本發(fā)明涉及疾病檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體的是涉及一種基于凝血酶熒光底物金球雙標(biāo)記探針檢測乙肝病毒表面抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒制備方法。

背景技術(shù)：

乙肝表面抗原(HBsAg)是乙肝病毒的外殼蛋白，本身不具有傳染性，但它的出現(xiàn)常伴隨乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的標(biāo)志。它可存在于患者的血液、唾液、乳汁、汗液、淚水、鼻咽分泌物、精液及陰道分泌物中。在感染乙肝病毒后2～6個(gè)月，當(dāng)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高前2～8周時(shí)，可在血清中測到陽性結(jié)果。急性乙型肝炎患者大部分可在病程早期轉(zhuǎn)陰，慢性乙型肝炎患者該指標(biāo)可持續(xù)陽性。乙肝表面抗原(HBsAg)滴度表示HBsAg在血清中的含量。高滴度的HBsAg常表示病毒的高復(fù)制水平；低滴度的HBsAg可能是由于在感染恢復(fù)時(shí)期病毒低復(fù)制，或者在炎癥活動(dòng)時(shí)病毒和抗原部分清除；少數(shù)情況下是由于病毒變異，引起HBsAg抗原性改變，從而與試劑抗體的親和性降低，表現(xiàn)為臨床檢查HBsAg低滴度。血清HBsAg在疾病早期出現(xiàn)。一般在ALT升高前2～6周，在血清中即可檢出HBsAg。HBsAg陽性是乙肝病毒感染的主要標(biāo)志。血清HBsAb的出現(xiàn)，是乙肝病毒感染恢復(fù)的標(biāo)志。注射過乙肝疫苗者，也可出現(xiàn)血清HBsAb陽性，提示已獲得對(duì)乙肝病毒的特異性免疫，因此對(duì)乙肝表面抗原進(jìn)行檢測有著非常的意義。

納米科技是指在納米尺度(1nm到l00nm之間)上研究物質(zhì)的特性和相互作用，比如原子和分子，以及利用這些特性的多學(xué)科交叉的科學(xué)和技術(shù)。當(dāng)物質(zhì)小到1-100nm時(shí)，其量子效應(yīng)、物質(zhì)的局域性及巨大的表面及界面效應(yīng)使物質(zhì)的很多性能發(fā)生質(zhì)變，呈現(xiàn)出許多既不同于宏觀物體，也不同于單個(gè)孤立原于的奇異現(xiàn)象。金納米粒子因其較高的電荷密度和較大的比表面積，因此被廣泛應(yīng)用于標(biāo)記領(lǐng)域。

凝血酶(Thrombin)熒光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110是一種雙酰胺衍生物的羅丹明110(Rhodamine110)分子探針，是一個(gè)敏感的和有選擇性的測定蛋白酶在溶液中或在活細(xì)胞內(nèi)底物。這些熒光底物含有一種氨基酸或肽共價(jià)連接到每個(gè)Rhodamine110的氨基，酶裂解后，非熒光雙酰胺底物首先轉(zhuǎn)化為弱熒光單酰胺，然后轉(zhuǎn)化為強(qiáng)熒光的Rhodamine110，熒光會(huì)進(jìn)一步增加。由于Rhodamine110具有較大的消光系數(shù)，所以實(shí)驗(yàn)的信噪比很高。此外，相比于普通的熒光素而言，Rhodamine110的熒光在pH3-9之間會(huì)保持穩(wěn)定。目前熒光檢測因具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于示蹤、成像以及標(biāo)記等方面，而ELISA則因?yàn)樗撵`敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在檢測領(lǐng)域處于特殊重要的地位。所以本文擬研制基于凝血酶熒光底物金球雙標(biāo)記探針檢測乙肝病毒表面抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，對(duì)乙肝病毒表面抗原進(jìn)行檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于血液標(biāo)志物在腫瘤檢測中的重要地位、熒光檢測獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)以及酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)的優(yōu)勢。我們將結(jié)合酶聯(lián)免疫檢測和熒光檢測兩種技術(shù)，利用金納米粒子標(biāo)記凝血酶和乙肝病毒相應(yīng)抗體Ab₂制得檢測探針。探針、腫瘤標(biāo)志物和包埋在酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒的另一種乙肝病毒抗體Ab₁通過抗體抗原之間的作用，形成一種類似夾心的結(jié)構(gòu)，最后通過酶和熒光底物的作用產(chǎn)生熒光，對(duì)乙肝病毒表面抗原進(jìn)行定性定量的檢測，建立血液標(biāo)志物檢測的新方法，極大程度提高了檢測靈敏度。

本發(fā)明制備的基于凝血酶熒光底物金球雙標(biāo)記探針檢測乙肝病毒表面抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是利用金納米粒子同時(shí)標(biāo)記抗體分子和凝血酶分子制備雙標(biāo)記酶標(biāo)免疫探針，選用凝血酶熒光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110特異性降解產(chǎn)生的熒光對(duì)乙肝病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)進(jìn)行定量檢測，其結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種基于凝血酶熒光底物金球雙標(biāo)記探針檢測乙肝病毒表面抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒；其步驟如下：

1)將新制備的金納米粒子溶液(Gold nanoparticles,AuNPs)通過碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)pH為9.0～9.5，加入凝血酶Thrombin和乙肝病毒標(biāo)記抗體Ab₂混合蛋白溶液，充分混勻后室溫下靜置2～3h，離心得到酶聯(lián)檢測探針multi-thrombin-AuNP-Ab₂，復(fù)溶于BSA的PBS緩沖液中，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

2)將乙肝病毒包被抗體Ab₁加入96孔酶標(biāo)板，靜置過夜處理后用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入BSA封閉處理后再次用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，之后加入標(biāo)準(zhǔn)乙肝病毒表面抗原或乙肝病人血清樣本緩慢搖晃孵育，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入上述酶聯(lián)檢測探針multi-thrombin-AuNP-Ab₂，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，最后加入凝血酶熒光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110，用熒光酶標(biāo)儀讀取96孔酶標(biāo)板熒光強(qiáng)度值。

所述碳酸鉀溶液是濃度為0.15M的碳酸鉀溶液；PBS緩沖液是0.01M pH7.4的緩沖液，且BSA的質(zhì)量體積比為0.1～1％。

所述金納米粒子：蛋白溶液質(zhì)量比為1:2～10；凝血酶：乙肝病毒標(biāo)記抗體質(zhì)量比為1～6:1；

所述乙肝病毒包被抗體Ab₁濃度為10～50μg/mL。

所述洗滌緩沖液是含有0.05～0.5％Tween-20的0.01M pH7.4的PBS緩沖液。

所述檢測原理是根據(jù)凝血酶熒光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110降解產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度值和乙肝病毒表面抗原HBsAg濃度之間的關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，定性定量檢測乙肝病毒表面抗原HBsAg。

通過靜電吸附作用將乙肝病毒記抗體Ab₂和凝血酶酶Thrombin連接到金納米粒子AuNPs上，得到酶聯(lián)檢測探針multi-thrombin-AuNP-Ab₂。將乙肝病毒包被抗體Ab1加入96孔酶標(biāo)板，4℃過夜后用洗滌緩沖液洗滌96孔酶標(biāo)板，加入BSA 37℃封閉處理后用洗滌緩沖液洗滌96孔酶標(biāo)板，在96孔酶標(biāo)板加入待檢樣品37℃下反應(yīng)后用洗滌緩沖液洗滌96孔酶標(biāo)板，加入上述multi-thrombin-AuNP-Ab₂檢測探針37℃下反應(yīng)后用洗滌緩沖液洗滌96孔酶標(biāo)板，加入凝血酶熒光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110，最后用熒光酶標(biāo)儀讀數(shù)。如果檢測樣品有乙肝病毒表面抗原HBsAg存在，探針multi-thrombin-AuNP-Ab₂、HBsAg和包埋在96孔酶標(biāo)板上的乙肝病毒包被抗體Ab₁通過抗體抗原之間的作用，形成一種類似夾心的結(jié)構(gòu)multi-thrombin-AuNP-Ab₂-Ag-Ab₁，此時(shí)凝血酶熒光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110在酶的作用下降解產(chǎn)生熒光；如果檢測樣品沒有HBsAg存在，則96孔酶標(biāo)板的檢測探針multi-thrombin-AuNP-Ab₂將被洗滌緩沖液清洗，此時(shí)凝血酶熒光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110不會(huì)降解，沒有熒光出現(xiàn)。在96孔酶標(biāo)板上加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)HBsAg，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，定性定量檢測HBsAg。

本發(fā)明制備的基于凝血酶熒光底物金球雙標(biāo)記探針檢測乙肝病毒表面抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒；其步驟如下優(yōu)勢在于：

1.采用彈性蛋白酶熒光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110這種具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)的雙酰胺衍生物的羅丹明110(R110)分子探針，由于Rhodamine110具有較大的消光系數(shù)，所以實(shí)驗(yàn)的信噪比很高。此外，相比于普通的熒光素而言，Rhodamine110的熒光在pH3-9之間會(huì)保持穩(wěn)定。

2.采用酶聯(lián)免疫檢測ELISA這種具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)的傳統(tǒng)檢測技術(shù)，有利于提高檢測效率。

3.采用靜電吸附作用乙肝病毒標(biāo)記抗體Ab₂和凝血酶Thrombin連接得到金納米粒子上制備酶聯(lián)檢測探針multi-thrombin-AuNP-Ab₂，夾心結(jié)構(gòu)降解熒光底物產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，定性定量檢測乙肝病毒表面抗原HBsAg，有效地降低了檢測熒光背景。

如圖1所示，凝血酶熒光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110酶裂解后，非熒光雙酰胺底物率先轉(zhuǎn)化為一對(duì)弱熒光的單酰胺，然后轉(zhuǎn)化為強(qiáng)熒光的Rhodamine110，熒光進(jìn)一步增加，實(shí)現(xiàn)超靈敏檢測。如圖2所示，金納米粒子雙標(biāo)記探針，所依賴的原理是帶負(fù)電的金納米粒子和帶正電的靜電吸附。如圖3所示，根據(jù)加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)乙肝病毒表面抗原所得熒光強(qiáng)度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線可知本發(fā)明制備的凝血酶熒光底物金球雙標(biāo)記探針檢測乙肝病毒表面抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測靈敏度較高，達(dá)到1*10^-7IU/mL；圖4根據(jù)加入不同抗原，可知本發(fā)明制備的凝血酶熒光底物金球雙標(biāo)記探針檢測乙肝病毒表面抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒特異性很好。

附圖說明

圖1本發(fā)明制備的基于凝血酶熒光底物金球雙標(biāo)記探針檢測乙肝病毒表面抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒熒光底物分子式及其裂解產(chǎn)物分子式。

圖2本發(fā)明制備的基于凝血酶熒光底物金球雙標(biāo)記探針檢測乙肝病毒表面抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒探針示意圖。

圖3本發(fā)明制備的基于凝血酶熒光底物金球雙標(biāo)記探針檢測乙肝病毒表面抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖4本發(fā)明制備的基于凝血酶熒光底物金球雙標(biāo)記探針檢測乙肝病毒表面抗原的酶聯(lián)免疫試劑盒特異性曲線。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施案例中將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。

實(shí)施案例1：

1)將新制備的5mL 5ng/mL的金納米粒子溶液(Gold nanoparticles,AuNPs)通過0.15M碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)pH為9.0，加入0.1mg凝血酶Thrombin和0.025mg乙肝病毒標(biāo)記抗體Ab₂混合蛋白溶液，充分混勻后室溫下靜置2h，離心得到酶聯(lián)檢測探針multi-thrombin-AuNP-Ab₂，復(fù)溶于BSA的PBS緩沖液中，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

2)將24ug/mL乙肝病毒包被抗體Ab₁加入96孔酶標(biāo)板，靜置過夜處理后用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入10mg/mL BSA封閉處理后再次用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，之后加入標(biāo)準(zhǔn)乙肝病毒表面抗原或乙肝病人血清樣本緩慢搖晃孵育，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入上述酶聯(lián)檢測探針multi-thrombin-AuNP-Ab₂，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，最后加入凝血酶熒光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110，用熒光酶標(biāo)儀讀取96孔酶標(biāo)板熒光強(qiáng)度值。

實(shí)施案例2：

1)將新制備的5mL 5ng/mL的金納米粒子溶液(Gold nanoparticles,AuNPs)通過0.15M碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)pH為9.0，加入0.2mg凝血酶Thrombin和0.05mg乙肝病毒標(biāo)記抗體Ab₂混合蛋白溶液，充分混勻后室溫下靜置2h，離心得到酶聯(lián)檢測探針multi-thrombin-AuNP-Ab₂，復(fù)溶于BSA的PBS緩沖液中，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

2)將24ug/mL乙肝病毒包被抗體Ab₁加入96孔酶標(biāo)板，靜置過夜處理后用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入10mg/mL BSA封閉處理后再次用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，之后加入標(biāo)準(zhǔn)乙肝病毒表面抗原或乙肝病人血清樣本緩慢搖晃孵育，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入上述酶聯(lián)檢測探針multi-thrombin-AuNP-Ab₂，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，最后加入凝血酶熒光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110，用熒光酶標(biāo)儀讀取96孔酶標(biāo)板熒光強(qiáng)度值。

實(shí)施案例3：

1)將新制備的5mL 5ng/mL的金納米粒子溶液(Gold nanoparticles,AuNPs)通過0.15M碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)pH為9.0，加入0.04mg凝血酶Thrombin和0.01mg乙肝病毒標(biāo)記抗體Ab₂混合蛋白溶液，充分混勻后室溫下靜置2h，離心得到酶聯(lián)檢測探針multi-thrombin-AuNP-Ab₂，復(fù)溶于BSA的PBS緩沖液中，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

2)將24ug/mL乙肝病毒包被抗體Ab₁加入96孔酶標(biāo)板，靜置過夜處理后用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入10mg/mL BSA封閉處理后再次用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，之后加入標(biāo)準(zhǔn)乙肝病毒表面抗原或乙肝病人血清樣本緩慢搖晃孵育，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入上述酶聯(lián)檢測探針multi-thrombin-AuNP-Ab₂，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，最后加入凝血酶熒光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110，用熒光酶標(biāo)儀讀取96孔酶標(biāo)板熒光強(qiáng)度值。

實(shí)施案例4：

1)將新制備的5mL 5ng/mL的金納米粒子溶液(Gold nanoparticles,AuNPs)通過0.15M碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)pH為9.0，加入0.0625mg凝血酶Thrombin和0.0625mg乙肝病毒標(biāo)記抗體Ab₂混合蛋白溶液，充分混勻后室溫下靜置2.5h，離心得到酶聯(lián)檢測探針multi-thrombin-AuNP-Ab₂，復(fù)溶于BSA的PBS緩沖液中，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

2)將10ug/mL乙肝病毒包被抗體Ab₁加入96孔酶標(biāo)板，靜置過夜處理后用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入5mg/mL BSA封閉處理后再次用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，之后加入標(biāo)準(zhǔn)乙肝病毒表面抗原或乙肝病人血清樣本緩慢搖晃孵育，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入上述酶聯(lián)檢測探針multi-thrombin-AuNP-Ab₂，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，最后加入凝血酶熒光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110，用熒光酶標(biāo)儀讀取96孔酶標(biāo)板熒光強(qiáng)度值。

實(shí)施案例5：

1)將新制備的5mL 5ng/mL的金納米粒子溶液(Gold nanoparticles,AuNPs)通過0.15M碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)pH為9.0，加入0.1072mg凝血酶Thrombin和0.0178mg乙肝病毒標(biāo)記抗體Ab₂混合蛋白溶液，充分混勻后室溫下靜置3h，離心得到酶聯(lián)檢測探針multi-thrombin-AuNP-Ab₂，復(fù)溶于BSA的PBS緩沖液中，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

2)將50ug/mL乙肝病毒包被抗體Ab₁加入96孔酶標(biāo)板，靜置過夜處理后用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入1mg/mL BSA封閉處理后再次用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，之后加入標(biāo)準(zhǔn)乙肝病毒表面抗原或乙肝病人血清樣本緩慢搖晃孵育，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入上述酶聯(lián)檢測探針multi-thrombin-AuNP-Ab₂，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，最后加入凝血酶熒光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110，用熒光酶標(biāo)儀讀取96孔酶標(biāo)板熒光強(qiáng)度值。

實(shí)施案例6：

1)將新制備的5mL 5ng/mL的金納米粒子溶液(Gold nanoparticles,AuNPs)通過0.15M碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)pH為9.0，加入0.1mg凝血酶Thrombin和0.025mg乙肝病毒標(biāo)記抗體Ab₂混合蛋白溶液，充分混勻后室溫下靜置2h，離心得到酶聯(lián)檢測探針multi-thrombin-AuNP-Ab₂，復(fù)溶于BSA的PBS緩沖液中，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

2)將24ug/mL乙肝病毒包被抗體Ab₁加入96孔酶標(biāo)板，靜置過夜處理后用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入10mg/mL BSA封閉處理后再次用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，之后每孔加入100μL乙肝病毒表面抗原的濃度分別為100U/mL、10U/mL、1U/mL、0.1U/mL、0.01U/mL、0.001U/mL、0.0001U/mL、0U/mL，緩慢搖晃孵育，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入上述酶聯(lián)檢測探針multi-thrombin-AuNP-Ab₂，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，最后加入凝血酶熒光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110，用熒光酶標(biāo)儀讀取96孔酶標(biāo)板熒光強(qiáng)度值。

實(shí)施案例7：

1)將新制備的5mL 5ng/mL的金納米粒子溶液(Gold nanoparticles,AuNPs)通過0.15M碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)pH為9.0，加入0.1mg凝血酶Thrombin和0.025mg乙肝病毒標(biāo)記抗體Ab₂混合蛋白溶液，充分混勻后室溫下靜置2h，離心得到酶聯(lián)檢測探針multi-thrombin-AuNP-Ab₂，復(fù)溶于BSA的PBS緩沖液中，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

2)將24ug/mL乙肝病毒包被抗體Ab₁加入96孔酶標(biāo)板，靜置過夜處理后用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入10mg/mL BSA封閉處理后再次用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，之后每孔加入HCG、BSA、PBS、CEA、CA125、AFP、PSA、CA153抗原，緩慢搖晃孵育，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入上述酶聯(lián)檢測探針multi-thrombin-AuNP-Ab₂，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，最后加入凝血酶熒光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110，用熒光酶標(biāo)儀讀取96孔酶標(biāo)板熒光強(qiáng)度值。