖1和附圖2所示的紙基電化學發(fā)光轉化器的疏水蠟批量打印圖案，分別定義為紙芯片1和紙芯片2；

(2)利用蠟打印機在A4大小的紙芯片1和紙芯片2上打印上疏水蠟批量圖案，隨后將打印有疏水蠟批量圖案的紙芯片放置到烘箱中加熱直至蠟融化，使其在紙芯片上形成疏水區(qū)域；

(3)采用絲網印刷的方法將參比電極、對電極印刷圖案依次印刷到步驟(2)中所得紙芯片1的正面左側親水區(qū)域上，樣式如附圖3所示，其中正面右側為親水的工作區(qū)，正面左側為參比區(qū)，紙芯片1的正面右側工作區(qū)的反面印有工作電極，樣式如附圖4所示；

(4)對紙芯片2的親水區(qū)域功能化，在紙芯片上完成由蛋白質輸入信號轉化為特定適配體鏈輸出信號的轉變；

(5)對紙芯片1的親水區(qū)域功能化，完成由特定適配體鏈引發(fā)的電化學發(fā)光信號的變化，實現(xiàn)癌胚抗原的檢測，實驗步驟如附圖5所示。

步驟（4）中所述對紙芯片2的親水區(qū)域功能化，在紙芯片上完成由蛋白質輸入信號轉化為特定適配體鏈輸出信號的轉變，其特征在于：

首先在紙芯片上生長Au納米花：在紙芯片上重復三次滴加Au納米粒子的種子溶液，等待干燥后，將15 μL 1%的HAuCl₄和15μL 20 mM的抗壞血酸混合，立即滴加到紙芯片表面，待反應完成后，去離子水沖洗電極表面，室溫下干燥即可；其次，將適配體鏈固定在電極表面：將5 μL修飾有一抗的適配體序列，定義為S0，其堿基序列如核苷酸序列表所示，其中，其5’端修飾上巰基，其3’端修飾上羧基，固定在親水區(qū)域，將5 μL另一適配體序列，定義為S1，其堿基序列如核苷酸序列表所示，其中，其3’端修飾上六個亞甲基以及巰基，固定在親水區(qū)域，室溫下孵育20 min，隨后用巰基己醇封鎖活性位點，然后再向電極表面滴加與S1堿基互補配對的適配體鏈，定義為S2，其堿基序列如核苷酸序列表所示；最后將目標抗原，也就是癌胚抗原連接在電極表面，引發(fā)分子轉化反應：向電極表面滴加不同濃度的癌胚抗原，室溫下孵育40 min，而后向電極表面滴加二抗功能化的適配體鏈，定義為S3，其堿基序列如核苷酸序列表所示，其中，其3’端修飾上氨基，室溫下反應50 min。

步驟（5）中所述對紙芯片1的親水區(qū)域功能化，完成由特定適配體鏈引發(fā)的電化學發(fā)光信號的變化，實現(xiàn)癌胚抗原的檢測，其特征在于：

首先在紙芯片上生長Pt納米粒子層：向紙芯片1的親水區(qū)域上重復三次滴加Pt納米粒子，室溫下干燥后，將20 mM的NaBH₄和200 mM的H₂PtCl₆等體積混合后，快速滴加到電極表面，等待反應完成后，用二次水沖洗電極表面；其次將多巴胺修飾的適配體鏈連接到電極表面：將5 μL適配體鏈，定義為S4，其堿基序列如核苷酸序列表所示，其中，其5’端修飾上巰基，固定在親水區(qū)域，隨后用巰基己醇封鎖活性位點，而后將紙芯片2放置到紙芯片1上，兩紙芯片親水區(qū)域上下重疊且緊密接觸，向紙芯片2親水的工作區(qū)域內滴加10 μL二次水，將紙芯片2親水的工作區(qū)域內通過分子轉化法置換出來的適配體鏈轉移到紙芯片1的工作區(qū)域內，隨后將兩紙芯片分開，向紙芯片1的工作區(qū)域上滴加30 μL多巴胺功能化的適配體鏈，定義為S5，其堿基序列如核苷酸序列表所示，其中，其5’端修飾上羧基，室溫下反應20 min；最后測定魯米諾的發(fā)光強度，實現(xiàn)癌胚抗原的檢測：將紙芯片2折疊，向工作區(qū)域上滴加40 μL含有發(fā)光試劑魯米諾和H₂O₂的磷酸鹽電解液，連接電化學工作站，測定魯米諾的發(fā)光強度，繪制魯米諾與癌胚抗原濃度關系曲線，完成癌胚抗原的檢測。

本發(fā)明的有益效果

（1）分子轉化法與紙基檢測平臺相結合，使得目標物的檢測具有所需費用低且測定結果準確度高的特點。

（2）功能化紙芯片作為電化學發(fā)光檢測基底，具有易于功能化、活性位點多、導電性能好的特點。

（3）整個紙基電化學發(fā)光轉化器制備過程簡單，便于攜帶且靈敏度高，有望實現(xiàn)癌胚抗原的早期預警。

附圖說明

圖1：紙芯片1的疏水蠟批量打印圖案；

圖2：紙芯片2的疏水蠟批量打印圖案；

圖3：紙芯片1的正面絲網印刷上參比電極和對電極后所得紙芯片示意圖；

圖4：紙芯片1反面的親水區(qū)，也就是圖3中工作區(qū)的反面區(qū)域上絲網印刷上工作電極后所得紙芯片示意圖；

圖5：實驗操作步驟示意圖，其中，a代表工作區(qū)域上生長Pt納米粒子；b代表工作區(qū)域上生長花狀Au納米粒子；c代表一抗修飾的S0; d代表二抗修飾的S3；e代表癌胚抗原；f代表分子轉換法置換出來的S2; g代表多巴胺修飾的S5。

具體實施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面通過實施例進一步闡明本發(fā)明的內容，但本發(fā)明不僅僅局限于下面的實施例。

實施例1

紙基電化學發(fā)光轉化器的制備及在癌胚抗原檢測中的應用：

（1）在計算機上設計紙基電化學發(fā)光轉化器的疏水蠟批量打印圖案，分別定義為紙芯片1和紙芯片2；

（2）利用蠟打印機在A4大小的紙芯片1和紙芯片2上打印上疏水蠟批量圖案，隨后將打印有疏水蠟批量圖案的紙芯片放置到烘箱中加熱直至蠟融化，使其在紙芯片上形成疏水區(qū)域；

（3）采用絲網印刷的方法將參比電極、對電極印刷圖案依次印刷到步驟(2)中所得紙芯片1的正面左側親水區(qū)域上，其中正面右側為親水的工作區(qū)，正面左側為參比區(qū)，紙芯片1的正面右側工作區(qū)的反面印有工作電極；

（4）對紙芯片2的親水區(qū)域功能化，在紙芯片上完成由蛋白質輸入信號轉化為特定適配體鏈輸出信號的轉變；

（5）對紙芯片1的親水區(qū)域功能化，完成由特定適配體鏈引發(fā)的電化學發(fā)光信號的變化，實現(xiàn)癌胚抗原的檢測。

SEQUENCE LISTING

<110> 濟南大學

<120> 紙基電化學發(fā)光轉化器的制備及在癌胚抗原檢測中的應用

<130> 5

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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tttttttttt tttttttt 78

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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