本發(fā)明屬于醫(yī)療器械及體外診斷細(xì)分領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種DCP快速分離檢測試劑盒，和一種優(yōu)選用于異常凝血酶原(DCP)快速分離檢測試劑盒制備的單克隆抗體及其雜交瘤細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是一種世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤疾病，其發(fā)病率逐年上升，目前已躍居全球所有腫瘤發(fā)病率的第四位。HCC的死亡率較高，居全球癌癥死因的第三位，全球每年大約有25萬名患者死于肝癌細(xì)胞。HCC發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚，缺少有效地早期診斷技術(shù)及方法是HCC死亡率高的重要原因。因此，早期發(fā)現(xiàn)和早期治療是HCC患者生存的關(guān)鍵，報(bào)道顯示早期階段發(fā)現(xiàn)HCC，并采取有效治療，其五年生存率可提高至50％。HCC可由多種因素誘發(fā)，如肝炎、肝硬化、致癌物質(zhì)以及環(huán)境因素等，HCC惡性程度較高且易于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，但其早期診斷較為困難，容易耽誤最佳治療時(shí)期，因此一個(gè)高靈敏的HCC檢測系統(tǒng)的研究是必要的。凝血酶原(prothrombin)是凝血酶的前體，它由肝臟合成，參與凝血調(diào)控。正常的凝血酶原是由維生素K依賴的γ賴谷氨?；然笇⑽挥贜末端附近的10個(gè)谷氨酸(Glu)殘基羧化形成γ形羧基谷氨酸(Gla)，從而使其具有正常的生理功能。在維生素K缺乏、γ乏谷氨?；然腹δ墚惓?，或肝功能受損等情況時(shí)，10個(gè)谷氨酸不能夠被完全羧化，因此形成了脫-谷氨羧基凝血酶原(des-酶原carboxyprothrombin，DCP)，也稱為維生素K缺乏誘導(dǎo)的蛋白-II(ProteininducedbyvitaminKabsence-II，PIVKA-II)。羧化能力不足會導(dǎo)致10個(gè)Gla殘基中的全部或一部分形成Glu殘基，任何一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)谷氨酸殘基羧化不全，都將產(chǎn)生脫-基，羧基凝血酶原(DCP)。1984年Liebman等首次報(bào)道約90％的HCC患者血清DCP升高，從此DCP作為HCC的血清腫瘤標(biāo)志物得到了廣泛的研究與證實(shí)，且肝臟細(xì)胞分泌的DCP肝硬化、慢性肝炎等影響。目前，DCP已被公認(rèn)為HCC有用的腫瘤標(biāo)志物，并逐漸被應(yīng)用于臨床。目前文獻(xiàn)報(bào)道及實(shí)際應(yīng)用檢測的主要方法有：酶聯(lián)免疫法(ELISA)、免疫沉淀法、液相親和免疫法、電化學(xué)發(fā)光法、Westernblot方法等。Wako公司開發(fā)的DCP定量檢測試劑盒采用復(fù)雜的色譜分離技術(shù)，Eilsai公司研發(fā)電化學(xué)免疫分析法檢測人血清內(nèi)DCP含量，Wako和Eilsai公司研制的DCP檢測試劑盒均需應(yīng)用到復(fù)雜的儀器設(shè)備，且儀器試劑價(jià)格昂貴，不利于推廣應(yīng)用。ELISA方法不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，但其具有需要純手工操作，人為干擾因素較大，時(shí)間長，靈敏度低及線性范圍小等缺點(diǎn)。專利CN104949971B公開一種肝癌早期診斷試劑盒及其應(yīng)用，該方法為標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法，其檢測靈敏度為2mAU/ml，線性范圍未做明確記載，按照其實(shí)施例推算為10-2000mAU/ml；其檢測靈敏度偏低，線性范圍小，檢測時(shí)間長，手工操作，使臨床應(yīng)用受到較大限制。專利CN101377505A公開一種DCP微孔板化學(xué)發(fā)光法免疫分析測定試劑盒及其制備方法，該方法實(shí)質(zhì)上為ELISA檢測的一種，且其測定單位為mAU/ml,mAU為酶活性單位，是一種非國際或國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)單位，每個(gè)研究者由于使用抗體不同，酶活性單位定義也不同，因此使得DCP檢測結(jié)果的溯源性較差，無法獲得相對一致的檢測結(jié)果，另外該方法的檢測線性為4.37-2000mAU/ml；其檢測靈敏度偏低，線性范圍小，檢測時(shí)間長，手工操作，使臨床應(yīng)用受到很大限制。專利CN104520710A公開一種PIVKA-II測定方法、測定試劑盒，該方法主要是對人血清、血漿檢測DCP結(jié)果進(jìn)行一致性研究，而在臨床應(yīng)用的實(shí)際檢測應(yīng)用中，單獨(dú)采集一種血液類型檢測血清或血漿即滿足臨床需求，同時(shí)檢定血清、血漿的DCP含量，需要對患者進(jìn)行兩種不同形式的血液采集，如采用EDTA抗凝采血管、非抗凝采血管同時(shí)采集，加重了患者的身體和經(jīng)濟(jì)的雙重負(fù)擔(dān)，且在臨床操作中無實(shí)際意義；另外該方法依然采用mAU/ml作為檢測單位，不利于檢測的溯源性及對比性，且該專利對DCP的檢測的靈敏度和線性范圍的改進(jìn)無任何記載；另外該專利采用抗凝血酶原單抗混合物及抗DCP單抗分別作為標(biāo)記和包被，其中重點(diǎn)包括抗凝血酶原的制備，而對抗DCP單克隆抗體的制備，尤其是覆蓋更全面的抗原表位的抗DCP單克隆抗體缺少必要的表述，但抗DCP單克隆抗體的表位的覆蓋對DCP檢測的靈敏度、特異性有著非常重要的作用。高靈敏度DCP的檢測依賴于高靈敏度、高特異性的抗DCP單克隆抗體。根據(jù)已有研究報(bào)道，不同病人體內(nèi)DCP的羧化順序不同，因此不同病人身體內(nèi)的DCP種類和含量也各不相同，理論上，有多少種Glu存在形式就有多少種DCP蛋白。由于DCP的抗原性依賴其氨基酸殘端10個(gè)谷氨酸的轉(zhuǎn)化程度及其谷氨酸區(qū)的構(gòu)象，因此識別不同DCP表位的抗體特異性和靈敏度尤為重要。目前的研究中，已經(jīng)有一些不同的診斷HCC的單克隆抗體，例如MU3和3C10，但由于單克隆抗體的識別表位有限，不能夠?qū)⑺蠨CP捕獲，因此檢測靈敏度較低。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術(shù)問題的不足，本發(fā)明提供了一種DCP快速分離檢測試劑盒，并提供了一種可用于制備DCP快速分離檢測試劑盒的高靈敏度抗DCP單克隆抗體及組合物。本發(fā)明的一方面，提供一種DCP快速分離檢測試劑盒，主要組成成分包括：包被抗體、標(biāo)記抗體、清洗液、底物液、定標(biāo)液1、定標(biāo)液2和定標(biāo)稀釋液。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)方案中，包被抗體為經(jīng)磁珠偶聯(lián)的抗DCP單克隆抗體，標(biāo)記抗體為酶標(biāo)記的抗凝血酶原單克隆抗體；或者包被抗體為經(jīng)磁珠偶聯(lián)的抗凝血酶原單克隆抗體，標(biāo)記抗體為酶標(biāo)記的抗DCP單克隆抗體；其特征在于：包被抗體、標(biāo)記抗體共同與待測樣品中的DCP在液相中形成免疫夾心復(fù)合物，通過經(jīng)定標(biāo)液標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確測定樣品中DCP的含量。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)方案中，抗DCP單克隆抗體為一種單克隆抗體或兩種及以上單克隆抗體的組合物，其特征在于抗DCP單克隆抗體及組合物的抗原表位為不同類型的DCP抗原及DCP抗原的不同表位，至少對應(yīng)SEQIDNO:3-22所示的氨基酸序列中的兩種以上，其中SEQIDNO:2-22所示的氨基酸序列如下：SEQIDNO2：ANTFLEEVRKGNLERECVEETCSTEEAFEALESSTATDVFSEQIDNO3：ANTFLγγVRKGNLγRγCVγγTCSYγγAFγALγSSTATDVFSEQIDNO4：ANTFLEEVRKGNLERECVEETCSSEQIDNO5：ANTFLEγVRKGNLγRECVγγTCSSEQIDNO6：ANTFLEEVRKGNLγRγCVγγTCSSEQIDNO7：ANTFLEEVRKGNLERγCVγγTCSSEQIDNO8：ANTFLEEVRKGNLERECVγγTCSSEQIDNO9：ANTFLEEVRKGNLERECVEγTCSSEQIDNO10：ANTFLEEVRKGNLERγCVEγTCSSEQIDNO11：ANTFLγγVRKGNLγRγCVγETCSSEQIDNO12：ANTFLγγVRKGNLγRγCVEETCSSEQIDNO13：ANTFLγγVRKGNLγRECVEETCSSEQIDNO14：ANTFLγγVRKGNLERECVEETCSSEQIDNO15：ANTFLγEVRKGNLERECVEETCSSEQIDNO16：TCSYEEAFEALESSTATDVFSEQIDNO17：TCSYEγAFγALγSSTATDVFSEQIDNO18：TCSYEEAFγALγSSTATDVFSEQIDNO19：TCSYEEAFEALγSSTATDVFSEQIDNO20：TCSYEEAFγALESSTATDVFSEQIDNO21：TCSYEγAFEALESSTATDVFSEQIDNO22：TCSYγEAFEALESSTATDVF在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)方案中，提供了一種抗DCP單克隆抗體及組合物的制備方法，所述單克隆抗體及組合物是針對不同類型的DCP及DCP的不同表位進(jìn)行篩選組合；抗DCP單克隆抗體及組合物由雜交瘤細(xì)胞4D09和3H08生產(chǎn)制備，所述雜交瘤細(xì)胞4D09和3H08已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號分別為CGMCCNo.10211和CGMCCNo.10210。本發(fā)明提供了一種DCP快速分離檢測試劑盒的包被抗體制備方法，所述包被抗體為磁珠偶聯(lián)的高靈敏度抗DCP單克隆抗體，或所述包被抗體為磁珠偶聯(lián)的高靈抗凝血酶原單克隆抗體；所述磁珠偶聯(lián)的單克隆抗體與包被緩沖液按照比例混勻，均勻分裝制備而成。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述磁珠偶聯(lián)的抗DCP單克隆抗體中的磁珠包括超順磁顆粒和/或表面覆蓋有選自硅化物、多聚糖、蛋白質(zhì)和纖維素中的至少之一的高分子成分的磁性顆粒。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述緩包被沖液主要包括pH7.4的0.02-0.1MPBS溶液，1％-5％的BSA溶液，0.1-1％的防腐劑，0.5-3％的甘氨酸溶液等，主要用于提高DCP檢測試劑盒的靈敏度、穩(wěn)定性、特異性。本發(fā)明提供了一種DCP快速分離檢測試劑盒的標(biāo)記抗體制備方法，所述標(biāo)記抗體為單克隆抗體，所述抗體標(biāo)記酶為堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、熒光素酶等公知酶類，并不局限于以上公知標(biāo)記酶類，所述標(biāo)記酶優(yōu)選堿性磷酸酶；所述堿性磷酸酶與標(biāo)記用單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記操作，制備成堿性磷酸酶標(biāo)記的單克隆抗體，然后與緩沖液按比例混勻，均勻分裝制成。本發(fā)明提供了一種DCP快速分離檢測試劑盒的定標(biāo)液1和定標(biāo)液2的制備方法，所述定標(biāo)液1和定標(biāo)液2由純化的DCP基因工程抗原、純化的DCP樣本和純化的DCP校準(zhǔn)品得一種或兩種及以上的組合物和定標(biāo)稀釋液按比例配制并凍干制成；所述的定標(biāo)稀釋液包括1-5％BSA溶液、1-5％的海藻糖溶液、10-50％新生牛血清溶液。本發(fā)明提供了一種DCP快速分離檢測試劑盒的清洗液制備方法：清洗液主要包括0.1MTris緩沖液，0.1-1％的吐溫溶液、0.1％防腐劑。本發(fā)明提供了一種DCP快速分離檢測試劑盒的底物液的制備方法，底物液可以為顯色底物、熒光底物、發(fā)光底物等公知底物，并不局限于以上底物；所述底物液優(yōu)選發(fā)光底物，如：3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽溶液。本發(fā)明提供了一種DCP快速分離檢測試劑盒的制備方法，所述試劑盒主要以瓶裝、卡式、條式等方式提供，優(yōu)選以卡式或條式提供；所述卡式或條式檢測試劑盒更利于檢驗(yàn)操作的簡單化和標(biāo)準(zhǔn)化，更節(jié)約檢測時(shí)間。本發(fā)明提供了一種DCP快速分離檢測試劑盒的應(yīng)用方法，所述檢測試劑盒適用儀器包括半自動(dòng)或全自免疫分析儀，樣品測定時(shí)間為20分鐘以下。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的免疫分析儀為北京熱景生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Maglumi系列全自動(dòng)免疫分析儀(MQ60系列)及北京中航賽維生物科技有限公司生產(chǎn)的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(VI-180型)。本發(fā)明提供了一種DCP快速分離檢測試劑盒的應(yīng)用方法，所述檢測試劑盒適用的樣本類型為人血清樣本，所述血清樣本的檢測結(jié)果用于對原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)與慢性肝病及良性肝占位性病變的鑒別診斷。本發(fā)明提供了一種DCP快速分離檢測試劑盒的應(yīng)用方法，所述檢測試劑盒的特征在于：DCP含量的檢測為定量檢測，經(jīng)過準(zhǔn)確精密的量值溯源，DCP含量的檢測單位為ng/ml；DCP檢測最低檢測限≤1.0ng/mL，檢測線性范圍為5-20000ng/mL，線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)(r)不低于0.99，批內(nèi)變異系數(shù)不高于8.0％，批間變異系數(shù)不高于15.0％。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)效果在于提供一種人血清樣本中DCP含量精確測定的一種DCP快速分離檢測試劑盒及應(yīng)用，以及生產(chǎn)制備該試劑盒的優(yōu)選抗DCP單克隆抗體的制備方法及保存于CGMCC的雜交瘤細(xì)胞株；所述精確測定是指通過精密的量值溯源，使測定單位為ng/ml，其準(zhǔn)確性和對比性遠(yuǎn)高于定值較為隨意的酶活性單位mAU/ml；所述檢測快捷是指檢測者只需簡單的加入待測樣本等簡單操作，在20min內(nèi)即可完成檢測，獲得精確的測定結(jié)果；所述檢測高靈敏性是指最低檢測限可達(dá)≤1.3ng/mL,線性范圍可達(dá)5-20000ng/ml。附圖說明附圖1：本發(fā)明示例性DCP快速分離檢測試劑盒的最低檢出限設(shè)置圖。附圖2、附圖3：分別為示例性DCP快速分離檢測試劑盒的線性范圍設(shè)置圖。附圖4：本發(fā)明的示例性DCP快速分離檢測試劑盒的變異系數(shù)設(shè)置圖。附圖5：本發(fā)明的示例性DCP快速分離檢測試劑盒實(shí)施示意圖。其中1-樣本孔，2-裝有底物液的試劑槽，3-裝有清洗液的試劑槽，4-裝有包被抗DCP單克隆抗體磁性顆粒的試劑槽，5-裝有酶標(biāo)記的抗DCP單克隆抗體的試劑槽，6-反應(yīng)孔，7-試劑卡；其中2、3、4、5試劑槽的位置功能可以相互替換。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所述的實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，并不限定發(fā)明范圍。實(shí)施例1本實(shí)施例提供一種DCP快速分離檢測試劑盒，并提供一種生產(chǎn)制備該試劑盒的優(yōu)選抗DCP單克隆抗體的制備方法。1、抗DCP單克隆抗體制備：本實(shí)施例中抗DCP單克隆抗體制備可以為雜交瘤細(xì)胞4D09和3H08生產(chǎn)制備的第1抗體、第2抗體或第1抗體和第2抗體組合物，也可以為其他商品化的抗DCP單克隆抗體。為更好的解釋本發(fā)明，抗DCP單克隆抗體制備優(yōu)選第1抗體和第2抗體組合物制備；該制備方法僅為更好的解釋本發(fā)明，不作為抗DCP單克隆抗體的制備及使用的限制條件。取雜交瘤細(xì)胞4D09和3H08(由保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號分別為CGMCCNo.10211和CGMCCNo.10210)，雜交瘤細(xì)胞4D09和3H08復(fù)蘇、活化后，選用成年BALB/c經(jīng)產(chǎn)鼠，腹腔注射0.5mL液體石蠟，一周后接種至少105個(gè)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行腹腔培養(yǎng)，2周后采集小鼠腹水；將腹水離心后吸取上清，用proteinA親和層析和DEAE離子交換柱相結(jié)合對獲得的單克隆抗體進(jìn)行純化，即得到純化后的抗DCP單克隆抗體；制備的抗DCP單克隆抗體可以識別多種不同的多肽序列，并能識別純化的肝癌患者血清的凝血酶原，但不識別純化的正常人血清中的凝血酶原?？鼓冈贵w制備參照相關(guān)文獻(xiàn)，按照公開方法制備，取純化的正常人血清中的凝血酶原作為免疫原，與免疫佐劑一起共同免疫小鼠，取免疫后小鼠的淋巴細(xì)胞或脾細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞融合，得到雜交瘤細(xì)胞，通過篩選得到與目標(biāo)抗原特異性結(jié)合的抗體的雜交瘤細(xì)胞，按照制備抗DCP單克隆抗體的方法制備抗凝血酶原單克隆抗體。2、包被抗體的制備：包被抗體可以為抗DCP單克隆抗體，也可以為抗凝血酶原抗體組合物。為更好的解釋本發(fā)明，包被抗體優(yōu)先選擇抗DCP單克隆抗體；該制備方法僅為更好的解釋本發(fā)明，不作為包被抗體的制備及使用的限制條件。包被抗體的制備：概括為將磁微粒與抗DCP單克隆抗體反應(yīng)形成連接物，按一定濃度加入緩沖液中配制而成。主要步驟如下：(1)將磁珠混勻后加磁場去掉上清，用包被緩沖液清洗磁珠一次，然后加入活化劑(碳二亞胺)，常溫震蕩反應(yīng)30min，然后去上清，加入包被緩沖液及適量抗體，常溫震蕩3h，反應(yīng)結(jié)束后加入封閉液并震蕩，最后加清洗液，清洗完成后加入保存液過夜保存即可。(2)包被緩沖液為0.1mol/L的pH5.0的MES緩沖液。(3)活化劑碳二亞胺的終濃度為0.01-0.1g/ml。(4)抗DCP單克隆抗體的適宜濃度為20-50ug/mg磁珠。(5)包被結(jié)束后，加磁場棄上清，加入約10倍體積的封閉液，常溫振蕩至少1小時(shí)。封閉液主要組成成分為：50mM的Tris緩沖液，1-5％BSA溶液，0.1％防腐劑，pH7.4。(6)封閉結(jié)束后，加磁場棄上清，加入約10倍體積的清洗液清洗，清洗液的主要組成成分為0.02MPBS、100nM氯化鈉溶液，0.5-1％的吐溫-20溶液。(7)清洗結(jié)束后，加磁場棄上清，準(zhǔn)確加入10倍體積的磁性顆粒保存液保存抗DCP單克隆抗體的磁性顆粒；保存液的主要組成成分為0.02-0.1MPBS溶液，1％-5％的BSA溶液，0.1％的防腐劑，0.5-3％的甘氨酸溶液，pH7.4。3、標(biāo)記抗體的制備標(biāo)記抗體可以為抗DCP單克隆抗體，也可以為抗凝血酶原抗體組合物。為更好的解釋本發(fā)明，并于包被抗體對應(yīng)，標(biāo)記抗體優(yōu)先選擇抗凝血酶原單克隆抗體；該制備方法僅為更好的解釋本發(fā)明，不作為標(biāo)記抗體的制備及使用的限制條件。標(biāo)記抗體制備：概括為堿性磷酸酶標(biāo)記的抗凝血酶原單克隆抗體按照一定濃度加入到緩沖液中配制而成。取與抗體質(zhì)量比為2:1的堿性磷酸酶，加入與堿性磷酸酶溶液等體積的NaIO4(12.8mg/ml，4℃現(xiàn)配)，4℃避光反應(yīng)30分鐘，然后加入與堿性磷酸酶溶液等體積的乙二醇溶液4℃避光反應(yīng)45分鐘；加入抗體，再加入混合液1/20體積的CBS標(biāo)記緩沖液(0.05mol/L，pH9.6)置4℃避光透析過夜，最后加入硫酸銨溶液，反應(yīng)2小時(shí)，離心，棄去上清，沉淀用0.01mol/L的PBS溶解后置4℃避光透析過夜，透析完后加等體積甘油混勻，-20℃保存。按比例(1:1000)將堿性磷酸酶標(biāo)記的抗DCP單抗加入保存液中，混勻即得DCP標(biāo)記抗體。4、清洗液的制備：清洗液主要組成為：0.1MTris緩沖液，0.1-1％吐溫溶液、0.1％防腐劑。5、定標(biāo)液的制備：DCP定標(biāo)液制備概括為將檢驗(yàn)合格的DCP抗原加入定標(biāo)生產(chǎn)稀釋液中配制凍干而成。定標(biāo)生產(chǎn)稀釋液包括1-5％BSA溶液、1-5％的海藻糖溶液、10-50％新生牛血清溶液。將高值DCP抗原凍干液進(jìn)行梯度稀釋稀，釋至適宜濃度，檢測完后放入凍干機(jī)凍干，預(yù)凍時(shí)間為2h，抽真空時(shí)間為16-24h。6、高靈敏DCP檢測系統(tǒng)制備：將DCP分離試劑、DCP檢測試劑、DCP清洗液、DCP底物液按照工藝規(guī)程或說明書要求，分裝至相應(yīng)大小的試劑瓶內(nèi)，或著條裝試劑的試劑條的相應(yīng)孔位，然后密封。分裝后的試劑與定標(biāo)液、耗材反應(yīng)槽、一次性取樣頭等組成異常凝血酶原(DCP)測定試劑盒(磁微粒化學(xué)發(fā)光法)。實(shí)施例2本發(fā)明提供了一種DCP快速分離檢測試劑盒及其應(yīng)用，主要用于準(zhǔn)確定量檢測人血清樣本中DCP的含量，血清樣本的檢測結(jié)果用于對原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)與慢性肝病及良性肝占位性病變的鑒別診斷。以下檢測步驟主要用于更好的解釋本發(fā)明的使用及應(yīng)用，不作為本發(fā)明應(yīng)用的限制條件。主要檢測步驟如下：1、實(shí)施例2適配儀器為：北京熱景生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Maglumi系列全自動(dòng)免疫分析儀(MQ60型)。2、MQ60檢測步驟：(1)試劑準(zhǔn)備a)試劑盒從冷藏環(huán)境取出時(shí)應(yīng)平衡至室溫方可使用。b)定標(biāo)液：向定標(biāo)液1與定標(biāo)液2中各加入500ul定標(biāo)稀釋液進(jìn)行復(fù)溶，復(fù)溶后的定標(biāo)液可在2-8℃保存7天，可在-20℃保存1個(gè)月。(2)錄入標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)a)使用新批號試劑前，必須錄入標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)。b)更多信息參考相應(yīng)適配儀器的操作手冊。(3)定標(biāo)程序a)使用新批號試劑時(shí)，必須錄入標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行定標(biāo)。b)定標(biāo)液1與定標(biāo)液2需復(fù)孔進(jìn)行定標(biāo)實(shí)驗(yàn)。c)吸取100ul進(jìn)行充分混勻的定標(biāo)液加入到相應(yīng)樣本孔中，放入相應(yīng)的適配儀器中。d)根據(jù)相應(yīng)適配儀器的操作手冊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。e)注意：在第一次定標(biāo)后，必須每4周進(jìn)行一次定標(biāo)。如儀器顯示定標(biāo)失敗，請重新定標(biāo)。(4)質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)(質(zhì)控實(shí)驗(yàn))可根據(jù)使用單位建立適用于其實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)控方法。由于地區(qū)不同，使用的儀器不同，參考值存在一定差異，因此本說明書所提供的正常參考值僅作參考，各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)病人群體建立自己的正常參考值范圍。(5)樣本實(shí)驗(yàn)a)將不小于100ul的樣本添加到樣本位中，根據(jù)適配儀器的操作手冊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。b)適配儀器將根據(jù)檢測信號自動(dòng)計(jì)算出各樣本中被測物濃度。c)注意：樣本結(jié)果大于20000ng/mL時(shí)，要獲得精確結(jié)果，要用樣本緩沖液或生理緩沖液稀釋后重新檢測，或者報(bào)告為大于20000ng/mL的結(jié)果。實(shí)施例3本發(fā)明一種DCP快速分離檢測試劑盒及其應(yīng)用，主要用于準(zhǔn)確定量檢測人血清樣本中DCP的含量，血清樣本的檢測結(jié)果用于對原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)與慢性肝病及良性肝占位性病變的鑒別診斷。以下檢測步驟主要用于更好的解釋本發(fā)明的使用及應(yīng)用，不作為本發(fā)明應(yīng)用的限制條件。主要性能指標(biāo)如下：1、實(shí)施例2適配儀器為：北京熱景生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Maglumi系列全自動(dòng)免疫分析儀(MQ60型)。2、最低檢出限：DCP最低檢出限即從DCP含量為零的點(diǎn)就可以區(qū)分DCP的含量。由本發(fā)明提供的高敏感性DCP檢測系統(tǒng)檢測20次DCP校準(zhǔn)品稀釋液樣本，計(jì)算平均值(Mean)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，由擬合方程Mean-2×SD，計(jì)算出RLU值，計(jì)算其濃度值為0.001ng/ml(詳見附圖1)，符合要求。實(shí)際工作中，臨床樣本DCP最低檢出限測定值為≤低檢1.0ng/ml。3、線性范圍：選擇(100±10)ug/ml的樣本，稀釋成為2.5ng/mL到30000ng/mL范圍內(nèi)的至少5個(gè)稀釋濃度(xi)，按照說明書要求，在MQ60上檢測，將每一濃度的樣本重復(fù)檢測3次，計(jì)算平均值，并計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)r(附圖2、附圖3)。由附圖2計(jì)算的線性來看，在2.5～20000ng/mL和5～20000ng/mL范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)大于0.990；在2.5～30000ng/mL和5～30000ng/mL范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)小于0.990；考慮到2.5ng/ml的檢測結(jié)果與理論值偏差較大，將本試劑盒的線性范圍規(guī)定在5～20000ng/mL。4、變異系數(shù)：用同一批試劑盒測定濃度為100ng/mL和8000ng/mL的精密度樣本，平行測定10次，計(jì)算測定結(jié)果的平均濃度(Mean)與標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，批內(nèi)精密度(CV)＝SD/Mean×100％，CV不大于8.0％。用三批試劑盒分別檢測濃度在(8000±800)ng/mL水平的DCP標(biāo)準(zhǔn)品，平行測定10次，計(jì)算測定結(jié)果的平均濃度(Mean)與標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，批間精密度(CV)＝SD/Mean×100％，CV不大于15.0％。(詳見附圖4)5、其他技術(shù)指標(biāo)：1)回收率：采用DCP純品配制成(20000±2000)ng/mL的濃度，按照1:9的比例加入到已知濃度的血清基質(zhì)中，混合后重復(fù)測定3次取平均值，其回收率在85％～115％范圍內(nèi)。2)分析特異性：采用DCP檢測系統(tǒng)檢測在人血液中容易對DCP的測量造成干擾的物質(zhì)：高濃度的人血清白蛋白(HSA)和膽紅素，檢測結(jié)果均小于1.3ng/ml(詳見下表)，因此DCP檢測系統(tǒng)與這些物質(zhì)的交叉反應(yīng)很低，不會對DCP的測量造成干擾。HSA(2×106ng/ml)膽紅素(2000ng/mL)測值10.140.2測值20.040.13測值30.210.15平均值0.130.166、性能指標(biāo)匯總：經(jīng)過上面所述大量實(shí)驗(yàn)證明，高靈敏度異常凝血酶原(DCP)的快速分離檢測系統(tǒng)的性能指標(biāo)匯總?cè)缦拢?)最低檢測限：≤1.3ng/mL。2)線性范圍：5-20000ng/mL，線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)(r)應(yīng)不低于0.9900。3)精密度：a)批內(nèi)變異系數(shù)(CV)：檢測(100±10)ng/mL、(8000±800)ng/mL兩個(gè)濃度水平的樣本各10次，批內(nèi)變異系數(shù)應(yīng)均不高于8.0％。b)批間變異系數(shù)(CV)：檢測(8000±800)ng/mL的樣本10次，批間變異系數(shù)應(yīng)不高于15.0％。4)準(zhǔn)確性：檢測DCP純品，其回收率在85％～115％范圍內(nèi)。5)特異性：和其它物質(zhì)的交叉反應(yīng)數(shù)據(jù)如下：交叉原濃度測定濃度HSA2×106ng/ml≤1.3ng/mL膽紅素2000ng/mL≤1.3ng/mL上述實(shí)施例描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，如前所述，應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的解釋，而非局限于本發(fā)明實(shí)施例披露的形式，不應(yīng)看做是對其他實(shí)施例的排除，而可以用于各種其他形式的組合、修改，并能夠在本發(fā)明的構(gòu)思范圍內(nèi)改動(dòng)。本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化在本發(fā)明構(gòu)思及范圍內(nèi)的，都應(yīng)在本發(fā)明所附權(quán)利要求保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3