本發(fā)明涉及多診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
：通常，用于診斷疾病如恙蟲病、鉤端螺旋體病和腎綜合征出血熱的技術(shù)主要以以下方式進(jìn)行：將生物樣品(如被懷疑感染了以上疾病的患者的血液或尿液)涂到診斷試紙條上并且檢查其與所述試紙條上的固定物的反應(yīng)，由此確定患者是否感染了以上疾病。然而，這類技術(shù)只可用于診斷單一疾病，為了檢查多種疾病的感染，必須獨(dú)立地進(jìn)行各個(gè)測(cè)試并且必須注入多個(gè)生物樣品，因此診斷過程非常復(fù)雜。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：因此，考慮到相關(guān)技術(shù)中遇到的問題而做出了本發(fā)明，本發(fā)明旨在提供多診斷試劑盒，其可以快速且簡單地診斷恙蟲病、鉤端螺旋體病和腎綜合征出血熱的感染。通過以下說明書，結(jié)合附圖，將清楚地理解本發(fā)明。本發(fā)明的實(shí)施方案提供包括試紙條的多診斷試劑盒，所述試紙條包含恙蟲抗原蛋白、鉤端螺旋體抗原和腎綜合征出血熱抗原蛋白，所述恙蟲抗原蛋白含有恙蟲病東方體(orientiatsutsugamushi)gilliam、karp和kato的56kda融合蛋白(cr56)和恙蟲病東方體kangwon的56kda蛋白(kr56)。所述鉤端螺旋體抗原可包含從鉤端螺旋體的脂多糖(lps)中制備的核心多糖和o-特異側(cè)鏈。所述腎綜合征出血熱抗原蛋白可包含核殼體蛋白，所述核殼體蛋白是從soochong病毒制備的并具有來自真核細(xì)胞的seqidno：2或3的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，多診斷試劑盒可檢測(cè)恙蟲病、鉤端螺旋體病和腎綜合征出血熱的感染。所述多診斷試劑盒可通過單次注入生物樣品而同時(shí)診斷多種疾病的感染。此外，所述多診斷試劑盒不包含任何非特異性抗體，從而確保高度精確的診斷結(jié)果。附圖說明從以下的詳細(xì)說明書并結(jié)合附圖，將更清楚地理解本發(fā)明的上述以及其它特征和優(yōu)點(diǎn)，其中：圖1示出了本發(fā)明的實(shí)施方案的多診斷試劑盒；圖2示出了本發(fā)明的實(shí)施方案的多診斷試劑盒的試紙條；圖3示出了本發(fā)明的實(shí)施方案的依賴恙蟲抗原蛋白濃度的試劑盒的反應(yīng)；圖4示出了本發(fā)明的實(shí)施方案的依賴恙蟲抗原蛋白組成的試劑盒的反應(yīng)；圖5示出了純化的多糖的抗原性，其是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案從patoc型和lai型中分離的多糖的sds-page(a)和蛋白質(zhì)印跡法(b)的結(jié)果；圖6示出了本發(fā)明的實(shí)施方案的核殼體蛋白(np)、完整的np(cnp)和截短的np(cnp)在soochong病毒的s區(qū)段的基因結(jié)構(gòu)；圖7示出了本發(fā)明的實(shí)施方案的聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)之后的tnp的dna條帶(約370bp)和cnp的dna條帶(約1300bp)；圖8示出了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案將tnp的dna和cnp的dna克隆到pgem-t-easypcr克隆載體中；圖9示出了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案將pgt-soov2-tnp和pgt-soov2-cnp的pcr產(chǎn)物克隆到在n-末端具有his-taq的桿狀病毒質(zhì)粒載體中；圖10示出了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案使用桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)從pbac-soov2-tnp和pbac-soov2-cnp形成bac-soov2-tnp和bac-soov2-cnp；圖11示出了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案使用患者血清和正常血清檢測(cè)tnp的蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果；以及圖12示出了本發(fā)明的實(shí)施方案的tnp和cnp的純化的粒狀沉淀(pellet)的蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果。具體實(shí)施方式在下文中，將對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本發(fā)明不限于本文所公開的實(shí)施方案，而是可以被修改為不同形式。提供這些實(shí)施方案是為了詳盡地解釋本公開內(nèi)容并將本發(fā)明的精神充分地傳達(dá)給本領(lǐng)域技術(shù)人員。因此，所提出這些實(shí)施方案不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明。盡管術(shù)語如“第一”、“第二”等用于描述各種要素，但所述要素不應(yīng)被此類術(shù)語所限制。這些術(shù)語僅用于將要素彼此區(qū)分。此外，當(dāng)?shù)谝灰乇幻枋鰹樵O(shè)置在第二要素上時(shí)，意味著第一要素可直接地形成于第二要素上，或在第一和第二要素之間可插入第三要素。在所有附圖中，可能夸大地描繪要素的尺寸或要素的相對(duì)尺寸以提供對(duì)本發(fā)明的容易理解的描述。此外，由于制造方法的變化，附圖中所示的要素的形狀可稍微改變。因此，除非另有說明，應(yīng)理解，本發(fā)明的實(shí)施方案并不僅限于附圖中所示的形狀，一些修改可并入其中。如本文所用，術(shù)語“恙蟲病”是由恙蟲病東方體引起的疾病。如本文所用，術(shù)語“鉤端螺旋體病”是由鉤端螺旋體屬(leptospira)的致病螺旋茵引起的疾病。如本文所用，術(shù)語“腎綜合征出血熱”是由漢他(hantaan)病毒和漢城(seoul)病毒引起的疾病。如本文所用，術(shù)語“診斷”指病理學(xué)狀態(tài)的存在或特征的確定，并且在本發(fā)明中，診斷用來鑒定恙蟲病、鉤端螺旋體病和腎綜合征出血熱。如本文所用，術(shù)語“樣品”指被懷疑感染了恙蟲病、鉤端螺旋體病和腎綜合征出血熱的哺乳動(dòng)物——包括人——的血液、血清和血漿。圖1示出了本發(fā)明的實(shí)施方案的多診斷試劑盒，圖2示出了本發(fā)明的實(shí)施方案的多診斷試劑盒的試紙條。參照?qǐng)D1和2，多診斷試劑盒10可包括試紙條100，試紙條100可包括第一試紙條100a和第二試紙條100b。第一試紙條100a和第二試紙條100b可檢測(cè)來自樣品的恙蟲抗體、鉤端螺旋體抗體和腎綜合征出血熱抗體。第一試紙條100a可檢測(cè)恙蟲igm抗體、鉤端螺旋體igm抗體和腎綜合征出血熱igm抗體，第二試紙條100b可檢測(cè)恙蟲igg抗體、鉤端螺旋體igg抗體和腎綜合征出血熱igg抗體。第一試紙條100a和第二試紙條100b中的每一個(gè)可包括支撐件110、反應(yīng)膜120、樣品墊130、金標(biāo)墊(goldconjugatepad)140、預(yù)反應(yīng)線150、反應(yīng)線160、對(duì)照線170、以及吸收墊180。支撐件110是試紙條100的基層，且在支撐件110上可設(shè)置反應(yīng)膜120、樣品墊130、金標(biāo)墊140和吸收墊180。反應(yīng)膜120可為硝酸纖維素膜。在反應(yīng)膜120上可設(shè)置預(yù)反應(yīng)線150、反應(yīng)線160和對(duì)照線170。預(yù)反應(yīng)線150、反應(yīng)線160和對(duì)照線170可以以2.0至4.5mm的間隔設(shè)置。樣品墊130可吸收經(jīng)由樣品注入口200注入的樣品。第一試紙條100a的樣品墊130可通過以下步驟制造：浸入含有50mmtris(ph8.0)、1％吐溫20、0.5mnacl和0.1％nan3的溶液中，然后干燥。第二試紙條100b的樣品墊130可通過以下步驟制造：浸入含有50mmtris(ph8.0)、1％吐溫20、0.2％bsa和0.1％nan3的溶液，然后干燥。金標(biāo)墊140可被設(shè)置成與樣品墊130重疊。被吸收到樣品墊130的樣品可通過毛細(xì)作用被移動(dòng)到金標(biāo)墊140中。金標(biāo)墊140可包含標(biāo)志抗體(markerantibody)。所述標(biāo)志抗體可包含金標(biāo)抗人igm、金標(biāo)抗人igg和金標(biāo)雞igy。所包含的金標(biāo)抗人igm的濃度可為od1至3，所包含的金標(biāo)抗人igg的濃度可為od2至4，所包含的金標(biāo)雞igy的濃度可為od0.1至1。第一試紙條100a可包含金標(biāo)抗人igm和金標(biāo)雞igy，第二試紙條100b可包含金標(biāo)抗人igg和金標(biāo)雞igy。所述標(biāo)志抗體可與所述恙蟲抗體、鉤端螺旋體抗體以及腎綜合征出血熱抗體結(jié)合，由此形成復(fù)合物。金標(biāo)墊140可被設(shè)置成與反應(yīng)膜120重疊，由此可使所述復(fù)合物向反應(yīng)膜120移動(dòng)。可使未與所述恙蟲抗體、鉤端螺旋體抗體以及腎綜合征出血熱抗體結(jié)合的剩余抗體向反應(yīng)膜120移動(dòng)。所述標(biāo)志抗體可包含有色顆粒。所述有色顆粒可為膠體金顆粒、有色玻璃或塑料珠。反應(yīng)線160可包括第一反應(yīng)線161、第二反應(yīng)線162和第三反應(yīng)線163。第一反應(yīng)線161可包含鉤端螺旋體抗原。所述鉤端螺旋體抗原可包含源自鉤端螺旋體的脂多糖的核心多糖和o-特異側(cè)鏈。所包含的鉤端螺旋體抗原的濃度可為2至4mg/ml。在樣品包含鉤端螺旋體抗體的情況下，所述鉤端螺旋體抗體可與金標(biāo)墊140中的標(biāo)志抗體結(jié)合，由此形成復(fù)合物。當(dāng)所述復(fù)合物經(jīng)過第一反應(yīng)線161時(shí)，所述鉤端螺旋體抗體可與第一反應(yīng)線161的鉤端螺旋體抗原結(jié)合。這種結(jié)合使得所述標(biāo)志抗體的有色顆粒能夠在第一反應(yīng)線161中沉淀析出，從而形成紫紅色條帶。第二反應(yīng)線162可包含恙蟲抗原蛋白。所述恙蟲抗原蛋白可包含以5∶3的體積比混合的恙蟲病東方體gilliam、karp和kato的56kda基因重組蛋白和恙蟲病東方體kangwon的56kda蛋白。所包含的恙蟲抗原蛋白的濃度可為0.4至0.8mg/ml。在樣品包含恙蟲抗體的情況下，所述恙蟲抗體可與金標(biāo)墊140中的標(biāo)志抗體結(jié)合，由此形成復(fù)合物。當(dāng)所述復(fù)合物經(jīng)過第二反應(yīng)線162時(shí)，所述恙蟲抗體可與第二反應(yīng)線162的恙蟲抗原蛋白結(jié)合。這種結(jié)合使得所述標(biāo)志抗體的有色顆粒能夠在第二反應(yīng)線162中沉淀析出，從而形成紫紅色條帶。第三反應(yīng)線163可包含腎綜合征出血熱抗原蛋白。所述腎綜合征出血熱抗原蛋白可包含源自soochong病毒的具有seqidno：2的氨基酸序列的完整的核殼體蛋白(cnp)或源自soochong病毒的具有seqidno：3的氨基酸序列的截短的核殼體蛋白(tnp)。所包含的腎綜合征出血熱抗原蛋白的濃度可為0.1至1.0mg/ml。在樣品包含腎綜合征出血熱抗體的情況下，所述腎綜合征出血熱抗體可與金標(biāo)墊140中的標(biāo)志抗體結(jié)合，由此形成復(fù)合物。當(dāng)所述復(fù)合物經(jīng)過第三反應(yīng)線163時(shí)，所述腎綜合征出血熱抗體可與第三反應(yīng)線163的腎綜合征出血熱抗原蛋白結(jié)合。這種結(jié)合使得所述標(biāo)志抗體的有色顆粒在第三反應(yīng)線163中沉淀析出，從而形成紫紅色條帶?？墒刮磁c所述恙蟲抗體、鉤端螺旋體抗體以及腎綜合征出血熱抗體結(jié)合的剩余標(biāo)志抗體通過反應(yīng)線160向?qū)φ站€170移動(dòng)。預(yù)反應(yīng)線150可包括第一預(yù)反應(yīng)線151和第二預(yù)反應(yīng)線152。第一預(yù)反應(yīng)線151可包含大腸桿菌(e.coli)提取物。所述大腸桿菌提取物可與第一非特異性抗體結(jié)合。所述第一非特異性抗體可為與源自大腸桿菌的蛋白結(jié)合的抗體。第一預(yù)反應(yīng)線151可排除以下情況：盡管實(shí)際上不存在針對(duì)恙蟲抗原蛋白的抗體，但由于上述非特異性抗體與包含在恙蟲抗原蛋白中的源自大腸桿菌的蛋白的結(jié)合，所述抗體實(shí)際上不存在但卻被誤判為存在。第二預(yù)反應(yīng)線152可包含昆蟲細(xì)胞sf(草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda))提取物。所述昆蟲細(xì)胞sf提取物可與第二非特異性抗體結(jié)合。所述第二非特異性抗體可為與源自昆蟲細(xì)胞sf的蛋白結(jié)合的抗體。第二預(yù)反應(yīng)線152可排除以下情況：由于上述非特異性抗體與包含在腎綜合征出血熱抗原蛋白中的源自昆蟲細(xì)胞sr21的蛋白的結(jié)合，針對(duì)腎綜合征出血熱抗原蛋白的抗體實(shí)際上不存在但卻被誤判為存在。對(duì)照線170可包含對(duì)照蛋白。所述對(duì)照蛋白可與所述標(biāo)志抗體結(jié)合。這種結(jié)合使得所述標(biāo)志抗體的有色顆粒能夠在對(duì)照線170中沉淀析出，從而形成紫紅色條帶。所述對(duì)照蛋白可為選自山羊抗雞igy多克隆抗體(山羊抗雞igy)、兔抗山羊igg多克隆抗體和兔抗山羊igm多克隆抗體的至少一種。所包含的對(duì)照蛋白的濃度可為0.1至2mg/ml。吸收墊180可吸收沿著反應(yīng)膜120移動(dòng)的剩余樣品。吸收墊180可被設(shè)置成與反應(yīng)膜120重疊。針對(duì)恙蟲抗原蛋白的實(shí)施例實(shí)施例1.抗原蛋白的表達(dá)和分離1.1.嵌合重組56kda(cr56)蛋白的表達(dá)恙蟲病東方體以與韓國專利申請(qǐng)公布第2002-0020281號(hào)中公開的實(shí)施例的方法相同的方式表達(dá)、分離和純化包含恙蟲病東方體gilliam、karp和kato的主要表位的嵌合重組蛋白(cr56)。具體而言，將恙蟲病東方體gilliam、karp和kato株在小鼠l-929細(xì)胞中培養(yǎng)，收集，然后純化。將純化的株用酶消化，隨后通過苯酚提取和乙醇沉淀進(jìn)行dna純化。基于恙蟲病東方體的56kda蛋白基因的堿基順序，在gilliam、karp和kato血清型中選擇具有30％或更高氨基酸序列同源性的蛋白位點(diǎn)，并且針對(duì)gilliam、karp和kato株的各株制備一對(duì)寡核苷酸引物。使用所提取的恙蟲病東方體的dna作為模板，采用各引物對(duì)進(jìn)行pcr，以擴(kuò)增gilliam、karp和kato株的dna片段。將pcr產(chǎn)物純化并克隆，以連接在ptyb12載體的相應(yīng)限制酶消化位點(diǎn)。首先，將gilliam株的dna片段引入到ptyb12載體中以制備載體ptg3，并將karp株的dna片段引入到ptg3載體中以制備載體ptgp1。將kato株的dna片段引入到ptgp1載體中以制備載體ptgpt2。進(jìn)一步將與gilliam、karp和kato株的dna片段串聯(lián)的連接體從ptgpt2載體上切下，并將所述連接體引入pet22b(+)載體中以制備載體petb7。采用所制備的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌以誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。使用電泳和蛋白質(zhì)印跡法鑒定所述融合蛋白，之后分離并純化所表達(dá)的融合蛋白抗原。1-2.重組kangwon56kda蛋白(kr56)的表達(dá)考慮到株系被分為全球原型株karp、gilliam和kato以及yonchon(與kangwon最相似)，基于種系發(fā)生分析(phylogenicanalysis)的結(jié)果(femamicrobiologyletters，1999，180：163-169)，上述四種株系被認(rèn)為最適合用作抗原。karp、gilliam和kato由cr56表示。同樣，yonchon被表示為kangwon的kr56，kangwon與yonchon相似。本發(fā)明人使用kangwon56kda重組蛋白(kr56)作為嵌合重組蛋白(cr56)的輔助抗原。(1)kangwon56kda蛋白(kr56)表達(dá)的概述對(duì)被稱為kangwon87-61的主要抗原結(jié)構(gòu)域的84(250bp)至445(1335bp)長的一部分氨基酸序列進(jìn)行修飾以包含ncoi和sali識(shí)別位點(diǎn)，制備一對(duì)引物并進(jìn)行pcr。采用限制酶ncoi和sali對(duì)pcr產(chǎn)物和表達(dá)載體pet30a進(jìn)行消化，然后將它們彼此連接。使用所得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，然后從所述大腸桿菌bl21中提取蛋白。上述引物示于下表1。[表1]＊質(zhì)粒pet30a表達(dá)his-標(biāo)記的融合蛋白。(2)基因克隆與表達(dá)將通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的dna(84(250bp)至445(1335bp)的362個(gè)氨基酸(共1086bp))在1.2％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，然后使用qiagen凝膠洗脫試劑盒(qiageninc.，美國)回收。將經(jīng)擴(kuò)增以適合于所需大小的dna條帶在紫外透射儀上切下，轉(zhuǎn)移至微量管，以相當(dāng)于瓊脂糖凝膠體積3倍的量加入nai溶液，并在60℃下靜置5分鐘，以便凝膠完全溶解。進(jìn)一步向凝膠溶液中加入玻璃乳(glassmilk)，攪拌10秒鐘，并在室溫下在17000g(hanil，ai.5s-24，12000rpm)下離心1分鐘，隨后除去上清液。使微量管在室溫下靜置5分鐘，然后干燥。向其中加入洗脫緩沖液，之后攪拌微量管，然后在17000g(12000rpm)下離心，并將上清液轉(zhuǎn)移至新的微量管。將純化的pcr產(chǎn)物和pet30a載體用限制酶ncoi和sali完全消化，然后使用geneclean試劑盒ii通過相同的方法回收。將100ng經(jīng)限制酶酶切的載體和100ng經(jīng)限制酶酶切的pcr產(chǎn)物互相混合，與10×連接酶緩沖液(250mmtris-hclph7.8、100mmmgcl2、20mmdtt和4mmatp)和連接酶結(jié)合，并在4℃下反應(yīng)18小時(shí)。(3)感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化將在lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)了18小時(shí)的大腸桿茵bl21細(xì)胞用lb培養(yǎng)基稀釋100倍，然后再培養(yǎng)至在600nm處的吸光度達(dá)到0.3。使細(xì)胞在冰中靜置30分鐘，之后輕輕倒出培養(yǎng)基上清液，并以等于培養(yǎng)基體積一半的量加入0.1mcacl2，以懸浮大腸桿菌細(xì)胞。將懸浮的大腸桿菌細(xì)胞在冰中靜置1小時(shí)，在2000g(4100rpm)下離心10分鐘，然后懸浮于為培養(yǎng)基體積十分之一的0.1mcacl2中，然后用于轉(zhuǎn)化。(4)轉(zhuǎn)化將上述(3)中制備的感受態(tài)細(xì)胞與連接產(chǎn)物混合，置于冰中，然后在42℃下熱激1分30秒。向所得混合物中加入lb培養(yǎng)基，并在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)。將肉湯接種到lb瓊脂平板培養(yǎng)基中，然后在37℃下培養(yǎng)。(5)從轉(zhuǎn)化的大腸桿茵中分離質(zhì)粒dna將轉(zhuǎn)化的大腸桿茵的單個(gè)茵落接種到含有卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，然后在37℃下震蕩培養(yǎng)。使用accuprep質(zhì)粒提取試劑盒(accuprepplasmidextractionkit)進(jìn)行質(zhì)粒dna的提取。將肉湯在室溫下在750g(2500rpm)下離心10分鐘，由此僅回收細(xì)胞粒狀沉淀，然后向所述細(xì)胞粒狀沉淀中加入再懸浮緩沖液，攪拌，加入裂解緩沖液，然后在室溫下靜置5分鐘。向所得產(chǎn)物中加入中和緩沖液，在室溫下靜置，然后在17000×g(12000rpm)下離心，之后將上清液轉(zhuǎn)移到結(jié)合柱管中，然后在室溫下在17000×g(12000rpm)下離心，以除去經(jīng)提取的溶液。隨后，進(jìn)行80％乙醇等分(aliquoting)和離心，之后僅將結(jié)合柱放置在新試管中。向結(jié)合柱中加入洗脫緩沖液，使其在室溫下靜置，并離心，然后將上清液轉(zhuǎn)移至新微量管中。(6)蛋白表達(dá)和分離將當(dāng)前的培養(yǎng)基在37℃下采用種子培養(yǎng)方法的肉湯進(jìn)行接種，在220rpm下攪拌1小時(shí)45分鐘，當(dāng)od為0.5至0.6時(shí)采用0.5mmiptg進(jìn)行接種，并培養(yǎng)3小時(shí)。其后，在4℃下在3000rpm下離心30分鐘，向粒狀沉淀中加入1×結(jié)合緩沖液(6m尿素、500mmnacl、20mmtris-hcl(ph8.0)、5mm咪唑)，并使用超聲波儀將細(xì)胞破碎(脈沖：10秒開，20秒關(guān)，時(shí)間：6分鐘×2次(在此期間進(jìn)行一次換向)，amp.：45％)。其后，將kr56在4℃下在14000rpm(高壓滅菌的超速離心機(jī)瓶中的轉(zhuǎn)子7)下離心15分鐘，之后，將上清液冷凍，并將粒狀沉淀再懸浮于1×結(jié)合緩沖液(50ml，基于1l錐形瓶中的肉湯計(jì))。將粒狀沉淀在冰中放置1小時(shí)(靜置30分鐘，然后倒置)，在4℃下在14000rpm(高壓滅菌的超速離心機(jī)瓶中的轉(zhuǎn)子7)下離心30分鐘，從而得到上清液。將上清液用1×結(jié)合緩沖液(6m尿素)稀釋2倍，過濾(0.45nm注射過濾器)并在4℃下儲(chǔ)存。(7)蛋白純化采用2mlhisbind樹脂(novagen)填充柱，然后使用蒸餾水、1×載樣緩沖液(chargebuffer)和1×結(jié)合緩沖液進(jìn)行準(zhǔn)備。使抗原蛋白穿過所述柱以后，采用1×洗滌緩沖液洗滌所述柱。使1×洗脫緩沖液(6m尿素、500mmnacl、20mmtris-hcl(ph8.0)、500mm咪唑)穿過所述柱，回收1ml的每種蛋白。采用amiconultra30k進(jìn)行濃縮后，使用bca蛋白測(cè)定確定各級(jí)分中蛋白的濃度。對(duì)于包含在實(shí)施例1的恙蟲抗原蛋白中的恙蟲病東方體kangwon的56kda蛋白的具體氨基酸序列，可參見韓國專利第10-0796772號(hào)中公開的氨基酸序列。實(shí)施例2.依賴抗原濃度的試劑盒的反應(yīng)(以確定假陽性)以0.6mg/ml、0.9mg/ml、1.2mg/ml和1.5mg/ml的濃度制備實(shí)施例1的恙蟲抗原蛋白。制備四個(gè)包含相應(yīng)濃度的恙蟲抗原蛋白的試劑盒。使用免疫熒光抗體試驗(yàn)(其為一種診斷恙蟲病的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法)評(píng)價(jià)患者的樣品，之后制備一個(gè)陰性血清(dk13)和三個(gè)陽性血清(90-202、00-350、89-129)，將它們加到具有不同抗原濃度的各診斷試劑盒以觀察反應(yīng)。圖3示出了本發(fā)明的實(shí)施方案的依賴恙蟲抗原蛋白濃度的試劑盒反應(yīng)。依賴恙蟲抗原蛋白濃度的試劑盒反應(yīng)在下表2中給出。[表2]從表2和圖3中可明顯看出，其中恙蟲抗原蛋白的濃度為0.9mg/ml、1.2mg/ml和1.5mg/ml的診斷試劑盒是假陽性，而其中恙蟲抗原蛋白的濃度為0.6mg/ml的診斷試劑盒不是假陽性。實(shí)施例3.依賴混合抗原組成的試劑盒反應(yīng)以0.6mg/ml制備實(shí)施例1的恙蟲抗原蛋白，并以相同的濃度制備常規(guī)恙蟲抗原蛋白。常規(guī)恙蟲抗原蛋白由cr56、kr56和r21蛋白組成，所述cr56、kr56和r21蛋白以5∶2∶1的比例混合。制造包含實(shí)施例1的恙蟲抗原蛋白的診斷試劑盒以及包含常規(guī)恙蟲抗原蛋白的診斷試劑盒，并測(cè)量其對(duì)于陰性和陽性血清的反應(yīng)性。作為對(duì)照組，通過ifa測(cè)量了陰性和陽性血清的ab效價(jià)。圖4示出了本發(fā)明的實(shí)施方案的依賴恙蟲抗原蛋白組成的試劑盒反應(yīng)。常規(guī)恙蟲抗原蛋白和實(shí)施例1的恙蟲抗原蛋白的抗體應(yīng)答的靈敏度結(jié)果由-＝0、+＝1、++＝2、+++＝3、++++＝4表示，如下表3所示。[表3]從表3和圖4中可明顯看出，當(dāng)恙蟲抗原蛋白不合有r21并且kr56的量增加時(shí)，抗體應(yīng)答的靈敏度升高。針對(duì)鉤端螺旋體抗原的實(shí)施例實(shí)施例4.鉤端螺旋體抗原4-1.鉤端螺旋體株的培養(yǎng)將emjh(鉤端螺旋體培養(yǎng)基基底ellinghausenmcculloughjohnsonharris)以0.23g/90ml溶解并消毒，然后加入10ml富含鉤端螺旋體的emjh以制備培養(yǎng)基。將該培養(yǎng)基用鉤端螺旋體接種并在30℃下震蕩培養(yǎng)5天。4-2.鉤端螺旋體抗原的制備將在emjh培養(yǎng)基中培養(yǎng)了5天的鉤端螺旋體在4000×g下離心20分鐘，采用1×pbs緩沖液(137mmnacl、2.7mmkcl、10mmna2hpo4和2mmkh2po4)洗滌三次，然后在100℃下加熱1小時(shí)。使其與150μg/ml蛋白酶k在37℃下反應(yīng)16小時(shí)，加入2mmegta，使其在70℃下反應(yīng)15分鐘，然后在4℃下在180000×g下離心2小時(shí)。將所得粒狀沉淀懸浮于h2o中，以得到脂多糖(westpha和jann，1965)。將如此純化的lps抗原用1％乙酸處理，在100℃下加熱1小時(shí)，并在3000×g下離心20分鐘，將沉淀析出的脂質(zhì)a除去，得到多糖抗原。使用標(biāo)準(zhǔn)多糖測(cè)量如此獲得的抗原的量，所述標(biāo)準(zhǔn)多糖是通過以與上述相同的方式處理從大腸桿菌(escherichiacoli)中純化的lps(sigma)而得到的。實(shí)施例5.鉤端螺旋體多糖的抗原性評(píng)價(jià)5-1.蛋白質(zhì)印跡法使用bio-radproteanii電泳裝置在厚度為1mm或1.5mm的12％凝膠上進(jìn)行sds-page。使用bio-rad轉(zhuǎn)印槽(transblotcell)在80v下在30分鐘內(nèi)將蛋白從電泳后的凝膠中轉(zhuǎn)移到膜上。將轉(zhuǎn)移后的膜用含有5％脫脂乳和0.1％吐溫20的1×tbs緩沖液封閉，一抗為兔免疫血清(問號(hào)鉤端螺旋體(l.interrogans)株wh-19)，二抗為稀釋至1∶10000的辣根過氧化物酶綴合的抗兔igg(bio-rad)。免疫反應(yīng)完成后，使用ecl試劑盒(amershampharmaciabiotech)進(jìn)行顯色。圖5示出了純化的多糖的抗原性，其是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案從patoc型和lai型中分離的多糖的sds-page(a)和蛋白質(zhì)印跡法(b)的結(jié)果。如圖5所示，問號(hào)鉤端螺旋體(leptospirainterrogans)血清變lai型的多糖在sds-page凝膠電泳圖方面與問號(hào)鉤端螺旋體血清變型patoc型株patoc的多糖相似，并且14kda或更大的多糖存在于lai型和patoc型二者中并被認(rèn)為充當(dāng)抗原。5-2.斑點(diǎn)印跡法將1μg(1μg/1μl)抗原滴加到硝酸纖維素膜上，然后在37℃下干燥1小時(shí)。將干燥后的膜用5％脫脂乳-tbst封閉1小時(shí)，使其與作為一抗的患者血清(稀釋至1∶3000)反應(yīng)1小時(shí)，并與作為二抗的辣根過氧化物酶綴合的抗人igg(稀釋至1∶10000)反應(yīng)。反應(yīng)完成后，使用ecl試劑盒進(jìn)行顯色，并將其結(jié)果與mat結(jié)果進(jìn)行比較。在大多數(shù)患者血清中，觀察到陽性信號(hào)。下表4示出了mat和斑點(diǎn)印跡法的比較結(jié)果。[表4]5-3.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)在engvall和perlmann(1972)的方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行多糖elisa。將聚-l-賴氨酸(10μg/ml)用0.01mpbs稀釋以預(yù)處理板，并使其在室溫下反應(yīng)24小時(shí)。將所述板用含有0.05％吐溫20的pbs緩沖液洗滌兩次，之后將多糖懸浮于pbs中用100μl/孔處理所述板。使經(jīng)處理的板在37℃下反應(yīng)1小時(shí)，采用含有0.05％吐溫20的pbs緩沖液洗滌三次，采用山羊血清處理，并在37℃下進(jìn)行封閉。使用20名鉤端螺旋體病患者的血清和20名正常人的血清作為一抗，并使用辣根過氧化物酶綴合的抗人igg(bio-rad)(稀釋至1∶10000)作為二抗。每個(gè)孔用底物處理以由此觀察其顯色，使用酶標(biāo)儀在490nm處測(cè)量吸光度。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)鉤端螺旋體鞭毛(leptospiraflagella)重組蛋白表現(xiàn)出72％至88％的靈敏度和88％至90％的特異性，而本發(fā)明的多糖呈現(xiàn)出95％的靈敏度和95％的特異性。因此，作為用于鉤端螺旋體病早期診斷的抗原候選物，發(fā)現(xiàn)所述多糖優(yōu)于所述蛋白。使用elisa對(duì)所述多糖的靈敏度和特異性進(jìn)行測(cè)量的結(jié)果示于下表5。[表5]a：通過mat診斷的患者血清數(shù)：20b：正常血清數(shù)：20針對(duì)腎綜合征出血熱抗原蛋白的實(shí)施例實(shí)施例6.soochong病毒和培養(yǎng)細(xì)胞將從韓國的大林姬鼠(apodemuspeninsulae)中分離的soochong病毒株soov-2在vero細(xì)胞中傳代培養(yǎng)。為了vero細(xì)胞的增殖和維持，在37℃的培養(yǎng)箱中使用含有10％胎牛血清(pbs)的emem(eagle最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基)在5％cｏ2存在下進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至約90％的單層時(shí)使用細(xì)胞。實(shí)施例7：病毒rna的分離將soochong病毒在其中增殖的細(xì)胞在1075g(3000rpm)下離心3分鐘，加入750μltrizolls(gibco)溶液，使其在室溫下靜置5分鐘，加入200μl氯仿，然后再在室溫下靜置10分鐘。在4℃下在17000g(12000rpm)下離心15分鐘，之后除去沉淀析出的粒狀沉淀，向上清液中加入相同體積的異丙醇，使其在室溫下靜置10分鐘，在4℃下在17000g(12000rpm)下離心15分鐘，從而使rna沉淀析出，之后將所得到的rna粒狀沉淀用75％乙醇洗滌一次，在空氣中干燥10分鐘，然后溶解于depc水溶液中。實(shí)施8：cdna的合成與pcr圖6示出了本發(fā)明的實(shí)施方案的核殼體蛋白(np)、完整的np(cnp)和截短的np(cnp)在soochong病毒的s區(qū)段的基因結(jié)構(gòu)，圖7示出了本發(fā)明的實(shí)施方案在pcr之后的tnp的dna條帶(約370bp)和cnp的dna條帶(約1300bp)。用于制備soochong病毒重組抗原的pcr引物示于下表6中。[表6]從圖6和表6中可明顯看出，為了從編碼np的核酸序列(genbank登記號(hào)ay675350)seqidno：1合成cdna，向4μl實(shí)施例7的rna溶液中加入1μl表6中的各引物(10pmol)并加入包含5×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、10mmdntps、100pmol/μloligo(dt)、40單位/μlrna酶抑制劑(rnasin)和200單位/μlmmlv逆轉(zhuǎn)錄酶的混合物。反應(yīng)在30℃下進(jìn)行10分鐘，在45℃下進(jìn)行30分鐘，在99℃下進(jìn)行5分鐘并在5℃下進(jìn)行5分鐘，得到cdna。包含5μlcdna產(chǎn)物、10pmol引物對(duì)、10mmdntps、10×taq緩沖液和5單位/μltaq聚合酶的混合物的pcr以如下的循環(huán)進(jìn)行一次：95℃5分鐘、52℃2分鐘和72℃2分鐘；以如下的循環(huán)進(jìn)行五次：95℃1分鐘、52℃1分鐘和72℃1分鐘；以如下的循環(huán)進(jìn)行20次：95℃1分鐘、60℃1分鐘和72℃1分鐘；并以如下的循環(huán)進(jìn)行一次：95℃1分鐘、60℃1分鐘和72℃7分鐘，從而擴(kuò)增dna。將擴(kuò)增的dna在-20℃下保存。圖7示出了pcr之后的tnp的dna條帶(約370bp)和cnp的dna條帶(約1300bp)。如圖7所示，使用各引物進(jìn)行pcr，由此在約370bp處鑒定tnp的dna條帶，并在約1300bp處鑒定cnp的dna條帶。實(shí)施9.擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆圖8示出了本發(fā)明的實(shí)施方案的將tnp的dna和cnp的dna克隆到pgem-t-easypcr克隆載體中。如圖8所示，將通過pcr擴(kuò)增的在約370bp和約1300bp處的dna在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電洗脫并克隆到pgem-teasypcr克隆載體(invitrogen)中。通過采用限制酶bglii和hindiii的消化來鑒定tnp和cnp的dna。這旨在制備cnp(1287bp：37-1323)和tnp(357bp：37-393)多肽。其氨基酸序列示于seqidno：2和3中。將其中插入了含tnp的369bp的質(zhì)粒稱為pgt-soov2-tnp，將其中插入了含cnp的1299bp的質(zhì)粒稱為pgt-soov2-cnp。實(shí)施例10.克隆到表達(dá)載體中圖9示出了本發(fā)明的實(shí)施方案的將pgt-soov2-tnp和pgt-soov2-cnp的pcr產(chǎn)物克隆到在n-末端具有his-taq的桿狀病毒質(zhì)粒載體中。如圖9所示，將在n-末端具有his-taq的表達(dá)融合載體，即pblue-bac-his2b(invitrogen)，采用限制酶bglii和hindiii處理，并將pgt-soov2-tnp和pgt-soov2-cnp的pcr產(chǎn)物采用限制酶bglii和hindiii進(jìn)行克隆，從而得到pbac-soov2-tnp和pbac-soov2-cnp。實(shí)施例11.重組桿狀病毒的形成圖10示出了本發(fā)明的實(shí)施方案的使用桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)從pbac-soov2-tnp和pbac-soov2-cnp形成bac-soov2-tnp和bac-soov2-cnp。如圖10所示，使用bac-n-blue桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)將pbac-soov2-tnp和pbac-soov2-cnp制成bac-soov2-tnp和bac-soov2-cnp。將對(duì)數(shù)期的sf9細(xì)胞(2×106)置于60mm的平皿中以形成單層。為了制備轉(zhuǎn)染混合物，將10μl(0.5μg)bac-n-bluetmdna置于微量離心機(jī)中，并加入以下溶液。pbac-soov2-tnp或pbac-soov2-cnp(1μg/μl)：4μlgrace昆蟲培養(yǎng)基(沒有補(bǔ)充劑或fbs)：1mlcellfectin試劑(在使用前混合均勻并在使用過程中不斷混合)：20μl使平皿在室溫下靜置15分鐘，從平皿中除去培養(yǎng)基，之后加入2ml既不合有補(bǔ)充劑也不合有fbs的grace昆蟲培養(yǎng)基，從單層中再次除去培養(yǎng)基，并將所制備的轉(zhuǎn)染混合物滴加到60mm的平皿中。使該平皿在室溫下靜置約4小時(shí)，加入1mltnm-fh培養(yǎng)基，密封，并在27℃下孵育72小時(shí)。當(dāng)以這種方式進(jìn)行共轉(zhuǎn)染時(shí)，將復(fù)制的重組桿狀病毒用作病毒原種(stock)。實(shí)施例12.重組桿狀病毒的純化使用終點(diǎn)稀釋法測(cè)量所述病毒原種的濃度。對(duì)于確定病毒效價(jià)的終點(diǎn)稀釋，對(duì)病毒接種溶液進(jìn)行10-5至10-8倍的連續(xù)稀釋，將各稀釋溶液接種到以1×104/孔的細(xì)胞濃度等分到96孔板上的培養(yǎng)細(xì)胞中，并在27℃下進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。從感染了病毒的孔與未感染病毒的孔的比例計(jì)算病毒效價(jià)，以確定pfu(噬斑形成單位)。為了選擇純的病毒，將病毒接種溶液稀釋10-2至10-8倍，將各稀釋溶液接種到以1×104/孔的細(xì)胞濃度等分到96孔板上的培養(yǎng)細(xì)胞中，并在27℃下進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。從接種后第四天起，使用顯微鏡觀察到細(xì)胞內(nèi)多面體晶體的形成以及病毒感染，選擇最大稀釋因子的孔中的病毒，并以相同的方式純化至少三次，最終得到純的病毒。實(shí)施例13.重組蛋白的表達(dá)和分離將sf9昆蟲細(xì)胞以約5×106的密度播種在75cm2燒瓶中，并用5moi重組病毒接種。在感染后第五天，觀察到包含體的形成并回收所有細(xì)胞。將回收的細(xì)胞在6000g(7000rpm)下離心，并收集粒狀沉淀，懸浮于1×結(jié)合緩沖液(5mm咪唑、20mmtris-hclph7.9、0.5mnacl)中，并使用超聲波儀在18hz下攪拌六次，每次15秒。在23400g(14000rpm)下離心15分鐘，并以可溶形式保存上清液。同樣，將不溶形式的粒狀沉淀懸浮于含有6m尿素的1×結(jié)合緩沖液中，使其在4℃下靜置1小時(shí)，并在23400g(14000rpm)下離心30分鐘以回收上清液(裂解的粒狀沉淀)。將經(jīng)回收的裂解的粒狀沉淀通過his-結(jié)合色譜法純化以得到純化的粒狀沉淀。使所述可溶形式，裂解的粒狀沉淀和純化的粒狀沉淀進(jìn)行sds-page，并通過蛋白質(zhì)印跡法鑒定其中存在所述重組蛋白的任何級(jí)分。作為對(duì)照，使用野生型病毒感染的細(xì)胞的可溶形式。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡法，使用患有腎綜合征出血熱(hfrs)的患者的血清和正常血清作為一抗。圖11示出了本發(fā)明的實(shí)施方案的使用患者血清和正常血清來檢測(cè)tnp的蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果，其中下部箭頭處的條帶被指認(rèn)為tnp的部分降解。左邊的圖像示出了使用患有腎綜合征出血熱的患者的血清作為一抗的結(jié)果，右邊的圖像示出了使用正常血清作為一抗的結(jié)果(第1道：感染了野生型桿狀病毒的細(xì)胞的溶液形式，第2道：感染了重組桿狀病毒的細(xì)胞的可溶形式，第3道：采用含有尿素的緩沖液處理細(xì)胞的不溶形式然后離心后的裂解的粒狀沉淀，第4道：3的純化的粒狀沉淀)。如圖11所示，對(duì)于tnp，該蛋白以可溶形式存在的量比以不溶形式存在的量更大。除了在22kda處的特異條帶——其對(duì)應(yīng)tnp級(jí)分——之外，基于患者血清的蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果，可以看出即使在純化的粒狀沉淀以及可溶形式中，本應(yīng)顯示為弱的下部條帶是強(qiáng)的，因此認(rèn)為這是由特異性反應(yīng)引起的。對(duì)于正常血清，兩個(gè)條帶均未出現(xiàn)。下部條帶被認(rèn)為是由tnp的部分降解造成的。圖12示出了本發(fā)明的實(shí)施方案的tnp和cnp的純化的粒狀沉淀的蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果(第1道：未感染病毒的細(xì)胞，第2道：感染了桿狀病毒的細(xì)胞，第3道：感染了cnp克隆的重組桿狀病毒的細(xì)胞，第4道：感染了tnp克隆的重組桿狀病毒的細(xì)胞，第5道：感染了cnp克隆的重組桿狀病毒的細(xì)胞，第6道：感染了tnp克隆的重組桿狀病毒的細(xì)胞)。如圖12所示，僅在患有腎綜合征出血熱(hfrs)的患者中觀察到cnp，并證實(shí)產(chǎn)生了約50kda的重組蛋白。實(shí)施例14：通過his-結(jié)合親和色譜法的重組蛋白的純化采用2mlhis-結(jié)合樹脂(novagen)填充柱，并使用蒸餾水、1×載樣緩沖液和1×結(jié)合緩沖液進(jìn)行準(zhǔn)備。使抗原蛋白穿過所述柱，采用1×結(jié)合緩沖液(5mm咪唑、20mmtris-hclph7.9、0.5mnacl)和1×洗滌緩沖液(40mm咪唑、20mmtris-hclph7.9、0.5mnacl)洗滌所述柱。使洗脫緩沖液(300mm咪唑、0.5mnacl、20mmtris-clph7.9)穿過所述柱以回收1ml的每種蛋白。通過lowry測(cè)定法確定各級(jí)分中蛋白的濃度。進(jìn)行sds-page和蛋白質(zhì)印跡法以鑒定蛋白。實(shí)施例15.重組蛋白測(cè)定法15-1.蛋白質(zhì)印跡法在厚度為1mm或1.5mm的10％凝膠上對(duì)10μg純化的重組蛋白/孔進(jìn)行電泳。使用bio-rad運(yùn)送器在80v下在40分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)移電泳后的凝膠。將轉(zhuǎn)移后的膜用5％脫脂乳-tbst(tris緩沖的鹽水-吐溫20)封閉1小時(shí)，使其與作為一抗的患者血清(稀釋至1∶3000)反應(yīng)1小時(shí)，并與作為二抗的辣根過氧化物酶綴合的抗人igg(稀釋至1∶10000)反應(yīng)。反應(yīng)完成后，使用ecl試劑盒進(jìn)行顯色?；诘鞍踪|(zhì)印跡法的結(jié)果，重組cnp和tnp只在患有腎綜合征出血熱的患者的血清中分別在約50kda和22kda處反應(yīng)，但不與正常血清反應(yīng)。15-2.斑點(diǎn)印跡法將1μg重組蛋白滴加到硝酸纖維素膜上并在37℃下干燥1小時(shí)。將干燥后的膜用5％脫脂乳-tbst封閉1小時(shí)，使其與作為一抗的患者血清和正常血清(稀釋至1∶3000)反應(yīng)1小時(shí)，并與作為二抗的辣根過氧化物酶綴合的抗人igg(稀釋至1∶10000)反應(yīng)。反應(yīng)完成后，使用ecl試劑盒進(jìn)行顯色。使用感染了漢他病毒或漢城病毒的患有腎綜合征出血熱(hfrs)的患者的血清進(jìn)行斑點(diǎn)印跡法。如下表7所示，在cnp中顯示的陽性信號(hào)比在tnp中顯示的更強(qiáng)，并且與正常血清沒有發(fā)生反應(yīng)。[表7]a：數(shù)據(jù)以強(qiáng)陽性(+++)、中陽性(++)或弱陽性(+)斑點(diǎn)印跡法結(jié)果的形式表示。＊十份正常血清不與重組np抗原反應(yīng)。15-3.elisa將重組蛋白抗原用0.05m碳酸鹽緩沖液(ph9.6)在1μg/ml下進(jìn)行稀釋，加入96孔微量板中，然后使其在4℃反應(yīng)18小時(shí)。采用含有0.05％吐溫20的pbst洗滌兩次，并采用3％bsa在37℃下封閉2小時(shí)。使用稀釋形式的感染漢他病毒、漢城病毒、pummala病毒或prospecthill病毒的大鼠的血清作為一抗，二抗為稀釋至1∶6000的辣根綴合物抗大鼠igg(igm)。使用底物溶液進(jìn)行顯色，使用酶標(biāo)儀在490nm的波長下測(cè)量od。從下表8中可明顯看到，重組抗原cnp與漢他病毒和漢城病毒反應(yīng)但不與pummala病毒或prospecthill病毒反應(yīng)。[表8]針對(duì)以下病毒的大鼠抗血清漢他漢城pummalaprospecthill通過elisa測(cè)定的cnp的反應(yīng)性++++++--盡管為了說明的目的公開了本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在不背離所附權(quán)利要求書中公開的本發(fā)明的范圍和精神的情況下，可以從所述實(shí)施方案中做出各種修改和其他等同的實(shí)施方案。所公開的實(shí)施方案應(yīng)被認(rèn)為是示例性的而非限制性的。本發(fā)明的范圍并非示于上述說明書中而是示于權(quán)利要求書中，在與其等同的范圍內(nèi)的所有變異應(yīng)理解為并入本發(fā)明。當(dāng)前第1頁12