本發(fā)明涉及疾病檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體的是涉及一種基于胰蛋白酶熒光底物檢測卵巢癌腫瘤標(biāo)志物CA125的酶聯(lián)免疫試劑盒制備方法。

背景技術(shù)：

近年來，隨著人們的生活方式發(fā)生了急劇變化，精神壓力也不斷增大，我國腫瘤的發(fā)病率逐年攀升。其中，卵巢癌死亡率在婦科腫瘤中居首位，與乳腺癌不同，卵巢癌早期缺乏明顯癥狀和有效篩查，生存率低。卵巢癌的腫瘤標(biāo)志物根據(jù)其組織病理類型可分為多種亞型，其中上皮來源性腫瘤是最為常見的類型，現(xiàn)有腫瘤標(biāo)志物大多也與卵巢上皮性癌密切相關(guān)，如CA125和人類附睪蛋白4(HE4)等。健康人群血清CA125含量很低，健康成人血清CA125濃度上限為35kU/L。CA125是重要的卵巢癌相關(guān)抗原，聯(lián)合經(jīng)陰道盆腔超聲或其他標(biāo)志物可以提高早期篩查特異性；CA125可用于鑒別良惡性卵巢包塊，絕經(jīng)后女CA125>95kU/L，陽性預(yù)測值達(dá)95％；此外，CA125是觀察療效、判斷有無復(fù)發(fā)的良好指標(biāo)。世界衛(wèi)生組織已經(jīng)作出最新的權(quán)威性的結(jié)論，惡性腫瘤患者如果能在發(fā)病早期發(fā)現(xiàn)，治愈率可以達(dá)到80％以上，所以腫瘤的早期診斷與治療已經(jīng)成為近年來研究的熱點(diǎn)。

由于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA)具有快速、敏感、簡便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。隨著方法的不斷改進(jìn)、材料的不斷更新，尤其是采用基因工程方法制備包被抗原，采用針對某一抗原表位的單克隆抗體進(jìn)行阻斷ELISA試驗(yàn)，都大大提高了ELISA的特異性，加之電腦化程度極高的ELISA檢測儀的使用，使ELISA更為簡便實(shí)用和標(biāo)準(zhǔn)化，從而使其成為最廣泛應(yīng)用的檢測方法之一。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。

胰蛋白酶熒光底物(CBZ-Ala-Arg)₂-R110是一種雙酰胺衍生物的羅丹明110(R110)分子探針，是一個敏感的和有選擇性的測定蛋白酶在溶液中或在活細(xì)胞內(nèi)底物。這些熒光底物含有一種氨基酸或肽共價連接到每個R110的氨基，酶裂解后，非熒光雙酰胺底物轉(zhuǎn)化首先對熒光單酰胺然后R110，在熒光的進(jìn)一步增加。使用熒光酶標(biāo)儀基板可用于連續(xù)測量細(xì)胞提 取物中的酶活性和純化的酶制劑，或用于細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的檢測與分析，流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡等。目前熒光檢測因具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于示蹤、成像以及標(biāo)記等方面，而ELISA則因?yàn)樗撵`敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在檢測領(lǐng)域處于特殊重要的地位。所以本文擬研制基于胰蛋白酶熒光底物檢測卵巢癌腫瘤標(biāo)志物CA125的酶聯(lián)免疫試劑盒，對卵巢癌腫瘤標(biāo)志物CA125進(jìn)行檢測，靈敏度提升了將近10000倍。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于蛋白標(biāo)志物在腫瘤檢測中的重要地位、熒光檢測獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)以及酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)的優(yōu)勢。我們將結(jié)合酶聯(lián)免疫檢測和熒光檢測兩種技術(shù)，利用胰蛋白酶和腫瘤標(biāo)志物相應(yīng)抗體Ab₂制得檢測探針。探針、腫瘤標(biāo)志物和包埋在酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒的另一種腫瘤標(biāo)志物抗體Ab₁通過抗體抗原之間的作用，形成一種類似夾心的結(jié)構(gòu)，最后通過酶和熒光底物的作用產(chǎn)生熒光，對CA125這種卵巢癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行定性定量的檢測，建立蛋白標(biāo)志物檢測的新方法，極大程度提高了檢測靈敏度。

本發(fā)明制備的基于胰蛋白酶熒光底物檢測卵巢癌腫瘤標(biāo)志物CA125的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是選用胰蛋白酶熒光底物(CBZ-Ala-Arg)₂-R110特異性降解產(chǎn)生的熒光對卵巢癌腫瘤標(biāo)志物CA125進(jìn)行定量檢測，其結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種基于胰蛋白酶熒光底物檢測卵巢癌腫瘤標(biāo)志物CA125的酶聯(lián)免疫試劑盒制備方法；其步驟如下：

1)將新配制的高碘酸鈉NalO₄溶液加入到胰蛋白酶Trypsin溶液中，室溫下避光攪拌后，用醋酸鹽緩沖液透析過夜處理，通過加入碳酸鹽緩沖液使體系pH達(dá)到9.0～9.3，立即加入CA125標(biāo)記抗體Ab₂，室溫下避光攪拌后加入少量硼氫化鈉NaBH₄充分反應(yīng)后用PBS緩沖液透析過夜，得到酶聯(lián)檢測探針Trypsin-Ab₂；

2)將CA125包被抗體Ab₁加入96孔酶標(biāo)板，靜置過夜處理后用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入BSA封閉處理后再次用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，之后加入標(biāo)準(zhǔn)CA125抗原緩慢搖晃孵育，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入上述酶聯(lián)檢測探針Trypsin-Ab₂， 用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，最后加入胰蛋白酶熒光底物(CBZ-Ala-Arg)₂-R110，用熒光酶標(biāo)儀讀取96孔酶標(biāo)板熒光強(qiáng)度值。

所述醋酸鹽緩沖液是0.01M pH4.4的緩沖液；碳酸鹽緩沖液是0.2M pH9.5的緩沖液；PBS緩沖液是0.15M pH7.4的緩沖液。

所述胰蛋白酶：高碘酸鈉質(zhì)量比為1:0.8～1.2；胰蛋白酶：CA125標(biāo)記抗體質(zhì)量比為1:1～5；胰蛋白酶：硼氫化鈉質(zhì)量比為15:1。

所述CA125包被抗體Ab₁濃度為10～50μg/mL。

所述洗滌緩沖液是含有0.05～0.5％Tween-20的0.01M pH7.4的PBS緩沖液。

所述檢測原理是根據(jù)胰蛋白酶熒光底物(CBZ-Ala-Arg)₂-R110降解產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度值和CA125標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度之間的關(guān)系，定性定量檢測卵巢癌腫瘤標(biāo)志物CA125。

通過高碘酸鈉NalO₄作用將CA125記抗體Ab₂和胰蛋白酶Trypsin連接，得到酶聯(lián)檢測探針Trypsin-Ab₂。將CA125包被抗體Ab1加入96孔酶標(biāo)板，4℃過夜后用洗滌緩沖液洗滌96孔酶標(biāo)板，加入BSA 37℃封閉處理后用洗滌緩沖液洗滌96孔酶標(biāo)板，在96孔酶標(biāo)板加入待檢樣品37℃下反應(yīng)后用洗滌緩沖液洗滌96孔酶標(biāo)板，加入上述Trypsin-Ab₂檢測探針37℃下反應(yīng)后用洗滌緩沖液洗滌96孔酶標(biāo)板，加入胰蛋白酶熒光底物(CBZ-Ala-Arg)₂-R110，最后用熒光酶標(biāo)儀讀數(shù)。如果檢測樣品有CA125抗原Ag存在，探針Trypsin-Ab₂、CA125抗原Ag和包埋在96孔酶標(biāo)板上的CA125包被抗體Ab₁通過抗體抗原之間的作用，形成一種類似夾心的結(jié)構(gòu)Trypsin-Ab₂-Ag-Ab₁，此時胰蛋白酶熒光底物(CBZ-Ala-Arg)₂-R110在酶的作用下降解產(chǎn)生熒光；如果檢測樣品沒有CA125抗原Ag存在，則96孔酶標(biāo)板的檢測探針Trypsin-Ab₂將被洗滌緩沖液清洗，此時胰蛋白酶熒光底物(CBZ-Ala-Arg)₂-R110不會降解，沒有熒光出現(xiàn)。在96孔酶標(biāo)板上加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)CA125抗原，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，定性定量檢測卵巢癌腫瘤標(biāo)志物CA125。

本發(fā)明制備的基于胰蛋白酶熒光底物檢測卵巢癌腫瘤標(biāo)志物CA125的酶聯(lián)免疫試劑盒優(yōu)勢在于：

1.采用胰蛋白酶熒光底物(CBZ-Ala-Arg)₂-R110這種具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)的雙酰胺衍生物的羅丹明110(R110)分子探針，通過酶的放大作用，將極大的提高檢測靈敏度，降低檢測非特異性吸附。

2.采用酶聯(lián)免疫檢測ELISA這種具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)的傳統(tǒng)檢測技術(shù)，有利于調(diào)高檢測效率。

3.采用高碘酸鈉NalO₄作用將CA125記抗體Ab₂和胰蛋白酶Trypsin連接得到酶聯(lián)檢測探針Trypsin-Ab₂，夾心結(jié)構(gòu)降解熒光底物產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，定性定量檢測卵巢癌腫瘤標(biāo)志物CA125，有效地降低了檢測熒光背景。

如圖1所示，胰蛋白酶熒光底物(CBZ-Ala-Arg)₂-R110酶裂解后，非熒光雙酰胺底物率先轉(zhuǎn)化為一對弱熒光的單酰胺，然后轉(zhuǎn)化為強(qiáng)熒光的R110，熒光進(jìn)一步增加，實(shí)現(xiàn)超靈敏檢測。如圖2所示，根據(jù)熒光酶標(biāo)儀可知加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)CA125抗原所得熒光強(qiáng)度分別是194335、284399、302187、316222、349462、374451、421623；圖3紫外照片也可以看出隨著CA125抗原濃度的增加酶標(biāo)板孔熒光強(qiáng)度依次增加。

附圖說明

圖1本發(fā)明制備的基于胰蛋白酶熒光底物檢測卵巢癌腫瘤標(biāo)志物CA125的酶聯(lián)免疫試劑盒底物降解圖。

圖2本發(fā)明制備的基于胰蛋白酶熒光底物檢測卵巢癌腫瘤標(biāo)志物CA125的酶聯(lián)免疫試劑盒熒光值曲線。

圖3本發(fā)明制備的基于胰蛋白酶熒光底物檢測卵巢癌腫瘤標(biāo)志物CA125的酶聯(lián)免疫試劑盒紫外激發(fā)照片。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施案例中將對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。

實(shí)施案例1：

1)將新配制的0.2mL高碘酸鈉NalO₄溶液(21.39mg/mL)加入到1mL胰蛋白酶Trypsin溶液(5mg/mL)中，室溫下避光攪拌20min后，用1mM PH4.4醋酸鹽緩沖液透析過夜處理，通過加入20μL 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液使體系pH達(dá)到9.0，立即加入10mg CA125標(biāo)記抗體Ab₂，室溫下避光攪拌2h后加入0.1mL硼氫化鈉NaBH₄(4mg/mL)充分反應(yīng)后用0.15M PH7.4PBS緩沖液透析過夜，得到酶聯(lián)檢測探針Trypsin-Ab₂；

2)將100μL CA125包被抗體Ab₁(24μg/mL)加入96孔酶標(biāo)板，4℃靜置過夜處理后用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封閉1h處理后再次用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，之后加入100μL CA125標(biāo)準(zhǔn)抗原緩慢搖晃孵育，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入100μL上述酶聯(lián)檢測探針Trypsin-Ab₂稀釋液，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，最后加入100μL胰蛋白酶熒光底物(CBZ-Ala-Arg)₂-R110，用熒光酶標(biāo)儀讀取96孔酶標(biāo)板熒光強(qiáng)度值。

實(shí)施案例2：

1)將新配制的0.2mL高碘酸鈉NalO₄溶液(20mg/mL)加入到1mL胰蛋白酶Trypsin溶液(5mg/mL)中，室溫下避光攪拌20min后，用1mM PH4.4醋酸鹽緩沖液透析過夜處理，通過加入20μL 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液使體系pH達(dá)到9.0，立即加入10mg CA125標(biāo)記抗體Ab₂，室溫下避光攪拌2h后加入0.1mL硼氫化鈉NaBH₄(4mg/mL)充分反應(yīng)后用0.15M PH7.4PBS緩沖液透析過夜，得到酶聯(lián)檢測探針Trypsin-Ab₂；

2)將100μL CA125包被抗體Ab₁(24μg/mL)加入96孔酶標(biāo)板，4℃靜置過夜處理后用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封閉1h處理后再次用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，之后加入100μL CA125標(biāo)準(zhǔn)抗原緩慢搖晃孵育，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入100μL上述酶聯(lián)檢測探針Trypsin-Ab₂稀釋液，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，最后加入100μL胰蛋白酶熒光底物(CBZ-Ala-Arg)₂-R110，用熒光酶標(biāo)儀讀取96孔酶標(biāo)板熒光強(qiáng)度值。

實(shí)施案例3：

1)將新配制的0.2mL高碘酸鈉NalO₄溶液(30mg/mL)加入到1mL胰蛋白酶Trypsin溶液(5mg/mL)中，室溫下避光攪拌20min后，用1mM PH4.4醋酸鹽緩沖液透析過夜處理，通過加入20μL 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液使體系pH達(dá)到9.0，立即加入10mg CA125標(biāo)記抗體Ab₂，室溫下避光攪拌2h后加入0.1mL硼氫化鈉NaBH₄(4mg/mL)充分反應(yīng)后用0.15M PH7.4PBS緩沖液透析過夜，得到酶聯(lián)檢測探針Trypsin-Ab₂；

2)將100μL CA125包被抗體Ab₁(24μg/mL)加入96孔酶標(biāo)板，4℃靜置過夜處理后用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封閉1h處理后再次用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，之后加入100μL CA125標(biāo)準(zhǔn)抗原緩慢搖晃孵育，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入100μL上述酶聯(lián)檢測探針Trypsin-Ab₂稀釋液，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，最后加入100μL胰蛋白酶熒光底物(CBZ-Ala-Arg)₂-R110，用熒光酶標(biāo)儀讀取96孔酶標(biāo)板熒光強(qiáng)度值。

實(shí)施案例4：

1)將新配制的0.2mL高碘酸鈉NalO₄溶液(20mg/mL)加入到1mL胰蛋白酶Trypsin溶液(5mg/mL)中，室溫下避光攪拌20min后，用1mM PH4.4醋酸鹽緩沖液透析過夜處理，通過加入20μL 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液使體系pH達(dá)到9.2，立即加入5mg CA125標(biāo)記抗體Ab₂，室溫下避光攪拌2h后加入0.1mL硼氫化鈉NaBH₄(4mg/mL)充分反應(yīng)后用0.15M PH7.4PBS緩沖液透析過夜，得到酶聯(lián)檢測探針Trypsin-Ab₂；

2)將100μL CA125包被抗體Ab₁(10μg/mL)加入96孔酶標(biāo)板，4℃靜置過夜處理后用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封閉1h處理后再次用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，之后加入100μL CA125標(biāo)準(zhǔn)抗原緩慢搖晃孵育，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入100μL上述酶聯(lián)檢測探針Trypsin-Ab₂稀釋液，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，最后加入100μL胰蛋白酶熒光底物(CBZ-Ala-Arg)₂-R110，用熒光酶標(biāo)儀讀取96孔酶標(biāo)板熒光強(qiáng)度值。

實(shí)施案例5：

1)將新配制的0.2mL高碘酸鈉NalO₄溶液(20mg/mL)加入到1mL胰蛋白酶Trypsin溶液(5mg/mL)中，室溫下避光攪拌20min后，用1mM PH4.4醋酸鹽緩沖液透析過夜處理，通過加入20μL 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液使體系pH達(dá)到9.3，立即加入25mg CA125標(biāo)記抗體Ab₂，室溫下避光攪拌2h后加入0.1mL硼氫化鈉NaBH₄(4mg/mL)充分反應(yīng)后用0.15M PH7.4PBS緩沖液透析過夜，得到酶聯(lián)檢測探針Trypsin-Ab₂；

2)將100μL CA125包被抗體Ab₁(50μg/mL)加入96孔酶標(biāo)板，4℃靜置過夜處理后用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入300μL BSA(50mg/mL)37℃封閉1h處理后再次用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，之后加入100μL CA125標(biāo)準(zhǔn)抗原緩慢搖晃孵育，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入100μL上述酶聯(lián)檢測探針Trypsin-Ab₂稀釋液，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，最后加入100μL胰蛋白酶熒光底物(CBZ-Ala-Arg)₂-R110，用熒光酶標(biāo)儀讀取96孔酶標(biāo)板熒光強(qiáng)度值。

實(shí)施案例6：

1)將新配制的0.2mL高碘酸鈉NalO₄溶液(20mg/mL)加入到1mL胰蛋白酶Trypsin溶液(5mg/mL)中，室溫下避光攪拌20min后，用1mM PH4.4醋酸鹽緩沖液透析過夜處理，通過加入20μL 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液使體系pH達(dá)到9.0，立即加入10mg CA125標(biāo)記抗體Ab₂，室溫下避光攪拌2h后加入0.1mL硼氫化鈉NaBH₄(4mg/mL)充分反應(yīng)后用0.15M PH7.4PBS緩沖液透析過夜，得到酶聯(lián)檢測探針Trypsin-Ab₂；

2)將100μL CA125包被抗體Ab₁(24μg/mL)加入96孔酶標(biāo)板，4℃靜置過夜處理后用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封閉1h處理后再次用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，之后每孔加入100μL CA125標(biāo)準(zhǔn)抗原的濃度分別為100U/mL、10U/mL、1U/mL、0.1U/mL、0.01U/mL、0.001U/mL、0U/mL，緩慢搖晃孵育，用洗滌緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，加入100μL上述酶聯(lián)檢測探針Trypsin-Ab₂稀釋液，用洗滌 緩沖液沖洗96孔酶標(biāo)板，最后加入100μL胰蛋白酶熒光底物(CBZ-Ala-Arg)₂-R110，用熒光酶標(biāo)儀讀取96孔酶標(biāo)板熒光強(qiáng)度值。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

如圖2所示，根據(jù)熒光酶標(biāo)儀可知加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)甲胎蛋白抗原所得熒光強(qiáng)度分別是194335、284399、302187、316222、349462、374451、421623 。