本發(fā)明涉及一種牛乳寡糖測定方法。

背景技術(shù)：

寡糖(低聚糖)是少數(shù)單糖(2-10個)縮合的聚合物，可通過多糖水解得到，是牛奶中最豐富的固體組成之一。研究表明，牛乳寡糖可以作為益生元刺激新生兒腸道有益微生物的生長。然而，由于牛乳中寡糖種類和結(jié)構(gòu)的多樣性，及其極微量的含量，使得牛乳中寡糖含量的測定和結(jié)構(gòu)的測定存在很大挑戰(zhàn)，目前國內(nèi)并沒有一個牛乳寡糖的檢測方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種牛乳寡糖測定方法。

為此，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

一種牛乳寡糖測定方法，包括如下步驟：

步驟一、提取牛乳寡糖粗品；

步驟二、首先利用Sep-Pak C18柱將牛乳寡糖粗品進行純化，得到純化的牛乳寡糖液體，之后利用石墨化柱體將純化的牛乳寡糖體進行富集，得到富集的牛乳寡糖液體，最后將富集的牛乳寡糖液體干燥，得到牛乳寡糖；

步驟三、采用2-氨基吖啶酮衍生化試劑對步驟二中得到的牛乳寡糖進行衍生化處理；以及

步驟四、采用高效液相串聯(lián)離子阱飛行時間質(zhì)譜對衍生化的牛乳寡糖進行測定。

優(yōu)選的是，所述的牛乳寡糖測定方法中，以體積份數(shù)計，所述步驟一中，提取牛乳寡糖粗品的具體方法包括：

1.1)取100份牛乳，于10℃、10×10⁴g條件下超高速離心90min，除去底部的酪蛋白和上層的脂肪；以及

1.2)取50份中間水層加入100份的無水乙醇，4℃放置2h，于4℃、4000r/min條件下離心30min，重復(fù)離心兩次后，取上清液，然后用濃縮儀濃縮干燥，得到所述牛乳寡糖粗品。

優(yōu)選的是，所述的牛乳寡糖測定方法中，以體積份數(shù)計，所述步驟二中，利用Sep-Pak C18柱將牛乳寡糖粗品進行純化的具體方法包括：

2.1)首先用50份甲醇平衡Sep-Pak C18柱，然后用100份0.1％(v/v)TFA潤洗Sep-Pak C18柱子；以及

2.2)將所述牛乳寡糖粗品溶于2份0.1％(v/v)TFA中，然后上樣到Sep-Pak C18柱中，收集過柱液體，將收集的液體再次加入Sep-Pak C18中，再次收集過柱液體，重復(fù)2次，最后用30份0.1％TFA(v/v)沖洗Sep-Pak C18，也收集過柱液體，合并過柱液體得到所述純化的牛乳寡糖液體。

優(yōu)選的是，所述的牛乳寡糖測定方法中，以體積份數(shù)計，所述步驟二中，利用石墨化柱體將純化的牛乳寡糖液體進行富集的具體方法包括：

2.3)首先用3倍柱體積的含有0.10(v/v)％TFA的乙腈溶液80％(v/v)和純水依次通過石墨化柱體，然后將所述純化的牛乳寡糖液體上樣于所述石墨化柱體中，控制流速約0.5～1ml/min，收集過柱液體，將過柱液體重復(fù)通過所述石墨化柱體若干次；

2.4)用3倍柱體積的純水通過所述石墨化柱體；

2.5)分別采用5份含有0.10％(v/v)TFA的乙腈溶液10％(v/v)、含有0.10％(v/v)TFA的乙腈溶液20％(v/v)和含有0.10％(v/v)TFA的乙腈溶液40％(v/v)對所述石墨化柱體分步洗脫，收集洗脫液，得到所述富集的牛乳寡糖液體。

優(yōu)選的是，所述的牛乳寡糖測定方法中，所述步驟三中，以體積份數(shù)計，采用2-氨基吖啶酮衍生化試劑對步驟二中得到的牛乳寡糖進行衍生化處理的具體步驟包括：

3.1)將所述牛乳寡糖溶于0.5份濃度為0.1M的2-氨基吖啶酮中，該2-氨基吖啶酮的溶劑為體積比為3:17的冰醋酸和二甲基亞砜；

3.2)加入0.5份新鮮配制的濃度為1M的硼氰化鈉溶液，反應(yīng)后經(jīng)11000g離心3min，然后在45℃溫度下反應(yīng)4h，最后加入1.5份50％(v/v)的二甲基亞砜溶液，以用于步驟四中的測定。

優(yōu)選的是，所述的牛乳寡糖測定方法中，所述步驟四中，所述高效液相串聯(lián)離子阱飛行時間質(zhì)譜的液相條件為：

流動相A為乙腈，流動相B為濃度為10mM的甲酸銨pH4.5，

采用梯度洗脫：0～27min，95％～85％A；27min～29min，85％A；29min～31min，85％～84％A；31min～33min，84％A；33min～37min，84％-83％A；37min～48min，83％～79％A；48min～64min，79％～73％A；64min～66min，73％A；66min～74min，73％～69％A；74min～78min，69％～68％A；78min～85min，68％～65％A；液相剩余部分為流動相B。

優(yōu)選的是，所述的牛乳寡糖測定方法中，所述步驟四中，所述高效液相串聯(lián)離子阱飛行時間質(zhì)譜的質(zhì)譜條件為：

ESI離子源，正離子模式噴霧電壓為4.5kV，負(fù)離子模式噴霧電壓為-3.5kV，一級、二級離子掃描設(shè)為m/z 300～1000和m/z 1000～2000，加熱模塊和曲形脫溶劑管溫度均為200℃，氮氣流速為1.5L/min，離子累計時間為10ms，高純度氬氣作為CID碰撞及冷卻氣，檢測器電壓為1.58kV，IT真空為1.1×10^-2Pa，TOF真空1.2×10^-4Pa。

優(yōu)選的是，所述的牛乳寡糖測定方法中，所述步驟二中，所述干燥采用濃縮凍干。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

本發(fā)明利用Sep-Pak C18柱和石墨化碳柱對已脫脂和除去蛋白質(zhì)的牛乳進行分離純化，并采用2-氨基吖啶酮(2-Aminoacridone,AMAC)衍生化試劑對其進行衍生化處理，最終采用高效液相串聯(lián)離子阱飛行時間質(zhì)譜(highperformance liquid ion trap tandem time of flight-mass spectrometry,HPLC IT-TOF-MS)對牛乳中寡糖進行測定，鑒定了7種牛乳寡糖并實現(xiàn)了對該7種牛乳寡糖結(jié)構(gòu)組成的分析。

本發(fā)明試驗方法簡單可行、結(jié)果穩(wěn)定、可用于牛乳寡糖的分離和測定。

本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。

附圖說明

圖1為本發(fā)明其中一個實施例中質(zhì)量掃描范圍為300～1000D的寡糖的質(zhì)譜圖譜；

圖2為本發(fā)明其中一個實施例中質(zhì)量掃描范圍為1000～2000D的寡糖的質(zhì)譜圖譜。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。

應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語并不配出一個或多個其它元件或其組合的存在或添加。

本發(fā)明提供一種牛乳寡糖測定方法，包括如下步驟：

步驟一、提取牛乳寡糖粗品；

步驟二、首先利用Sep-Pak C18柱將牛乳寡糖粗品進行純化，得到純化的牛乳寡糖液體，之后利用石墨化柱體將純化的牛乳寡糖體進行富集，得到富集的牛乳寡糖液體，最后將富集的牛乳寡糖液體干燥，得到牛乳寡糖；

步驟三、采用2-氨基吖啶酮衍生化試劑對步驟二中得到的牛乳寡糖進行衍生化處理；衍生化是因為糖不帶發(fā)光基團，用2-AMAC使其帶上熒光基團，便于檢測，增加靈敏度。以及

步驟四、采用高效液相串聯(lián)離子阱飛行時間質(zhì)譜對衍生化的牛乳寡糖進行測定。高效液相串聯(lián)離子阱飛行時間質(zhì)譜是高分辨質(zhì)譜，能夠利用質(zhì)荷比來初步定性，初步定性后可進行打二級質(zhì)譜根據(jù)碎片來分析單糖組成。

在上述方案中，作為優(yōu)選，以體積份數(shù)計，所述步驟一中，提取牛乳寡糖粗品的具體方法包括：

1.1)取100份牛乳，于10℃、10×10⁴g條件下超高速離心90min，除去底部的酪蛋白和上層的脂肪；以及

1.2)取50份中間水層加入100份的無水乙醇，4℃放置2h，于4℃、4000r/min條件下離心30min，重復(fù)離心兩次后，取上清液，然后用濃縮儀濃縮干燥，得到所述牛乳寡糖粗品。

在上述方案中，作為優(yōu)選，，以體積份數(shù)計，所述步驟二中，利用Sep-Pak C18柱將牛乳寡糖粗品進行純化的具體方法包括：

2.1)首先用50份甲醇平衡Sep-Pak C18柱，然后用100份0.1％(v/v)TFA潤洗Sep-Pak C18柱子；以及

2.2)將所述牛乳寡糖粗品溶于2份0.1％(v/v)TFA中，然后上樣到Sep-Pak C18柱中，收集過柱液體，將收集的液體再次加入Sep-Pak C18中，再次收集過柱液體，重復(fù)2次，最后用30份0.1％TFA(v/v)沖洗Sep-Pak C18，也收集過柱液體，合并過柱液體得到所述純化的牛乳寡糖液體。

在上述方案中，作為優(yōu)選，以體積份數(shù)計，所述步驟二中，利用石墨化柱體將純化的牛乳寡糖液體進行富集的具體方法包括：

2.3)首先用3倍柱體積的含有0.10(v/v)％TFA的乙腈溶液80％(v/v)和純水依次通過石墨化柱體，然后將所述純化的牛乳寡糖液體上樣于所述石墨化柱體中，控制流速約0.5～1ml/min，收集過柱液體，將過柱液體重復(fù)通過所述石墨化柱體若干次；

2.4)用3倍柱體積的純水通過所述石墨化柱體；

2.5)分別采用5份含有0.10％(v/v)TFA的乙腈溶液10％(v/v)、含有0.10％(v/v)TFA的乙腈溶液20％(v/v)和含有0.10％(v/v)TFA的乙腈溶液40％(v/v)對所述石墨化柱體分步洗脫，收集洗脫液，得到所述富集的牛乳寡糖液體。

在本發(fā)明的其中一個實施例中，作為優(yōu)選，所述步驟三中，以體積份數(shù)計，采用2-氨基吖啶酮衍生化試劑對步驟二中得到的牛乳寡糖進行衍生化處理的具體步驟包括：

3.1)將所述牛乳寡糖溶于0.5份濃度為0.1M的2-氨基吖啶酮中，該2-氨基吖啶酮的溶劑為體積比為3:17的冰醋酸和二甲基亞砜；

3.2)加入0.5份新鮮配制的濃度為1M的硼氰化鈉溶液，反應(yīng)后經(jīng)11000g離心3min，然后在45℃溫度下反應(yīng)4h，最后加入1.5份50％(v/v)的二甲基亞砜溶液，以用于步驟四中的測定。

在本發(fā)明的其中一個實施例中，作為優(yōu)選，所述步驟四中，所述高效液相串聯(lián)離子阱飛行時間質(zhì)譜的液相條件為：

流動相A為乙腈，流動相B為濃度為10mM的甲酸銨pH4.5，

采用梯度洗脫：0～27min，95％～85％A；27min～29min，85％A；29min～31min，85％～84％A；31min～33min，84％A；33min～37min，84％-83％A；37min～48min，83％～79％A；48min～64min，79％～73％A；64min～66min，73％A；66min～74min，73％～69％A；74min～78min，69％～68％A；78min～85min，68％～65％A；液相剩余部分為流動相B。

在本發(fā)明的其中一個實施例中，作為優(yōu)選，所述步驟四中，所述高效液相串聯(lián)離子阱飛行時間質(zhì)譜的質(zhì)譜條件為：

ESI離子源，正離子模式噴霧電壓為4.5kV，負(fù)離子模式噴霧電壓為-3.5kV，一級、二級離子掃描設(shè)為m/z 300～1000和m/z 1000～2000，加熱模塊和曲形脫溶劑管溫度均為200℃，氮氣流速為1.5L/min，離子累計時間為10ms，高純度氬氣作為CID碰撞及冷卻氣，檢測器電壓為1.58kV，IT真空為1.1×10^-2Pa，TOF真空1.2×10^-4Pa。

在本發(fā)明的其中一個實施例中，作為優(yōu)選，所述步驟二中，所述干燥采用濃縮凍干。

實施例

牛乳寡糖的提取

(1)取10ml的牛乳，于10℃、10×10⁴g條件下超高速離心90min，除去底部的酪蛋白和上層的脂肪。

(2)取5ml中間水層加入10ml的無水乙醇，4℃放置2h，于4℃、4000r/min條件下離心30min(重復(fù)兩遍)后取上清液，然后用濃縮儀濃縮干燥，即為牛乳寡糖粗品。

牛乳寡糖的純化及富集

(1)用5ml甲醇平衡Sep-Pak C18柱(購自waters公司)，然后用10ml 0.1％TFA(三氟乙酸)潤洗Sep-Pak C18柱子。Sep-Pak C18用于除雜質(zhì)和一些小肽。

(2)將干燥的牛乳寡糖粗品溶于200μl 0.1％TFA，然后上樣到Sep-Pak C18柱。收集過柱液體，用200μl 0.1％TFA潤洗收集試管，將收集的液體加入Sep-Pak C18中，收集過柱液體，此步驟重復(fù)2次。最后用3ml 0.1％TFA沖洗Sep-Pak C18，也收集過柱液體，所得到收集液體為牛乳寡糖樣品。

(3)依次用3倍柱體積的80％乙腈溶液(含0.10％TFA)和純水通過石墨化柱體；將上一步的收集液上樣，控制流速約0.5～1ml/min(重復(fù)此步驟)。

(4)用3倍柱體積的純水通過石墨化柱體，為吸附于柱底PGC填料上的寡糖除鹽。

(5)最后用0.5ml的10％乙腈溶液(含0.10％TFA)，20％乙腈溶液(含0.10％TFA)，40％乙腈溶液(含0.10％TFA)將寡糖分步洗脫，收集洗脫液濃縮凍干用于衍生化。

牛乳寡糖2-氨基吖啶酮(2-AMAC)的衍生化

(1)純化后干燥的牛乳寡糖溶于50μl 0.1M 2-氨基吖啶酮(用冰醋酸和二甲基亞砜按3:17的體積比溶解)。

(2)加入50μl新鮮配制的1M硼氰化鈉溶液，反應(yīng)后經(jīng)11000g離心3min，然后在45℃溫度下反應(yīng)4h，最后加入150μl 50％的二甲基亞砜溶液直接用于高效液相串聯(lián)離子阱飛行時間質(zhì)譜分析。

高效液相串聯(lián)離子阱飛行時間質(zhì)譜分析條件

(1)液相條件

流動相A：乙腈，B：10mM甲酸銨(pH：4.5)

采用梯度洗脫：0～27min，95％～85％A；27min～29min，85％A；29min～31min，85％～84％A；

31min～33min，84％A；33min～37min，84％-83％A；37min～48min，83％～79％A；48min～64min，79％～73％A；64min～66min，73％A；66min～74min，73％～69％A；74min～78min，69％～68％A；78min～85min，68％～65％A。剩余為B。

(2)質(zhì)譜條件

ESI離子源，正離子模式噴霧電壓為4.5kV，負(fù)離子模式噴霧電壓為-3.5kV。一級、二級離子掃描設(shè)為m/z300～1000和m/z1000～2000兩個范圍。加熱模塊(BH)和曲形脫溶劑管(CDL)溫度均為200℃。氮氣流速為1.5L/min，離子累計時間為10ms。高純度氬氣作為CID碰撞及冷卻氣，檢測器電壓為1.58kV。IT真空為1.1×10-2Pa，TOF真空1.2×10-4Pa。

試驗結(jié)果及分析

將衍生化后的牛乳寡糖用優(yōu)化好的流動相條件通過高效液相色譜聯(lián)用離子阱-飛行時間-電噴霧質(zhì)譜(HPLC IT-TOF-MS)測定，由于寡糖質(zhì)量范圍為300～2000D，為獲得更好的精確度，根據(jù)質(zhì)量分為兩部分進行正負(fù)離子模式掃描。質(zhì)量掃描范圍為300～1000D和1000～2000D的質(zhì)譜譜圖如圖1和圖2所示。

在質(zhì)量范圍為300～1000D的質(zhì)譜測定中共鑒定6種糖成分，其中4種為寡糖，其余為單糖和雙糖；質(zhì)量范圍為1000～2000D的質(zhì)譜測定中鑒定出3種乳寡糖。兩個掃描段共測定出7種乳寡糖；實驗所測得的7種乳寡糖結(jié)構(gòu)如表1所示。

表1所得7種牛乳寡糖

○：Hex： Gal： Glc： NeuAc：◇NeuGc：

□：HexNAc： GalNAc： GlcNAc

這里說明的模塊數(shù)量和處理規(guī)模是用來簡化本發(fā)明的說明的。對本發(fā)明的XX的應(yīng)用、修改和變化對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。

盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。