本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及液相色譜法分離測(cè)定依普利酮中間體及其有關(guān)物質(zhì)的方法。

背景技術(shù)：

依普利酮的化學(xué)名為9,11α-Epoxy-7α-(methoxycarbonyl)-3-oxo-17α-pregn-4-ene-21,17-carbolactone，分子式為C₂₄H₃₀O₆。依普利酮是一種選擇性醛固酮受體拮抗藥，用于治療高血壓和其他心血管疾病，對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制藥和血管緊張素II受體抑制藥作用不佳的低腎素水平的原發(fā)性高血壓患者，有良好降壓效果。此外，依普利酮還可以顯著減輕腎小球的超濾作用，從而減輕高血壓患者的白蛋白尿，對(duì)合并糖尿病的高血壓患者有明顯的腎臟保護(hù)作用。依普利酮中間體的化學(xué)名為11α,17β-二羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α-羧酸甲酯-21-羧酸-γ-內(nèi)酯，分子式為C₂₄H₃₂O₆，結(jié)構(gòu)式為：

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在合成依普利酮的過程中，需要控制一些重要中間體的純度，以減少副反應(yīng)的發(fā)生和雜質(zhì)的生成，從而提高產(chǎn)物收率和純度。對(duì)于依普利酮中間體11α,17β-二羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α-羧酸甲酯-21-羧酸-γ-內(nèi)酯需要控制的有關(guān)物質(zhì)有2個(gè)，分別是11α，17β-二羥基-3-氧代孕甾-4，6-二烯-21-羧酸-γ-內(nèi)酯（有關(guān)物質(zhì)1），5β-氰基-11α，17β-二羥基-3，5’-氧代-4，7-次甲基孕甾-21-羧酸-γ-內(nèi)酯（有關(guān)物質(zhì)2），結(jié)構(gòu)式分別為：

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依普利酮中間體中的雜質(zhì)去除不完全，將會(huì)引起副反應(yīng)的發(fā)生和雜質(zhì)的生成，最終影響藥物純度和質(zhì)量。因此，實(shí)現(xiàn)依普利酮中間體及其有關(guān)物質(zhì)的分離，在依普利酮的生產(chǎn)及其質(zhì)量控制方面具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種分析依普利酮中間體化學(xué)純度以及分離其有關(guān)物質(zhì)的方法，從而實(shí)現(xiàn)依普利酮中間體與其有關(guān)物質(zhì)的分離和測(cè)定，保證依普利酮中間體的純度，實(shí)現(xiàn)依普利酮的質(zhì)量可控。

本發(fā)明所述的用液相色譜法分析依普利酮中間體化學(xué)純度以及分離其有關(guān)物質(zhì)的方法，是采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱，以一定比例的有機(jī)相-緩沖鹽溶液為流動(dòng)相。

上述所說的色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，色譜柱選自YMC、Alltima和Welch等品牌。

上述所說的有機(jī)相選自以下化合物中的一種或幾種：甲醇、乙腈、丙醇、異丙醇、四氫呋喃等，優(yōu)選乙腈和甲醇的混合溶液，比例優(yōu)選乙腈：甲醇-3：2。

上述所說的方法，其流動(dòng)相有機(jī)相-緩沖鹽溶液采用等度洗脫。

上述所說的方法中，緩沖鹽溶液選自磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、高氯酸鹽，優(yōu)選乙酸鹽。

其中緩沖鹽溶液的濃度為0.01～0.1mol/L，優(yōu)選濃度為0.01mol/L。

本發(fā)明所述的分離測(cè)定方法，可按照以下方法實(shí)現(xiàn)：

1) 取依普利酮中間體樣品適量，用乙腈或流動(dòng)相溶解樣品，配制成每1mL含依普利酮0.1～1.5mg的樣品溶液。

2) 設(shè)置流動(dòng)相流速為0.5～1.5mL/min，流動(dòng)相流速優(yōu)選為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為205～300nm，優(yōu)選240nm檢測(cè)依普利酮中間體及其未知雜質(zhì)，優(yōu)選210nm檢測(cè)有關(guān)物質(zhì)2，優(yōu)選280nm檢測(cè)有關(guān)物質(zhì)1，柱溫箱溫度為10～50℃，柱溫箱溫度最佳為40℃。

3) 取1)的樣品溶液10～50μL，注入液相色譜儀，完成依普利酮中間體與其有關(guān)物質(zhì)的分離測(cè)定。其中：

高效液相色譜儀的型號(hào)，無特別要求，本發(fā)明采用的色譜儀為島津高效液相色譜儀：LC-20AT泵，SPD-M20A檢測(cè)器，SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器，CBM-20A控制器，CTO-10ASvp柱溫箱，LC solution工作站

色譜柱：C18（YMC，150×4.6 mm，3μm）

流動(dòng)相：乙腈：甲醇：0.01M乙酸銨緩沖液-24：16：60

流速：1.0mL/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm、240nm、280nm

進(jìn)樣體積：20μL

本發(fā)明采用C18（YMC，150×4.6 mm，3μm），能夠有效的分離依普利酮中間體及其有關(guān)物質(zhì)。本發(fā)明解決了依普利酮中間體及其有關(guān)物質(zhì)的分離測(cè)定問題，從而減少了副反應(yīng)的發(fā)生和雜質(zhì)的生成，提高了終產(chǎn)品的收率和純度，保證了依普利酮的質(zhì)量可控。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1時(shí)依普利酮中間體及其有關(guān)物質(zhì)240nm波長(zhǎng)下HPLC圖；

圖2為實(shí)施例1時(shí)依普利酮中間體及其有關(guān)物質(zhì)210nm波長(zhǎng)下HPLC圖；

圖3為實(shí)施例1時(shí)依普利酮中間體及其有關(guān)物質(zhì)280nm波長(zhǎng)下HPLC圖；

圖4為實(shí)施例2時(shí)依普利酮中間體及其有關(guān)物質(zhì)240nm波長(zhǎng)下HPLC圖；

圖5為實(shí)施例2時(shí)依普利酮中間體及其有關(guān)物質(zhì)210nm波長(zhǎng)下HPLC圖；

圖6為實(shí)施例2時(shí)依普利酮中間體及其有關(guān)物質(zhì)280nm波長(zhǎng)下HPLC圖；

圖7為實(shí)施例2時(shí)依普利酮中間體240nm波長(zhǎng)下HPLC圖；

圖8為實(shí)施例2時(shí)空白溶劑240nm波長(zhǎng)下HPLC圖；

圖9為實(shí)施例2時(shí)空白溶劑210nm波長(zhǎng)下HPLC圖；

圖10為實(shí)施例2時(shí)空白溶劑280nm波長(zhǎng)下HPLC圖。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例用于進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不限于本實(shí)施的范圍。

實(shí)施例1

儀器與條件：

高效液相色譜儀：島津：LC-20AT， CBM-20A，SIL-20AC，SPD-M20A，CTO-10ASvp；

色譜柱：C18（YMC，150×4.6 mm，3μm）；

流動(dòng)相：乙腈：甲醇：0.01M乙酸銨緩沖液-20：20：60；

流速：1.0mL/min；

檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm、240nm、280nm；

進(jìn)樣體積：20μL；

柱溫：40℃。

實(shí)驗(yàn)步驟：

取依普利酮中間體及其有關(guān)物質(zhì)適量，分別用乙腈溶解樣品，配制成含依普利酮中間體及其有關(guān)物質(zhì)約1.0mg/mL的樣品溶液。按上述條件進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜圖。結(jié)果見附圖1~3，圖1中保留時(shí)間為20.460min的色譜峰為依普利酮中間體，其余色譜峰為依普利酮中間體各有關(guān)物質(zhì)的色譜峰；圖2中保留時(shí)間為9.304min的色譜峰為依普利酮中間體有關(guān)物質(zhì)2，保留時(shí)間為20.460min的色譜峰為依普利酮中間體，保留時(shí)間為30.649min的色譜峰為依普利酮中間體有關(guān)物質(zhì)1；圖3中保留時(shí)間為30.638min的色譜峰為依普利酮中間體有關(guān)物質(zhì)1，保留時(shí)間為20.459min的色譜峰為依普利酮中間體。

實(shí)施例2

儀器與條件：

高效液相色譜儀：島津：LC-20AT， CBM-20A，SIL-20AC，SPD-M20A，CTO-10ASvp；

色譜柱：C18（YMC，150×4.6 mm，3μm）；

流動(dòng)相：乙腈：甲醇：0.01M乙酸銨緩沖液-24：16：60；

流速：1.0mL/min；

檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm、240nm、280nm；

進(jìn)樣體積：20μL；

柱溫：40℃。

實(shí)驗(yàn)步驟：

取依普利酮中間體及其有關(guān)物質(zhì)適量，分別用乙腈溶解樣品，配制成含依普利酮中間體及其有關(guān)物質(zhì)約1.0mg/mL的樣品溶液。按上述條件進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜圖。結(jié)果見附圖4~10，圖4中保留時(shí)間為17.265min的色譜峰為依普利酮中間體，其余色譜峰為依普利酮中間體各有關(guān)物質(zhì)的色譜峰；圖5中保留時(shí)間為8.248min的色譜峰為依普利酮中間體有關(guān)物質(zhì)2，保留時(shí)間為17.265min的色譜峰為依普利酮中間體；圖6中保留時(shí)間為25.822min的色譜峰為依普利酮中間體有關(guān)物質(zhì)1，保留時(shí)間為17.265min的色譜峰為依普利酮中間體；圖7中保留時(shí)間為17.082min的色譜峰為依普利酮中間體；圖8~10分別為空白溶劑在240nm、210nm和280nm波長(zhǎng)下的色譜圖。由圖可以看出，在該色譜條件下依普利酮中間體與其有關(guān)物質(zhì)可以完全分離，符合中國(guó)藥典的要求。

對(duì)上述依普利酮中間體及其有關(guān)物質(zhì)分析方法的以下項(xiàng)目進(jìn)行了驗(yàn)證：

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

根據(jù)上述實(shí)施例2確定的色譜條件，分別用依普利酮中間體和各有關(guān)物質(zhì)的混合溶液來分析此色譜條件是否符合要求。由圖4-6可見此條件下各個(gè)有關(guān)物質(zhì)與主峰之間分離度符合要求，峰純度和單點(diǎn)閥值均符合要求。

溶液穩(wěn)定性

將依普利酮中間體與其各有關(guān)物質(zhì)的混合溶液，分別于0、2、4、6、8、12小時(shí)進(jìn)樣，考察樣品定量測(cè)定時(shí)溶液的穩(wěn)定性，由結(jié)果可見，本溶液在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定；

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耐用性

為了進(jìn)一步驗(yàn)證方法的穩(wěn)定性，我們將流速、柱溫和色譜柱品牌這些條件進(jìn)行相應(yīng)的微調(diào)，以考察色譜條件的耐用性。

結(jié)果表明，流速變化在±0.2ml/min范圍內(nèi)，柱溫變化在±5℃范圍內(nèi)，峰型沒有變化，僅保留時(shí)間有相應(yīng)的前移和后移。色譜柱的耐用性考察中，更換為Alltima和Welch色譜柱后，各物質(zhì)保留時(shí)間和分離度無明顯變化，各物質(zhì)峰純度和分離度均符合要求。