本發(fā)明涉及一種中藥材原材料的檢測方法，具體地涉及一種鮮冬蟲夏草鮮度的測定方法。技術(shù)背景冬蟲夏草是高級滋補名貴中藥材，傳統(tǒng)上具有補肺益腎，化痰止咳的功效?，F(xiàn)代研究表明，冬蟲夏草還有很多方面功效，常用于惡性腫瘤的輔助治療、降血壓、降血脂、調(diào)節(jié)免疫功能等。剛采挖的鮮冬蟲夏草最大程度的保留了營養(yǎng)成分，并且外觀飽滿、口感好，所以催生了近年的鮮冬蟲夏草產(chǎn)品。鮮冬蟲夏草在出土、清洗、滅菌、包裝、儲存的過程中，會對鮮度造成一定的損害。隨著鮮冬蟲夏草的鮮度降低，其營養(yǎng)和功效成分及外觀、口感都會受到一定影響。因此，如何評判冬蟲夏草的鮮度成為一個重要的研究課題?，F(xiàn)有技術(shù)中對鮮品的鮮度一般通過感官評價，但是這種傳統(tǒng)方法需要訓(xùn)練有素的專業(yè)鑒評人員，并且這些人員易受其健康狀況、年齡、性別、性情、表達能力等多種因素的影響，鑒評結(jié)果往往主觀性強、重復(fù)性差、并且容易出現(xiàn)感官疲勞，目前尚未見對冬蟲夏草鮮度進行研究的報道，開發(fā)一種客觀量化的方法來測定冬蟲夏草的新鮮度十分必要。四氮唑法(TTC法)用于評價鮮品的活力在真菌類及植物類領(lǐng)域有報道，原理主要是細胞呼吸進行的脫氫酶作用，使脫下的氫氧化2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)還原生成紅色的三苯基甲臜(TTF)，進行比色定量。但根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)文獻進行測定存在對專業(yè)操作技能要求較高且操作復(fù)雜、耗時較長的問題。如中國專利申請(CN104990881A)一種快速檢測羊肚菌菌絲活力的辦法，羊肚菌菌株需在特定培養(yǎng)基上23℃培養(yǎng)10d，再轉(zhuǎn)至另一培養(yǎng)基中培養(yǎng)6d后進行TTC染色定量檢測。也有不少文獻將TTC法用于中藥材超低溫保存后的細胞相對活力的檢測，但也存在操作復(fù)雜、耗時較長的問題。如文獻《人參細胞TTC-脫氫酶活力測定條件的優(yōu)化》，將人參葉片誘導(dǎo)而成的愈傷組織繼代培養(yǎng)15d左右，接種于MS液體培養(yǎng)基中，置于搖床上25℃培養(yǎng)10d得人參細胞；且TTC染色反應(yīng)時間需18h。以上技術(shù)文獻除了操作復(fù)雜、耗時太長外，直接應(yīng)用于冬蟲夏草鮮度檢測還存在重現(xiàn)性差，實驗成本高，不能準確反映冬蟲夏草鮮度等問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種鮮冬蟲夏草鮮度的測定方法，該方法能夠簡單、快速、準確的判斷鮮冬蟲夏草的鮮度。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案包括以下步驟：(1)供試品溶液制備：a.將鮮冬蟲夏草進行前處理后，切片，厚度為1～2mm；b.取步驟a中鮮冬蟲夏草切片置于質(zhì)量分數(shù)為0.3％的2,3,5-氯化三苯基四氮唑溶液中，37℃恒溫避光染色，染色后，在暗室中用蒸餾水洗滌切片；c.將步驟b染色后的切片破碎，用有機溶劑在避光、50-60℃恒溫萃取至切片為白色，得到萃取液，即為供試品溶液；(2)對照品溶液制備：將質(zhì)量分數(shù)為0.3％的2,3,5-氯化三苯基四氮唑溶液與質(zhì)量分數(shù)為0.1％連二亞硫酸鈉以1:5的體積比混合反應(yīng)生成三苯基甲臜，離心，沉淀部分用無水乙醇溶解得母液，取母液用無水乙醇配制不同濃度梯度的三苯基甲臜溶液，即為對照品溶液；(3)吸光光度值OD485測定：使用酶標儀在485nm波長處測步驟(1)、(2)中供試品溶液與對照品溶液的吸光值；(4)鮮度計算：根據(jù)步驟(3)中三苯基甲臜對照品的濃度與對應(yīng)吸光值OD485，建立兩者標準曲線方程；結(jié)合標準曲線方程和測定的供試品吸光度值計算供試品中三苯基甲臜的質(zhì)量濃度c1，進而計算每克鮮冬蟲夏草樣品中表征其鮮度的脫氫酶活力X，X＝(c1*v)/m其中X表示樣品中脫氫酶的活力，μg/g；c1表示根據(jù)標準曲線方程計算所得的供試品溶液中三苯基甲臜的濃度，μg/mL；m表示樣品的質(zhì)量，g；v表示萃取液的體積，mL。優(yōu)選地，步驟(1)中所述前處理方法為：將整根鮮冬蟲夏草浸泡于37℃的5％葡萄糖溶液中15min。優(yōu)選地，步驟(1)所述切片部位為鮮冬蟲夏草蟲體頭部起第4-7對足區(qū)段。更優(yōu)選地，步驟(1)所述切片部位為鮮冬蟲夏草蟲體頭部起第4-7對足區(qū)段的中間部位。優(yōu)選地，步驟(1)所述染色的時間為2h。優(yōu)選地，步驟(1)所述有機溶劑為無水乙醇。優(yōu)選地，步驟(1)中鮮冬蟲夏草切片與萃取用有機溶劑的質(zhì)量體積比為1:25，g/mL。優(yōu)選地，步驟(1)中萃取時間為20-30min。優(yōu)選地，所述2,3,5-氯化三苯基四氮唑溶液用pH7.3-7.5的磷酸緩沖液溶解配制而成。本發(fā)明的有益效果為：1.本發(fā)明對低溫冷藏的鮮冬蟲夏草進行了5％葡萄糖溶液恒溫浸泡處理，最大限度的維持鮮冬蟲夏草的活力，能夠真實的反映儲存環(huán)境中冬蟲夏草的新鮮度。2.本發(fā)明在大量實驗過程中發(fā)現(xiàn)，同一根鮮冬蟲夏草的不同區(qū)段活力強弱不一致，其中蟲體頭部起第4-7對足區(qū)段為活力最強區(qū)段。選取這一區(qū)段為檢測對象，既可避免實驗材料的浪費又使結(jié)果真實、靈敏、可靠。3.本發(fā)明可以快速判斷鮮冬蟲夏草的鮮度，染色加萃取時間大大縮短，即3小時內(nèi)就可以得到檢測結(jié)果，大大節(jié)省了人力和時間成本。4.本發(fā)明所用的儀器常見且種類少，試劑用量少，實驗成本低，步驟簡單，沒有復(fù)雜繁瑣的過程，易于學(xué)習(xí)和操作，適用于大規(guī)模推廣使用。附圖說明圖1是鮮冬蟲夏草整體圖，冬蟲夏草蟲體具有8對足，胸足3對，靠近頭部，腹足4對，尾足1對，其中A是子座區(qū)段，B是蟲體頭部至第4對足區(qū)段，C是蟲體頭部起第4-7對足區(qū)段，D是蟲體頭部起第7對足至尾部區(qū)段。圖2是實施例1中TTF濃度-吸光值OD485標準曲線圖。具體實施方式下面結(jié)合附表和實施例對本發(fā)明作進一步說明：以下實施例中所述鮮冬蟲夏草區(qū)段切片(子座區(qū)段，蟲體頭部至第4對足區(qū)段，蟲體頭部起第4-7對足區(qū)段，蟲體頭部起第7對足至尾部區(qū)段)都為該區(qū)段中間部分切片。實施例1考察不同前處理對鮮冬蟲夏草鮮度的影響，具體步驟如下：(1)供試品溶液制備：a.將同一批次在-5℃～-10℃儲存2個月左右的6根鮮冬蟲夏草從儲存環(huán)境中取出，分為2組(5％葡糖糖處理組和室溫處理組)，每組3根。5％葡糖糖處理組放置于預(yù)熱至37℃的5％葡萄糖溶液中37℃水浴處理15min，室溫處理組為室溫放置15min，然后將6根鮮冬蟲夏草蟲體部分從頭部起第4-7對足區(qū)段進行均勻切片，厚度為1～2mm；b.分別取步驟a中6根鮮冬蟲夏草切片0.2g，每3根相同處理為1組，共2個組，分別置于盛有質(zhì)量分數(shù)為0.3％TTC溶液(用pH7.3-7.5的磷酸緩沖液溶解配制而成)的6個燒杯中，37℃恒溫水浴避光染色，染色2h后，取出鮮冬蟲夏草切片，在暗室中用蒸餾水洗滌2～3次，洗滌之后用吸水紙去除切片表面的水分；c.將步驟b染色后的切片剪碎，用5mL無水乙醇在避光、50-60℃恒溫、震蕩水浴的條件下萃取20～30min，至切片為白色，得到萃取液，即為6個供試品溶液；(2)對照品溶液制備：將質(zhì)量分數(shù)為0.3％TTC溶液(用pH7.3-7.5的磷酸緩沖液溶解配制而成)0.2mL與質(zhì)量分數(shù)為0.1％連二亞硫酸鈉1mL混合反應(yīng)生成三苯基甲臜，離心，棄去上清液，用無水乙醇溶解沉淀并定容至10mL，為母液，分別取母液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL于10mL比色管中，用無水乙醇定容，配制6個濃度梯度的三苯基甲臜溶液，即為對照品溶液；(3)吸光光度值OD485測定：使用酶標儀在485nm波長處測步驟(1)、(2)中6份供試品溶液與6個對照品溶液的吸光值；(4)鮮度計算：根據(jù)步驟(3)中6個三苯基甲臜對照品的濃度與對應(yīng)吸光值OD485，建立兩者標準曲線方程；將測定的供試品吸光度值代入標準曲線方程即可計算出三苯基甲臜的質(zhì)量濃度c1，進而計算每克冬蟲夏草樣品中表征其鮮度的脫氫酶活力X，X＝(c1*v)/m；其中X表示樣品中脫氫酶的活力，μg/g；c1表示根據(jù)標準曲線方程計算所得的供試品溶液中三苯基甲臜的濃度，μg/mL；m表示樣品的質(zhì)量，g；v表示萃取液的體積，mL。測定結(jié)果與計算值，見表1和表2：表1：不同濃度TTF測定值TTF濃度(μg/mL)1.083.235.387.539.6811.83OD值0.03290.10030.16940.23380.29600.3619由表1中數(shù)據(jù)計算TTF濃度與吸光度值的標準曲線方程為：y＝0.0305x+0.0022，R2＝0.9997。表2：不同前處理對鮮冬蟲夏草鮮度影響的檢測結(jié)果脫氫酶活力單位的計算：將得到的6份供試品溶液的吸光度值分別代入標準曲線方程y＝0.0305x+0.0022中，計算出標準曲線上對應(yīng)的樣品測定液中TTF的濃度c1，分別代入酶活力計算公式X＝(c1*5mL)/0.2g，進而得出經(jīng)5％葡糖糖處理的鮮冬蟲夏草中脫氫酶平均活力為0.26μg/g；而經(jīng)室溫處理的脫氫酶平均活力為0.22μg/g。分析可知，從儲存環(huán)境取出的鮮冬蟲夏草浸泡于5％葡萄糖溶液中進行前處理后，能更好的反映鮮冬蟲夏草在儲存環(huán)境下的活力及鮮度。實施例2考察鮮冬蟲夏草不同部位對鮮度測定的影響，具體步驟如下：(1)供試品溶液制備：a.將同一批次在-5℃～-10℃儲存2個月左右的3根鮮冬蟲夏草從儲存環(huán)境中取出，置于預(yù)熱至37℃的5％葡萄糖溶液中37℃水浴處理15min，然后將3根鮮冬蟲夏草分為4個區(qū)段(鮮冬蟲夏草子座區(qū)段、蟲體頭部至第4對足區(qū)段、蟲體頭部起第4-7對足區(qū)段、蟲體頭部起第7對足至尾部區(qū)段)進行均勻切片，厚度為1～2mm；b.分別取步驟a中3根鮮冬蟲夏草4個不同區(qū)段切片0.2g，每3根相同區(qū)段為一組，共4個組，分別置于盛有質(zhì)量分數(shù)為0.3％TTC溶液(用pH7.3-7.5的磷酸緩沖液溶解配制而成)的12個燒杯中，37℃恒溫水浴避光染色，染色2h后，取出鮮冬蟲夏草切片，在暗室中用蒸餾水洗滌2～3次，洗滌之后用吸水紙去除切片表面的水分；c.將步驟b染色后的切片剪碎，用5mL無水乙醇在避光、50-60℃恒溫、震蕩水浴的條件下萃取20～30min，至切片為白色，得到萃取液，即為12個供試品溶液；(2)對照品溶液制備：方法同實施例1。(3)吸光光度值OD485測定：方法同實施例1，測步驟(1)、(2)中12份供試品溶液與6個對照品溶液的吸光值；(4)鮮度計算：方法同實施例1測試結(jié)果見下表3表3：不同區(qū)段鮮冬蟲夏草鮮度影響的檢測結(jié)果脫氫酶活力單位的計算：將得到的12份供試品溶液的吸光度值分別代入標準曲線方程，計算出各個樣品萃取液生成的TTF的濃度c1，分別代入酶活力計算公式X＝(c1*5mL)/0.2g，進而求出鮮冬蟲夏草中子座區(qū)段脫氫酶平均活力為0.19μg/g；蟲體頭部至第4對足區(qū)段的脫氫酶平均活力為0.17μg/g；蟲體頭部起第4-7對足區(qū)段的脫氫酶平均活力為0.26μg/g，蟲體頭部起第7對足至尾部區(qū)段平均酶活力為0.22μg/g。分析可知，鮮冬蟲夏草不同區(qū)段鮮度不一致，其中距鮮冬蟲夏草蟲體第4-7對足區(qū)段鮮度最強，靈敏度最高，能最快的反應(yīng)出鮮冬蟲夏草的新鮮度，故最能表征鮮冬蟲夏草的新鮮度。實施例3不同染色時間對鮮冬蟲夏草鮮度的影響，具體步驟如下：(1)供試品溶液制備：a.將同一批次在-5℃～-10℃儲存1周左右的15根鮮冬蟲夏草從儲存環(huán)境中取出，置于預(yù)熱至37℃的5％葡萄糖溶液中37℃水浴處理15min，然后將15根鮮冬蟲夏草蟲體頭部起第4-7對足區(qū)段進行均勻切片，厚度為1～2mm；b.分別取步驟a中15根鮮冬蟲夏草切片0.2g，每3根為1組，共5個組，分別置于盛有質(zhì)量分數(shù)為0.3％TTC溶液(用pH7.3-7.5的磷酸緩沖液溶解配制而成)的15個燒杯中，37℃恒溫水浴避光染色，染色時間分別為0.5h、1h、2h、4h和8h后，取出鮮冬蟲夏草切片，在暗室中用蒸餾水洗滌2～3次，洗滌之后用吸水紙去除切片表面的水分；c.將步驟b染色后的切片剪碎，用5mL無水乙醇在避光、50-60℃恒溫、震蕩水浴的條件下萃取20～30min，至切片為白色，得到萃取液，即為15個供試品溶液；(2)對照品溶液制備：方法同實施例1。(3)吸光光度值OD485測定：方法同實施例1，步驟(1)、(2)中15份供試品溶液與6個對照品溶液的吸光值；(4)鮮度計算：方法同實施例1。測定結(jié)果，參見表4。表4：不同染色時間對鮮冬蟲夏草鮮度影響的檢測結(jié)果脫氫酶活力單位的計算：將得到的15份供試品溶液的吸光度值分別代入標準曲線方程中，計算出各個樣品萃取液生成的TTF的濃度c1，再代入酶活力計算公式X＝(c1*5mL)/0.2g，進而得出鮮冬蟲夏草染色0.5h時脫氫酶平均活力為0.16μg/g；染色1h時脫氫酶平均活力為0.40μg/g；染色2h時為0.54μg/g；染色4h時為0.52μg/g，染色8h時為0.47μg/g。分析可知，隨著染色時間的增加鮮冬蟲夏草程度先不斷加強后減弱，其中染色2h效果較為理想。實施例4不同儲存時間的鮮冬蟲夏草鮮度測定，具體步驟如下：a.將在-5℃～-10℃儲存時間分別為一周、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月的6組鮮冬蟲夏草從儲存環(huán)境中取出，每組3根，共18根，置于預(yù)熱至37℃的5％葡萄糖溶液中37℃水浴處理15min，然后將18根鮮冬蟲夏草蟲體頭部起第4-7對足區(qū)段進行均勻切片，厚度為1～2mm；b.分別取步驟a中18根鮮冬蟲夏草切片0.2g，每3根為1組，共6個組，分別置于盛有質(zhì)量分數(shù)為0.3％TTC溶液(用pH7.3-7.5的磷酸緩沖液溶解配制而成)的18個燒杯中，37℃恒溫水浴避光染色，染色2h后，取出鮮冬蟲夏草切片，在暗室中用蒸餾水洗滌2～3次，洗滌之后用吸水紙去除切片表面的水分；c.將步驟b染色后的切片剪碎，用5mL無水乙醇在避光、50-60℃恒溫、震蕩水浴的條件下萃取20～30min，至切片為白色，得到萃取液，即為18個供試品溶液；(2)對照品溶液制備：方法同實施例1(3)吸光光度值OD485測定：方法同實施例1，測步驟(1)、(2)中18份供試品溶液與6個對照品溶液的吸光值；(4)鮮度計算：方法同實施例1。測定結(jié)果，參見表5。表5：不同儲存時間對鮮冬蟲夏草鮮度影響的檢測結(jié)果脫氫酶活力單位的計算：將得到的18份供試品溶液的吸光度值分別代入標準曲線方程中，計算出各個樣品萃取液生成的TTF的濃度c1，分別代入酶活力計算公式X＝(c1*5mL)/0.2g，進而求出儲存時間為一周的冬蟲夏草中脫氫酶平均活力為0.53μg/g；儲存時間為一個月的脫氫酶平均活力為0.43μg/g；儲存時間為兩個月的為0.31μg/g；儲存時間為三個月的為0.21μg/g；儲存時間為四個月的為0.13μg/g；儲存時間為五個月的為0.05μg/g。分析可知，隨著儲存時間的增加鮮冬蟲夏草中脫氫酶的含量逐漸降低，呼吸作用減弱，活力及鮮度下降。最后應(yīng)當說明的是：以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對其限制；盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解：依然可以對本發(fā)明的具體實施方式進行修改或者對部分技術(shù)特征進行等同替換；而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明請求保護的技術(shù)方案范圍當中。當前第1頁1 2 3