本發(fā)明涉及一種基于金-石墨烯納米組裝體對Mucin-1手性信號超靈敏檢測的方法，屬于材料化學技術領域。

背景技術：

黏蛋白是重要的糖蛋白，它是由在粘膜表面的粘液凝膠層組成。粘蛋白固定在細胞表面形成凝膠基質(zhì)，作為細胞的防御屏障，其黏膜保護和通信與外部環(huán)境發(fā)揮了重要作用。粘蛋白家族包括21個成員名叫Muc1-muc21，已分為分泌型和膜型。其中，粘蛋白1（Mucin-1）是由一個疏水的跨膜結構域，胞質(zhì)結構域，和胞外結構域構成。Mucin-1 是一種廣泛表達于導管上皮細胞的跨膜糖蛋白，其多肽骨架由多個串聯(lián)的重復序列( variable number of tandem repeats，VNTR) 組成。正常導管上皮細胞中 Mucin-1 的 VNTR 結構域高度糖基化，而 IBD 患者結腸上皮組織中高表達一種 VNTR結構域低糖基化的突變型 Mucin-1。Mucin-1是已知的與多種癌癥（如乳腺癌、胃癌和肺癌）的發(fā)生相關。因此，靈敏的檢測Mucin1在腫瘤的初步診斷中具有非常重要的意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于金-石墨烯納米組裝體對Mucin-1手性信號超靈敏檢測的方法，首先通過在金納米粒子的表面修飾Mucin 1的適配體，在石墨烯表面修飾與Mucin-1適配體部分互補的序列，隨著DNA的雜交組裝成金-石墨烯納米自組裝體，并對其圓二色性質(zhì)進行了研究和探討。加入不同濃度的Mucin-1溶液，對金-石墨烯自組裝體的手性信號進行測試，以達到對Mucin-1的超靈敏檢測的目的。

本發(fā)明的技術方案，一種基于金-石墨烯納米組裝體對Mucin-1手性信號超靈敏檢測的方法，將偶聯(lián)有Mucin-1適配體的金納米粒子和偶聯(lián)有與Mucin-1適配體部分互補序列的石墨烯組裝得到金-石墨烯納米組裝體，當存在有待測物Mucin-1時，組裝體的結構發(fā)生改變，金納米粒子從組裝體上解離，進而引起組裝體手性信號的改變，從而實現(xiàn)對Mucin-1的超靈敏檢測；具體步驟如下：

（1）檢測傳感器的構建：

a、金納米粒子上修飾Mucin-1適配體Mucin-1 aptamer：采用檸檬酸還原法合成的金納米粒子，將其離心濃縮后，重懸于超純水中，濃度為5nM；取100μL濃縮重懸后的金納米粒子，加入2μL 10μM巰基化的Mucin-1 aptamer，和終濃度為50mM的NaCl溶液中，37℃孵育過夜，得到偶聯(lián)了Mucin-1 aptamer的金納米粒子溶液，待用；

b、石墨烯偶聯(lián)Mucin-1適配體部分互補序列Mucin-1 CS：取破碎后的石墨烯用超純水稀釋使終濃度為0.1mg/ml；按EDC、NHS和石墨烯的摩爾比為1000︰1000︰1，加入EDC和NHS，在避光的情況下反應2h；之后，用截留量30k的超濾管過濾，用pH為7.5、10mM的PB緩沖液重懸；向其中加入終濃度2μM的Mucin-1 CS，反應3h，得到石墨烯- Mucin-1 CS溶液，待用；

c、金-石墨烯納米結構的組裝：取100μL步驟a制備的金納米粒子偶聯(lián)Mucin-1aptamer溶液7500rpm離心10min，除去上清；取100μL步驟b制得的石墨烯- Mucin-1 CS溶液用超濾管過濾；最后兩種過濾物混合于100μL含有50mM NaCl、50mM Mg(NO₃)₂ 和質(zhì)量濃度為 0.01% SDS的10mM TBE 緩沖液中，雜交12h；梯度離心，用超純水重懸，得到高產(chǎn)率的金-石墨烯納米組裝體；

（2）圓二色光譜檢測：建立金-石墨烯納米組裝體手性信號與Mucin-1濃度的標準曲線，根據(jù)Mucin-1濃度與金-石墨烯納米組裝體手性信號強度的關系建立兩者之間的標準曲線，從而應用手性信號對Mucin-1濃度進行檢測。

步驟（2）具體如下：金納米粒子偶聯(lián)Mucin-1 aptamer，石墨烯偶聯(lián) Mucin-1 CS，兩者混合于100μL含有50mM NaCl、50mM Mg(NO₃)₂和質(zhì)量濃度為0.01% SDS的10mM TBE 緩沖液后，分別加入不同濃度的目標物Mucin-1，室溫孵育12h，由于Mucin-1會與Mucin-1 aptamer的特異性結合，隨著Mucin-1濃度的增加，金-石墨烯納米組裝體會有不同程度的解離，因此得到不同的手性信號強度；根據(jù)Mucin-1濃度與金-石墨烯納米組裝體手性信號強度的關系建立兩者之間的標準曲線，從而應用手性信號對Mucin-1濃度進行檢測。

所述Mucin-1 aptamer序列和Mucin-1 CS序列如表1所示。

表1：

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明制備出了組裝產(chǎn)率高，性質(zhì)穩(wěn)定的金-石墨烯納米自組裝體，提供了能夠通過圓二色光譜超靈敏檢測Mucin-1濃度的方法，建立了Mucin-1濃度與金-石墨烯納米組裝體圓二色信號強度兩者之間的標準曲線，具有靈敏度高、選擇性好，省時省力的優(yōu)點，具有非常好的實際應用前景。

附圖說明

圖1 本發(fā)明的金-石墨烯納米自組裝體的透射電鏡圖。

圖2 本發(fā)明中向金-石墨烯納米自組裝體中加入不同濃度的Mucin-1，導致的圓二色光譜的變化圖。

具體實施方式

以下實施例所用試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

實施例1

（1）檢測傳感器的構建：

a、金納米粒子上修飾Mucin-1適配體：采用檸檬酸還原法合成的金納米粒子，將其離心濃縮后，重懸于超純水中，濃度為5nM；取100μL濃縮重懸后的金納米粒子，加入2μL 10μM巰基化的Mucin-1 aptamer，和終濃度為50mM的NaCl溶液中，37℃孵育過夜，得到偶聯(lián)了Mucin-1 aptamer的金納米粒子溶液，待用；

b、石墨烯偶聯(lián)Mucin-1適配體部分互補序列Mucin-1 CS：取破碎后的石墨烯用超純水稀釋使終濃度為0.1mg/mL；按EDC、NHS和石墨烯的摩爾比為1000︰1000︰1，加入EDC和NHS，在避光的情況下反應2h；之后，用截留量30k的超濾管過濾，pH為7.5、10mM的PB緩沖液重懸；向其中加入終濃度2μM的Mucin-1 CS，反應3h，得到石墨烯- Mucin-1 CS溶液，待用；

c、金-石墨烯納米結構的組裝：100μL金納米粒子偶聯(lián)Mucin-1 aptamer溶液7500rpm離心10min，除去上清；100μL石墨烯- Mucin-1 CS溶液用超濾管過濾，最后兩種過濾物混合于100μL含有50mM NaCl、50mM Mg(NO₃)₂ 和 0.01% SDS的10mM TBE 緩沖液中，雜交12h；梯度離心，用超純水重懸，得到高產(chǎn)率的金-石墨烯納米組裝體，如圖1所示；

（2）圓二色光譜檢測：建立金-石墨烯納米組裝體手性信號與Mucin-1濃度的標準曲線，如圖2所示。根據(jù)Mucin-1濃度與手性信號強度的關系建立兩者之間的標準曲線，從而應用手性信號對Mucin-1濃度進行檢測。

Mucin-1 aptamer序列為：

5’-SH-AAAAAGCAGT TGATCCTTTG GATACCCTGG T-3’；

Mucin-1 CS序列為：5’- SH-AAAAAATCCA AAGGATGTTC TG-3’。