本發(fā)明涉及基Annexin A1蛋白的一種白血病檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及：檢測(cè)受試者中Annexin A1蛋白表達(dá)水平的方法；受試者中Annexin A1蛋白的表達(dá)水平在白血病病人檢測(cè)中的用途；以及涉及一種試劑盒產(chǎn)品，其包括作為活性成分的Annexin A1蛋白的抗體和包括涉及該產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)。
背景技術(shù)：
癌癥是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病，目前全球癌癥死亡人數(shù)高于艾滋病、結(jié)核病和瘧疾死亡人數(shù)的總和，已成為全球頭號(hào)殺手。2015年6月2日，美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)議落幕，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的《全球癌癥報(bào)告2014》，2012年全球癌癥患者和死亡病例均有所增加，新增癌癥病例有近一半出現(xiàn)在亞洲，其中大部分在中國(guó)，中國(guó)新增癌癥病例高居第一位。該報(bào)告預(yù)測(cè)全球癌癥病例將呈現(xiàn)迅猛增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，由2012年的1400萬(wàn)人，逐年遞增至2025年的1900萬(wàn)人，到2035年將達(dá)到2400萬(wàn)人。而白血病是一類(lèi)造血系統(tǒng)的惡性疾病，是國(guó)內(nèi)十大高發(fā)惡性腫瘤之一，占腫瘤發(fā)病率的第六位，在我國(guó)各年齡組惡性腫瘤的死亡率中分別占男性的第6位和女性的第8位，在兒童及35歲以下的死亡率中占第1位。WHO預(yù)計(jì)，在全球范圍內(nèi)，新增癌癥病例和癌癥患者死亡率也將會(huì)以每年1％的速度遞增，而在中國(guó)、俄羅斯和印度這些國(guó)家增長(zhǎng)速度會(huì)更快，估計(jì)到2030年全球?qū)⒖赡苡?500萬(wàn)人遭受癌癥的折磨，將新增2700萬(wàn)癌癥病例，死于癌癥的人數(shù)將達(dá)到1700萬(wàn)人，這一數(shù)字對(duì)許多國(guó)家的健康護(hù)理體系來(lái)說(shuō)是難以承受的。
Annexin A1蛋白是于30年前發(fā)現(xiàn)的首個(gè)annexins蛋白超家族成員，分子量為37kDa，其羧基末端擁有4個(gè)高度保守的70個(gè)氨基酸重復(fù)序列能夠以Ca2+依賴(lài)的模式與負(fù)電荷的膜磷脂相結(jié)合，其氨基末端(49個(gè)氨基酸殘基)包含了磷酸化和蛋白水解位點(diǎn)(可以水解產(chǎn)生33kDa的N末端切割產(chǎn)物)，承擔(dān)了Annexin A1蛋白特異的生物學(xué)功能[1]。最初鑒定的Annexin A1蛋白活性是作為磷脂酶A2(PLA2)的抑制劑，被認(rèn)為具有抗炎的活性[2,3]，進(jìn)一步研究顯示其在先天免疫/適應(yīng)性免疫和對(duì)抗細(xì)菌感染中也發(fā)揮了重要作用[4-6]。也有研究顯示Annexin A1蛋白還具有調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA復(fù)制、離子通道形成、細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等特性[7-9]。而目前尚未見(jiàn)ANXA1在白血病中表達(dá)情況的相關(guān)研究報(bào)道。
由于Annexin A1蛋白的序列已經(jīng)明確，Annexin A1蛋白的商業(yè)化抗體已成熟，該抗體的產(chǎn)生對(duì)于研究基于Annexin A1蛋白的相關(guān)疾病提供了諸多便利。目前還未見(jiàn)關(guān)于Annexin A1蛋白作為試劑盒在白血病檢測(cè)領(lǐng)域的相關(guān)研究報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了向在正常體檢中的人們提供檢測(cè)發(fā)現(xiàn)白血病可能性的新途徑或提供更廣泛的選擇，本發(fā)明的發(fā)明人研究首次發(fā)現(xiàn)：與健康人相比，Annexin A1蛋白在白血病患者外周血白細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)。
因此，本發(fā)明一方面提供了一種檢測(cè)受試者可能患白血病的方法，其包括在所述受試者中檢測(cè)Annexin A1蛋白的表達(dá)水平。
本發(fā)明的另一方面提供了Annexin A1蛋白的抗體在制備用于檢測(cè)受試者是否患有白血病或是否具有患有白血病風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒中的用途。優(yōu)選地，所述的檢測(cè)是通過(guò)檢測(cè)受試者外周血中Annexin A1蛋白表達(dá)水平而進(jìn)行的。示例性地，如果受試者周血中Annexin A1蛋白表達(dá)水平是正常對(duì)照組的1.3-100倍或更高，則可以判定該受試者患有白血病或具有患有白血病風(fēng)險(xiǎn)。例如，本發(fā)明所述的高表達(dá)是指是對(duì)照組(健康組)表達(dá)水平的1.3倍、1.31倍、1.32倍、1.33倍、1.34倍、1.35倍、1.36倍、1.37倍、1.38倍、1.39倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍或更高。
本發(fā)明的再一方面提供了一種檢測(cè)受試者是否患有白血病或是否具有患有白血病風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其包括作為活性成分的Annexin A1蛋白的抗體；以及包括該涉及抗體產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)。
在本發(fā)明中，其中所述的Annexin A1蛋白的抗體是指與Annexin A1蛋白特異性結(jié)合的抗體，例如特異性與Annexin A1蛋白結(jié)合的單克隆抗體或者多克隆抗體。
對(duì)于本發(fā)明所述的受試者，其優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為人。
本發(fā)明的發(fā)明人出乎意料的發(fā)現(xiàn)，受試者外周血中Annexin A1蛋白的表達(dá)水平與該受試者是否患有白血病或者是否具有患白血病的風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。例如，如果受試者外周血中Annexin A1蛋白的表達(dá)水平相對(duì)健康受試者是高表達(dá)的，則可診斷為該受試者患有白血病或者具有患白血病的風(fēng)險(xiǎn)。這對(duì)于早發(fā)現(xiàn)白血病并進(jìn)行及時(shí)治療贏得了時(shí)間。
示例性地，本發(fā)明的試劑盒、檢測(cè)或者用途可以作為診斷白血病的輔助手段。也就是說(shuō)，醫(yī)生或者其他醫(yī)務(wù)人員可以結(jié)合受試者其他的理化指標(biāo)或影像結(jié)果給出受試者的診斷結(jié)果。
如本文所使用的，“包含”、“包括”、“含有”或“特征在于”同義，并且是包括在內(nèi)的或開(kāi)放性的，并且不排除另外的未陳述的元件或方法步驟。術(shù)語(yǔ)“包含”在本文中的任何表述，特別是在描述本發(fā)明的方法、用途或產(chǎn)品時(shí)，應(yīng)理解為包括基本上由所述組分或元件或步驟組成和由所述組分或元件或步驟組成的那些產(chǎn)品、方法和用途。本文示例性描述的本發(fā)明適當(dāng)?shù)乜梢栽诓淮嬖诒疚奈淳唧w公開(kāi)的任何一種或多種元件、一種或多種限制的情況下進(jìn)行實(shí)踐。
本文已采用的術(shù)語(yǔ)和表述用作描述性而不是限制性術(shù)語(yǔ)，并且在此種術(shù)語(yǔ)和表述的使用中不預(yù)期排除所示和所述特征或其部分的任何等價(jià)物，但應(yīng)認(rèn)識(shí)到各種修飾在請(qǐng)求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解盡管本發(fā)明已通過(guò)優(yōu)選實(shí)施方案和任選特征具體公開(kāi)，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用本文公開(kāi)的概念的修飾和變化，并且此類(lèi)修飾和變化被視為在如由附加權(quán)利要求定義的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
附圖說(shuō)明
圖1為受試者外周血中Annexin A1蛋白表達(dá)水平的代表性Western blotting圖片，其中P代表patient，指白血病患者；V代表volunteers，指健康志愿者。
為更清楚地說(shuō)明本發(fā)明，現(xiàn)結(jié)合如下實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但這些實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的示例性描述，并不能解釋為對(duì)本申請(qǐng)的限制。
實(shí)施例
1.材料和方法
1.1細(xì)胞株及抗體
人慢性粒性白血病細(xì)胞K562購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)。Annexin A1蛋白的兔源一抗抗體購(gòu)自巴傲德生物科技有限公司，使用時(shí)按1：1000比例稀釋?zhuān)备^(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔的二抗購(gòu)自巴傲德生物科技有限公司，使用時(shí)按1：5000稀釋。內(nèi)參抗體GAPDH同樣購(gòu)自巴傲德，使用時(shí)按1：10000稀釋。
1.2白血病病人和正常人血液樣品
白血病病人外周血取自浙江省人民醫(yī)院血液科。正常人外周血取自浙江省中醫(yī)院下沙院區(qū)體檢中心。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)
將K562細(xì)胞培養(yǎng)于含10％FBS(Fetal bovine serum)的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培養(yǎng)基中(含谷氨酰胺、10mM HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)、1.0mM丙酮酸鈉、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)，于37℃、5％CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，每3天傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備蛋白樣品并于-80度保存，用于與白血病病人蛋白樣品以及健康志愿者蛋白樣品一起做Western blotting檢測(cè)。
1.2.2全血樣品中白細(xì)胞分離方法
將正常人或白血病患者的外周血樣4℃,450g(約2300rpm)離心10min，取血清于干凈的1.5mL的EP管中，于—80℃下保存；往剩余血紅色沉淀中加約3倍體積的紅細(xì)胞裂解液，輕輕渦旋或顛倒搖勻后，冰上裂解15min，其間輕輕渦旋混勻兩次；再4℃450g離心10min以沉淀白細(xì)胞，小心吸棄上清液。重復(fù)此步驟1-2次直到得到白色沉淀。再加1mL PBS，450g，4℃離心5min，棄上清，重復(fù)1-2次。再按所得的白細(xì)胞的量加適量的RIPA全細(xì)胞裂解液(含有10mM的PMSF10％)。在震動(dòng)器上劇烈震蕩后，于冰上充分裂解30min，再于—80℃下保存后與K562細(xì)胞蛋白樣品同時(shí)做Western blotting檢測(cè)。
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
Annexin A1蛋白在正常體檢志愿者和白血病患者外周血白細(xì)胞中的表達(dá)水平
Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示：正常志愿者外周血白細(xì)胞中Annexin A1蛋白呈現(xiàn)低水平的表達(dá)或不表達(dá)，而相比于正常志愿者，白血病患者外周血白細(xì)胞中Annexin A1蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)(見(jiàn)圖1)。
表1綜合了所研究的30例白血病病人的相關(guān)資料，包括患者年齡、性別、白血病分型，以及外周血白細(xì)胞中Annexin A1蛋白的表達(dá)水平，如圖1中P16是V1的6.18倍，P17是V1的3.67倍，P11是V1的1.64倍，P15是V1的1.29倍，P19是V1的3.32倍，P12是V3的14.22倍，P13是V3的7.90倍，P28是V3的2.84倍，P29是V3的7.74倍，P30是V3的8.57倍，P17是V5的2.49倍，P17是V6的2.88倍，P17是V7的2.40倍，P17是V8的2.68倍，P17是V9的2.66倍，P19是V10的7.27倍，P19是V11的7.78倍，P19是V12的7.50倍，P19是V13的7.38倍，P19是V14的11.41倍，P19是V15的5.57倍，P15是V10的3.74倍，P15是V11的3.99倍，P15是V12的3.85倍，P15是V13的3.79倍，P15是V14的5.87倍，P15是V15的2.86倍，。從表1中可以看出Annexin A1蛋白在白血病患者中呈現(xiàn)高陽(yáng)性率的檢出，陽(yáng)性率高達(dá)86.7％。
表1：所檢測(cè)的30例白血病病人中Annexin A1蛋白的表達(dá)水平
由此可見(jiàn)，將Annexin A1蛋白的抗體做成一種ELISA試劑盒，利用該試劑盒來(lái)在體檢中檢測(cè)受試者外周血中Annexin A1蛋白的表達(dá)水平，通過(guò)該檢測(cè)可以高準(zhǔn)確率的檢測(cè)出受試者是否患有白血病的可能性。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在本發(fā)明的實(shí)踐中采用除具體例示那些外的方法和原材料等而無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)。任何此類(lèi)方法和原材料等的所有的本領(lǐng)域已知的功能等價(jià)物都預(yù)期包括在本發(fā)明中。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)理解，可對(duì)本說(shuō)明書(shū)及權(quán)利要求書(shū)中描述的本發(fā)明進(jìn)行各種變動(dòng)和修飾，且本發(fā)明包括所有此類(lèi)變動(dòng)和修飾。本發(fā)明還包括本說(shuō)明書(shū)中單獨(dú)或同時(shí)提及或指出的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及所述步驟或特征中的任何2個(gè)或更多個(gè)的任何和所有組合。
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