本發(fā)明屬于卷煙煙氣釋放物有關(guān)成分分析測試技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用在線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測定卷煙主流煙氣中6種芳香胺類化合物的方法，包括鄰甲基苯胺、2，6-二甲基苯胺、鄰茴香胺、1-氨基萘、2-氨基萘和4-氨基聯(lián)苯。

背景技術(shù)：

作為重要的有機合成原料和中間體，芳香胺類化合物廣泛存在于藥物、殺蟲劑、偶氮染料，塑料、橡膠等工業(yè)生產(chǎn)中。此外，人們已從各種各樣的環(huán)境物質(zhì)如空氣、排放的廢水、食品添加劑、化妝品等中檢出了各類芳香胺成分。芳香胺類化合物可通過呼吸、食入或皮膚接觸等方式進(jìn)入人體，能通過形成高鐵血紅蛋白，對人體血液系統(tǒng)造成損害，也可直接作用于肝細(xì)胞，引起中毒性肝損害。其中一些芳香胺衍生物還具有致癌和致突變的作用，對人類身體健康造成威脅^[1-3]。研究證實，職業(yè)暴露于2-氨基萘和4-氨基聯(lián)苯的人群罹患膀胱癌和白血病的風(fēng)險較高^[4]。

目前，已有多種芳香胺類化合物在卷煙煙氣中被檢出，如1-氨基萘、2-氨基萘、4-氨基聯(lián)苯、鄰甲基苯胺等^[5]。其中，鄰甲基苯胺、2，6-二甲基苯胺、鄰茴香胺、1-氨基萘、2-氨基萘、4-氨基聯(lián)苯這6種芳香胺成分因其具有致癌性，被列入美國食品藥品監(jiān)督局(FDA)發(fā)布的93種“煙草制品及煙草煙霧中有害物質(zhì)及潛在有害物質(zhì)成分”列表中(簡稱HPHCs列表)^[6]。

目前，盡管芳香胺的分析檢測方法很多，但常用的方法是國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23358-2009(卷煙主流煙氣總粒相物中主要芳香胺的測定氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法)。該方法用劍橋濾片捕集卷煙主流煙氣中的總粒相物，用鹽酸溶液萃取后，經(jīng)二氯甲烷洗滌、氫氧化鈉還原、正己烷萃取后，使用五氟丙酸酐進(jìn)行衍生化，所得溶液采用固相萃取柱純化，濃縮后通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)定量測定芳香胺的含量。該方法利用GC-MS對主流煙氣中芳香胺類化合物進(jìn)行分析檢測，研究對象僅為1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基聯(lián)苯和4-氨基聯(lián)苯等4種化合物，且樣品前處理方法繁瑣費時，一次樣品分析周期約3天。近幾年，又陸續(xù)有2篇專利對卷煙主流煙氣中芳香胺的檢測方法進(jìn)行了研究。其中，專利1(一種氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測卷煙主流煙氣中芳香胺的方法，公開號：CN 102279237B)用劍橋濾片捕集卷煙主流煙氣中的總粒相物，用鹽酸溶液萃取后，經(jīng)二氯甲烷洗滌、氫氧化鈉還原、正己烷萃取后，使用五氟丙酸酐和鹽酸三甲胺衍生化，濃縮后，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS/MS)對卷煙主流煙氣中芳香胺的測定。該方法對國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23358-2009方法中的樣品衍生化步驟進(jìn)行改進(jìn)，減少了樣品濃縮次數(shù)，分析研究對象與國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23358-2009相同(1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基聯(lián)苯和4-氨基聯(lián)苯)，但仍需對樣品進(jìn)行繁瑣費時處理(如洗滌、還原、萃取、衍生化、濃縮等)，一次樣品分析周期約2天。專利2(一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測卷煙主流煙氣中10種芳香胺類化合物的方法，公開號：CN 102608232B)利用劍橋濾片和含5％HCl溶液的吸收瓶，分別捕集主流煙粒相物和氣相物中的芳香胺類化合物，采用5％HCl溶液萃取濾片后，經(jīng)HLB固相萃取柱純化處理，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)對卷煙主流煙氣中10種芳香胺(1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基聯(lián)苯和4-氨基聯(lián)苯、苯胺、鄰、間、對-甲基苯胺、間苯二胺、間茴香胺)進(jìn)行測定。該方法與前兩種分析方法相比，避免了衍生化反應(yīng)及液液萃取等操作，但需要人工對樣品溶液進(jìn)行固相萃取處理，一次樣品處理周期約2小時，分析效率仍有待提高，且該方法中研究對象不是針對HPHCs列表中6種致癌性芳香胺類化合物。

綜上，以上發(fā)明方法都涉及到繁瑣的人工處理，檢測周期長，且易引入人為誤差，影響測量結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密性。因此，有必要研究開發(fā)一種快速、準(zhǔn)確測定卷煙主流煙氣中6種有害芳香胺類化合物的檢測方法，為實現(xiàn)對大批量樣品中芳香胺類化合物的檢測提供技術(shù)支撐。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有芳香胺類化合物檢測技術(shù)中樣品前處理繁瑣費時且易引入人為誤差的不足，提供一種應(yīng)用在線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測定卷煙主流煙氣中6種芳香胺類化合物的方法。該方法能夠?qū)崿F(xiàn)樣品自動、快速分析，避免了對樣品進(jìn)行繁瑣人工處理時可能造成的人為誤差，同時該方法靈敏度好、精密度高、選擇性強，適用于實驗室對大批量樣品進(jìn)行監(jiān)控檢測分析研究。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種應(yīng)用在線SPE/LC-MS/MS測定卷煙主流煙氣中6種芳香胺類化合物的方法，其特征是，

(1)利用劍橋濾片和含2％甲酸溶液的吸收瓶，分別捕集主流煙氣煙粒相物和氣相物中芳香胺類化合物；

(2)吸收瓶的溶液中加入內(nèi)標(biāo)后，進(jìn)入在線SPE/LC-MS/MS進(jìn)行卷煙主流煙氣中6種芳香胺的在線固相萃取和檢測；

(3)將劍橋濾片置于收集容器中，加入2％甲酸溶液和內(nèi)標(biāo)，超聲萃取，經(jīng)膜過濾后進(jìn)入在線SPE/LC-MS/MS進(jìn)行卷煙主流煙氣中6種芳香胺的在線固相萃取和檢測；

(4)將步驟(2)和步驟(3)分別測得的各芳香胺的含量進(jìn)行相加，得到卷煙主流煙氣中各芳香胺的總含量。

所述內(nèi)標(biāo)為d₉-鄰甲苯胺、d₃-鄰茴香胺、d₆-2，6-二甲基苯胺、d₇-1-氨基萘及d₉-4-氨基聯(lián)苯的混合內(nèi)標(biāo)。

所述在線固相萃取(在線SPE)，采用PRS陽離子(Bond Elute PRS，10×2.0mm，40-90μm，荷蘭Spark Holland公司)萃取小柱和C18反相HD(HySphere C18HD，10×2.0mm，7μm，荷蘭Spark Holland公司)萃取小柱組成的二維在線固相萃取。

萃取條件：將樣品上樣至PRS陽離子固相萃取小柱，依次用2％的甲酸溶液、甲醇/2％的甲酸(體積比為10:90)進(jìn)行淋洗，洗脫掉樣品中大部分雜質(zhì)；然后用5％氨水將樣品轉(zhuǎn)移至C18反相HD萃取小柱，以5％氨水沖洗C18反相HD萃取小柱，可以進(jìn)一步將目標(biāo)分析物和第一根小柱保留下來的干擾物分開，使干擾物在目標(biāo)分析物到達(dá)分析柱之前就被沖洗到廢液中；凈化后的溶液再進(jìn)行LC-MS/MS檢測。為獲得最高萃取效率同時確保樣品最佳的凈化效果，對在線固相萃取的活化、平衡、上樣、轉(zhuǎn)移、洗滌、再生等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見表1。

所述LC分析條件：色譜柱規(guī)格100mm×3.0mm i.d.,2.7μm的Poroshell 120EC-C18，柱溫30℃；流動相A為0.1％甲酸水溶液，流動相B為0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脫，條件為0～12min：98％A+2％B，12.1～24min：72％A+28％B，24.1～29min：100％B，29.1～30min：100％A；流速：200μL/min；進(jìn)樣體積50μL。

所述MS/MS參數(shù)：離子源：電噴霧電離源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM；電噴霧電壓：4500V；氣簾氣壓力：20psi；輔助氣1壓力：55psi；輔助氣2壓力：55psi；碰撞氣壓力：6psi；離子源溫度：500℃。各化合物的定量離子對、定性離子對、駐留時間、碰撞能量(CE)及去簇電壓(DP)參見表2。

優(yōu)選的，所述步驟(1)的吸收瓶中2％甲酸溶液的體積為25mL；步驟(3)中收集容器(優(yōu)選250mL磨口錐形瓶)中加入2％甲酸溶液的體積為100mL，超聲萃取時間為30分鐘。

本發(fā)明在樣品抽吸之前，按照ISO 4387:2000標(biāo)準(zhǔn)條件對樣品進(jìn)行平衡。

本發(fā)明在卷煙主流煙氣中芳香胺的捕集過程中，卷煙抽吸采用直線式吸煙機，按照ISO3308:2000標(biāo)準(zhǔn)條件抽吸。

本發(fā)明的有益效果如下：

(1)GC-MS和GC-MS/MS方法均需要衍生化反應(yīng)及液液萃取等操作(單次樣品處理周期分別約為2天和3天)，LC-MS/MS方法需要人工對樣品進(jìn)行離線萃取凈化處理(單次樣品處理周期約2小時)，而本發(fā)明方法對樣品進(jìn)行在線固相萃取處理，然后進(jìn)LC-MS/MS進(jìn)行分析，不僅避免了繁瑣費時的衍生化反應(yīng)及液液萃取等操作，而且無需人工進(jìn)行萃取凈化，大大簡化了樣品前處理過程，提高了分析效率(單次樣品處理周期約0.5小時)，并且能夠在一定程度上減少繁瑣的人工操作對檢測結(jié)果可能造成的影響，同時該方法靈敏度好、精密度高、選擇性強，能夠?qū)崿F(xiàn)樣品自動和大批量分析；

(2)與現(xiàn)有的LC-MS/MS方法相比，本發(fā)明方法采用較易揮發(fā)的甲酸水溶液作為萃取液，有利于減少對儀器和色譜柱的污染，降低對樣品分析干擾；

(3)本發(fā)明方法利用陽離子小柱(Bond Elute PRS)和反相C18小柱(HySphere C18HD)組成的二維在線固相萃取技術(shù)，基于不同的萃取機理完成對樣品進(jìn)行的凈化，能夠確保在較高的方法靈敏度下，最大程度地去除復(fù)雜樣品基質(zhì)中干擾物；

(4)在本發(fā)明方法定量部分，對每一個目標(biāo)物都單獨使用具有穩(wěn)定同位素及相同或同分異構(gòu)的化合物作為特定內(nèi)標(biāo)，基于內(nèi)標(biāo)物與目標(biāo)物具有相同的基質(zhì)萃取效率和及色譜保留行為，能夠彌補萃取和前處理過程中低效和損耗，可以有效降低質(zhì)譜離子化中的基質(zhì)效應(yīng)；

(5)研究對象不同：GC-MS和GC-MS/MS方法的研究對象均為1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基聯(lián)苯和4-氨基聯(lián)苯，LC-MS/MS(離線固相萃取樣品)方法的研究對象為10種芳香胺(1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基聯(lián)苯和4-氨基聯(lián)苯、苯胺、鄰、間、對-甲基苯胺、間苯二胺、間茴香胺)，而本發(fā)明針對的研究對象為美國FDA發(fā)布的HPHCs列表中的6種致癌性芳香胺類化合物，即鄰甲基苯胺、2，6-二甲基苯胺、鄰茴香胺、1-氨基萘、2-氨基萘及4-氨基聯(lián)苯。

因此，本發(fā)明方法能有效完成卷煙主流煙氣中6種有害芳香胺類化合物的自動、快速、客觀、準(zhǔn)確分析，極其適合于對復(fù)雜基質(zhì)中超低含量目標(biāo)化合物進(jìn)行高通量分析。

附圖說明

圖1為鄰甲基苯胺(o-TOL)、2，6-二甲基苯胺(2,6-DMA)、鄰茴香胺(o-ASD)、1-氨基萘(1-ANP)、2-氨基萘(2-ANP)、4-氨基聯(lián)苯(4-ABP)標(biāo)樣的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜(MRM)圖；

圖2為實施例1樣品1卷煙主流煙氣中鄰甲基苯胺(o-TOL)、2，6-二甲基苯胺(2,6-DMA)、鄰茴香胺(o-ASD)、1-氨基萘(1-ANP)、2-氨基萘(2-ANP)、4-氨基聯(lián)苯(4-ABP)標(biāo)樣的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜(MRM)圖；

圖3為實施例1樣品2卷煙主流煙氣中鄰甲基苯胺(o-TOL)、2，6-二甲基苯胺(2,6-DMA)、鄰茴香胺(o-ASD)、1-氨基萘(1-ANP)、2-氨基萘(2-ANP)、4-氨基聯(lián)苯(4-ABP)標(biāo)樣的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜(MRM)圖。

具體實施方式

本發(fā)明以下將結(jié)合實施例作進(jìn)一步說明：

實施例1

1.樣品的制備

將平衡及篩選后的卷煙按照ISO 3308:2000規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)條件抽吸，采用4張劍橋濾片(φ44mm)捕集20支卷煙主流煙氣中的粒相物(每張劍橋濾片捕集5支卷煙主流煙氣中的粒相物)；將預(yù)先裝有25mL 2％甲酸溶液的吸收瓶通過軟管連接在捕集器后面，用以收集氣相物。

將收集氣相物的吸收瓶取下，加入0.25mL混合內(nèi)標(biāo)(d₉-鄰甲苯胺、d₃-鄰茴香胺、d₆-2，6-二甲基苯胺、d₇-1-氨基萘及d₉-4-氨基聯(lián)苯)后，混合均勻，直接進(jìn)Online SPE/LC-MS/MS分析。

將捕集有20支卷煙主流煙氣粒相物的劍橋濾片折疊放入250mL磨口錐形瓶中，加入1.0mL混合內(nèi)標(biāo)和100mL 2％甲酸溶液(萃取液)，室溫下超聲萃取30min，經(jīng)濾膜(0.22μm，聚四氟乙烯)過濾后進(jìn)Online SPE/LC-MS/MS分析。

分別對氣相物和粒相物的各芳香胺類化合物含量進(jìn)行Online SPE/LC-MS/MS檢測，二者含量相加即得卷煙主流煙氣中各化合物的總含量。

混合內(nèi)標(biāo)液配置方法：準(zhǔn)確稱取d₉-鄰甲苯胺、d₃-鄰茴香胺、d₆-2，6-二甲基苯胺、d₇-1-氨基萘及d₉-4-氨基聯(lián)苯各100mg置于100mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，得到濃度均為1.0mg/mL內(nèi)標(biāo)單標(biāo)儲備液。用移液槍分別準(zhǔn)確移取上述5種單標(biāo)儲備液各0.10mL于100mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋、定容至刻度，得到濃度為1.0μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)液，備用。

2.在線固相萃取

儀器：在線固相萃取儀(Symbiosis^TM Pico，荷蘭Spark Holland公司)。

選擇PRS陽離子(Bond Elute PRS，10×2.0mm，40-90μm，荷蘭Spark Holland公司)和C18反相HD(HySphere C18HD，10×2.0mm，7μm，荷蘭Spark Holland公司)兩種萃取小柱對樣品進(jìn)行凈化處理。

首先，將樣品上樣到PRS陽離子萃取小柱上，先后用2％甲酸水溶液及2％甲酸水溶液和甲醇組成的溶劑洗脫掉樣品中大部分雜質(zhì)，然后用5％氨水將樣品轉(zhuǎn)移到C18HD反相萃取小柱上，用5％氨水沖洗C18HD反相萃取小柱，可以進(jìn)一步將目標(biāo)分析物和第一根小柱保留下來的干擾物分開，使干擾物在目標(biāo)分析物到達(dá)分析柱之前就被沖洗到廢液中，使目標(biāo)分析物在分析柱中得到分離，并被質(zhì)譜檢測到。為獲得最高萃取效率同時確保樣品最佳的凈化效果，對在線固相萃取的活化、平衡、上樣、轉(zhuǎn)移、洗滌、再生等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見表1。

表1 Online-SPE萃取條件

3.檢測

經(jīng)在線固相萃取的待測樣品采用LC-MS/MS方法進(jìn)行檢測，儀器參數(shù)條件如下。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：液相色譜部分(Symbiosis^TM Pico，荷蘭Spark Holland公司)，API4000+質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX)。

LC分析條件：色譜柱規(guī)格100mm×3.0mm i.d.,2.7μm的Poroshell 120EC-C18，柱溫30℃；流動相A為0.1％甲酸水溶液，流動相B為0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脫，條件為0～12min：98％A+2％B，12.1～24min：72％A+28％B，24.1～29min：100％B，29.1～30min：100％A；流速：0～30min：200μL/min；進(jìn)樣體積50μL。

MS/MS參數(shù)：離子源：電噴霧電離源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM；電噴霧電壓：4500V；氣簾氣壓力：20psi；輔助氣1壓力：55psi；輔助氣2壓力：55psi；碰撞氣壓力：6psi；離子源溫度：500℃。

各化合物的定量離子對、定性離子對、駐留時間、碰撞能量(CE)及去簇電壓(DP)參見表2。鄰甲基苯胺(o-TOL)、2，6-二甲基苯胺(2,6-DMA)、鄰茴香胺(o-ASD)、1-氨基萘(1-ANP)、2-氨基萘(2-ANP)、4-氨基聯(lián)苯(4-ABP)標(biāo)樣的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜(MRM)圖如圖1所示。

表2各化合物的定量離子對、定性離子對、內(nèi)標(biāo)、駐留時間、碰撞能量及去簇電壓

4.方法的線性及檢出限

本發(fā)明中采用甲醇配制芳香胺混合母液、氘代混合內(nèi)標(biāo)母液，采用2％甲酸配置芳香胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液含內(nèi)標(biāo)d₉-鄰甲苯胺、d₃-鄰茴香胺、d₆-2，6-二甲基苯胺、d₇-1-氨基萘及d₉-4-氨基聯(lián)苯，濃度均為10ng/mL。實驗中分別對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行LC-MS/MS分析，并以芳香胺化合物標(biāo)物峰面積(y)對其濃度比(x)進(jìn)行線性回歸，得到各目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。取最低濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，平行測定10次，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為檢測限，10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為定量限，結(jié)果如表3所示。由此可見，6種芳香胺化合物在線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.99706-0.99975之間。

表3工作曲線、相關(guān)系數(shù)、方法檢測限及定量限

5.回收率和精密度

對同一卷煙樣品，在低、中、高三個水平上加入標(biāo)樣，分別平行測定3次，進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗，結(jié)果如表4所示，加標(biāo)回收率為91.0-122.9％，該方法的回收率較好。同時進(jìn)行重復(fù)性實驗，同一樣品連續(xù)測定6次及連續(xù)5天測定，用測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示該方法的日內(nèi)精密度和日間精密度，經(jīng)測定，該方法日內(nèi)精密度和日間精密度分別低于6％和7％，說明該發(fā)明方法重復(fù)性好、樣品穩(wěn)定，適合大批量樣品分析，結(jié)果見表4。

表4方法回收率、日內(nèi)精密度及日間精密度

6.檢測結(jié)果

根據(jù)上述的方法，本發(fā)明對2個牌號卷煙樣品的粒相物和氣相物分別進(jìn)行檢測分析，測試結(jié)果如下表5所示。

表5卷煙樣品測定結(jié)果

其加標(biāo)后多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜(MRM)圖分別如圖2-3所示。從圖2-3可以看出：相比圖1，圖2-3的鄰甲基苯胺(o-TOL)、鄰茴香胺(o-ASD)和4-氨基聯(lián)苯(4-ABP)的保留時間相比標(biāo)準(zhǔn)樣品具有一定幅度的偏移，分析是由于內(nèi)標(biāo)化合物的存在影響其保留時間。經(jīng)過本發(fā)明申請人的多次檢測結(jié)果的總結(jié)，在后續(xù)的檢測中，可以將圖2的保留時間作為各化合物的保留時間用于定性。即鄰甲基苯胺(o-TOL)、2，6-二甲基苯胺(2,6-DMA)、鄰茴香胺(o-ASD)、1-氨基萘(1-ANP)、2-氨基萘(2-ANP)、4-氨基聯(lián)苯(4-ABP)的保留時間分別為11.15、17.81、10.05、19.82、18.18和22.69min。

實施例2

將肯塔基參考卷煙3R4F按照ISO 3308:2000規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)條件抽吸，每張劍橋濾片收集5支卷煙的粒相物，裝有25mL 2％甲酸溶液的吸收瓶收集氣相物。

然后按照實施例1的所述步驟和條件，進(jìn)行樣品處理與分析。進(jìn)行6次平行實驗和分5天測定，各個化合物測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在2.50～5.52％和2.24～6.69之間，說明該方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性很好。

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