本發(fā)明屬于中藥分析領(lǐng)域，具體涉及桃核承氣湯組合物的質(zhì)量控制方法。

背景技術(shù)：

中藥湯劑是臨床用藥的主流，但因起煎煮、攜帶不方便，煎煮制備的湯劑質(zhì)量往往因人、因煎煮器具而存在較大差異，而經(jīng)典名方臨床療效確切，因簡、便、驗(yàn)、廉而深受廣大消費(fèi)者喜愛，運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)將經(jīng)典名方開發(fā)承攜帶方便、便于服用的中藥制劑，不僅是對中醫(yī)藥的傳承，也是更好的促進(jìn)經(jīng)典名方的臨床應(yīng)用。顆粒劑制備工藝相對簡單、易于賦形，服用、攜帶方便，在服用形式上與傳統(tǒng)湯劑最為一致，能較大限度的保持傳統(tǒng)湯劑的特點(diǎn)，因此以湯劑形式服用的經(jīng)典名方選擇顆粒劑最為適宜。顆粒劑的開發(fā)應(yīng)遵循“原汁原味”的原則，在現(xiàn)有技術(shù)條件下，首先通過研究制備明確煎煮參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)(基準(zhǔn))湯劑，對基準(zhǔn)湯劑的關(guān)鍵質(zhì)量屬性進(jìn)行研究，主要以單處方標(biāo)準(zhǔn)湯劑的固含量(干膏率)、指紋圖譜、多指標(biāo)成分作為質(zhì)量參比，指導(dǎo)顆粒的研制。研究中為減少不同來源的飲片存在的質(zhì)量差異對一致性研究帶來影響，選擇隨行對照的方式，采用同一批次的飲片，煎煮至少10份標(biāo)準(zhǔn)湯劑，以其關(guān)鍵質(zhì)量的均值作為顆粒劑制備工藝參數(shù)研制的“基準(zhǔn)”。本發(fā)明采用指紋圖譜技術(shù)，結(jié)合多波長切換技術(shù)測定多指標(biāo)成分的方式對桃核承氣湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑(以下稱為第一桃核承氣湯組合物)、桃核承氣湯標(biāo)準(zhǔn)顆粒(以下稱為第二桃核承氣湯組合物)的質(zhì)量進(jìn)行全面評價(jià)。

桃核承氣湯出自漢代《傷寒論》，由該方由桃仁、大黃、甘草、桂枝、芒硝五味中藥組成，主治破血下淤，逐淤瀉熱，現(xiàn)代臨床常方常隨癥加減治療急性盆腔炎、附件炎、急性腦出血、卵巢囊腫、子宮內(nèi)異位癥等癥狀；目前在臨床上常加減治療“瘀熱互結(jié)”的上、中、下焦的病癥；在日本，桃核承氣湯作為漢方藥在藥店銷售排名第六位，因此，該方具有較強(qiáng)的開發(fā)價(jià)值。

桃核承氣湯組合物由桃仁、大黃、甘草、桂枝、芒硝五味中藥組成，主治破血下淤，逐淤瀉熱，現(xiàn)代臨床常方常隨癥加減治療急性盆腔炎、附件炎、急性腦出血、卵巢囊腫、子宮內(nèi)異位癥等癥狀；目前在臨床上常加減治療“瘀熱互結(jié)”的上、中、下焦的病癥；在日本，該方作為漢方藥在藥店銷售排名第六位，因此，該方具有較強(qiáng)的開發(fā)價(jià)值。為了更全面、有效的控制本中藥組合物的質(zhì)量控制水平，和國際接軌，讓臨床用藥安全及療效更加有所保證，需要對本中藥組合物采用更為先進(jìn)的質(zhì)量控制手段。

“桃核承氣湯”傳統(tǒng)用藥劑型為水煎劑，為了更好的發(fā)揮桃核承氣湯的臨床療效，醫(yī)藥工作者對該經(jīng)典方進(jìn)行了大量的研究，主要是對其臨床藥理作用作了大量工作，對其質(zhì)量研究報(bào)道較少；作為含五味中藥的復(fù)方制劑，所含藥味多，具有多組分、多靶標(biāo)等特點(diǎn)，目前大部分中藥復(fù)方制劑在含量控制上基本只有一個或兩個指標(biāo)性成分，質(zhì)量控制單一，指標(biāo)少，難以全面反映產(chǎn)品的質(zhì)量狀況。鑒于目前質(zhì)量控制方法在全面控制產(chǎn)品質(zhì)量上存在不足，同時(shí)桃核承氣湯中由于含有酚酸類、黃酮類等理化性質(zhì)差異較大成分，若針對每個指標(biāo)單獨(dú)建立方法測定，較繁瑣。目前在桃核承氣湯全面質(zhì)量控制方法的研究上未見報(bào)道，在桃核承氣湯組合物的質(zhì)量控制的研究上未見報(bào)道，因此目前本領(lǐng)域亟需一種桃核承氣湯組合物的質(zhì)量控制的方法或設(shè)備。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的中藥復(fù)方制劑在含量控制上基本只有一個或兩個指標(biāo)性成分，質(zhì)量控制單一，指標(biāo)少，難以全面反映藥味多，組分多、靶標(biāo)多的桃核承氣湯組合物的質(zhì)量狀況的缺陷，從而提供桃核承氣湯組合物的質(zhì)量控制方法。

為此，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

桃核承氣湯組合物的質(zhì)量控制方法，包括采用高效液相色譜法

建立桃核承氣湯組合物指紋圖譜，色譜條件為：

色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；

流速0.9ml/ml～1.1ml/ml，柱溫：25℃～35℃，

檢測儀器采用紫外檢測器，指紋圖譜的檢測波長210nm～250nm；

理論板數(shù)按兒茶素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000；

參照物溶液為兒茶素的50％甲醇溶液；

流動相為甲醇-0.1％磷酸溶液為系統(tǒng)按照如下洗脫順序進(jìn)行梯度洗脫：

所述指紋圖譜包括15個共有峰：各峰的相對保留時(shí)間分別為：1號峰相對保留時(shí)間RRT為9.839,2號峰相對保留時(shí)間RRT為17.973，3號(S)峰相對保留時(shí)間RRT為22.210，4號峰相對保留時(shí)間RRT為24.563，5號峰相對保留時(shí)間RRT為31.572，6號峰相對保留時(shí)間RRT為39.139，7號峰相對保留時(shí)間RRT為43.253，8號峰相對保留時(shí)間RRT為48.801，9號峰相對保留時(shí)間RRT為55.976，10號峰相對保留時(shí)間RRT為60.140，11號峰相對保留時(shí)間RRT為61.066，S峰相對保留時(shí)間RRT為64.647，13號峰相對保留時(shí)間RRT為67.075，14號峰相對保留時(shí)間RRT為70.368，15號峰相對保留時(shí)間RRT為71.504，其中，3號S峰是參照物的色譜峰。

桃核承氣湯組合物按如下兩種方法制備：

(1)按重量份計(jì)稱取如下飲片：燀桃仁12g，大黃12g，炙甘草6g，桂枝6g，芒硝6g；將除芒硝外的四味飲片置于4L砂鍋中，加1400ml水，浸泡30分鐘，加蓋，加煮沸，保持微沸至煎液490-510ml，濾除藥渣，加入芒硝，煮沸，即得第一桃核承氣湯組合物；或

(2)按重量份計(jì)稱取如下飲片：燀桃仁1000g，大黃1000g，桂枝500g，芒硝500g，炙甘草500g；將除芒硝外的四味飲片加8倍量的水，煎煮1.5h，得濾液；芒硝加入濾液中，減壓濃縮至相對密度1.05-1.15的清膏，加入麥芽糊精，干燥，混勻，加硬脂酸鎂，干壓制粒，制成1000g，即得第二桃核承氣湯組合物。

所述桃核承氣湯組合物參照物溶液和供試品溶液按如下方法制備：

(1)供試品溶液的制備：取第一桃核承氣湯組合物5ml，取溶液，離心，取上清液，即得；或取第二桃核承氣湯組合物1.3g，置50ml容量瓶中，加水稀釋，超聲溶解，放冷，再加水定容，搖勻，取溶液，離心，取上清液，即得；

(2)參照物溶液的制備：取兒茶素對照品，加50％甲醇配制成100μg/ml的參照物溶液；

進(jìn)樣量為10μl。

還包括用高效液相色譜法

測定桃核承氣湯組合物中游離蒽醌含量，色譜條件為：

色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；

流速0.9ml/ml～1.1ml/ml；柱溫：25℃～35℃；

檢測儀器采用紫外檢測器，指紋圖譜的檢測波長為254nm；

理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算，應(yīng)不低于3000；

對照品溶液為蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的甲醇溶液；

流動相為甲醇-0.1％磷酸溶液為流動相按如下洗脫順序進(jìn)行梯度洗脫：

梯度洗脫程序

測定游離蒽醌含量時(shí)，供試品溶液按如下方法制得：精密量取第一桃核承氣湯組合物5ml置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，取適量離心，取上清液，即

得；

或取第二桃核承氣湯組合物1.0g，精密稱定，置于100ml量瓶中，加50％甲醇超聲溶解并定容至刻度，取適量離心，取上清液，即得供試品溶液；

進(jìn)樣量為10μl～20μl。

還包括用高效液相法測定

總蒽醌的含量，色譜條件為：

色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；

流速0.9ml/ml～1.1ml/ml；柱溫：25℃～35℃；

檢測儀器采用紫外檢測器，指紋圖譜的檢測波長為254nm；

理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000；

對照品溶液為蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的甲醇溶液；

流動相為甲醇-乙腈-0.1％磷酸溶液為流動相按照如下洗脫順序進(jìn)行梯度洗脫：

測定總蒽醌含量時(shí)，供試品溶液按如下方法制得：取第一桃核承氣湯組合物30ml或稱定第二桃核承氣湯組合物1.0g，加入9ml的鹽酸或8％鹽酸溶液30ml，溶解，搖勻；加入三氯甲烷40ml，回流，取出，冷卻，萃取，除水，干燥，加入甲醇溶解，過濾，即得總蒽醌供試品溶液；

測定總蒽醌進(jìn)樣量為10μl。

還包括用高效液相法測定苦杏仁苷、肉桂酸、甘草酸的含量，色譜條件為：

色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；

流速0.9ml/ml～1.1ml/ml；柱溫：25℃～35℃；

檢測儀器采用紫外檢測器，指紋圖譜的檢測波長為210nm～278nm；

理論板數(shù)按苦杏仁苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000；

對照品溶液為苦杏仁苷、肉桂酸、甘草酸的甲醇溶液；

流動相為甲醇-乙腈-0.1％磷酸溶液為流動相按照如下洗脫順序進(jìn)行梯度洗脫：

供試品溶液按如下方法制得：精密量取第一桃核承氣湯組合物5ml置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，取適量離心，取上清液，即得；或取第二桃核承氣湯組合物1.0g，精密稱定，置于100ml量瓶中，加50％甲醇超聲溶解并定容至刻度，取適量離心，取上清液，即得供試品溶液；

測定苦杏仁苷的含量時(shí)的進(jìn)樣量為10μl。

本發(fā)明技術(shù)方案，具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明提供的桃核承氣湯組合物的質(zhì)量控制方法中的指紋圖譜可全面反映出桃核承氣湯質(zhì)量信息，從而能夠達(dá)到更加全面、有效地控制桃核承氣湯組合物制劑產(chǎn)品質(zhì)量的目的。

2、本發(fā)明提供的桃核承氣湯組合物的質(zhì)量控制方法采用國家藥典委員會提供的中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)對所測指紋圖譜進(jìn)行辨認(rèn)，操作方便、快捷；而且，以此得出的相以度結(jié)果對制劑指紋圖譜進(jìn)行評價(jià)，結(jié)論較為客觀、準(zhǔn)確。

3、本發(fā)明提供的桃核承氣湯組合物的質(zhì)量控制方法經(jīng)過對供試品制備方法的考察及測定指紋圖譜的儀器，色譜柱、流動相、檢測波長等條件進(jìn)行系統(tǒng)的優(yōu)選，建立了指紋圖譜測定條件并進(jìn)行了方法學(xué)考察，在對多批本組合物指紋圖譜檢測結(jié)果的基礎(chǔ)上，逐漸積累數(shù)據(jù)，提出了對照指紋圖譜，作為本品指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)，從而達(dá)到能夠更全面、有效地控制制劑質(zhì)量的目的。

4、本發(fā)明提供的桃核承氣湯組合物的質(zhì)量控制方法采用國家藥典委員會提供中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)計(jì)算本組合物相似度，經(jīng)多次試驗(yàn)研究，通過與計(jì)算相對保留時(shí)間及相對峰面積的方法相比較，所得出的評價(jià)結(jié)論基本一致，使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)評價(jià)指紋圖譜的相似度，操作方便、快捷，以其得出的相似度結(jié)果，對制劑指紋圖譜進(jìn)行評價(jià)，結(jié)論較為客觀、準(zhǔn)確。

5、本發(fā)明提供的桃核承氣湯組合物的質(zhì)量控制方法采用指紋圖譜較全面的表征組合物的質(zhì)量信息，從整體上反映產(chǎn)品質(zhì)量，同時(shí)針對處方五味藥材，采用多波長切換技術(shù)建立其中四味(除礦物藥芒硝無法采用高效液相色譜儀測定外，占100％)的含量控制指標(biāo)，針對君藥大黃分別建立功效不同的游離蒽醌和總蒽醌的含量控制方法，其中游離蒽醌供試品制備方法簡單、便捷，且測定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠；本發(fā)明考慮目前現(xiàn)有技術(shù)在控制復(fù)方中成藥上往往只有一個或兩個指標(biāo)性成分，且缺乏指紋圖譜整體表征產(chǎn)品質(zhì)量信息，因此提出以指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)成分含量控制的方式全面的控制桃核承氣湯組合物質(zhì)量。

6、本發(fā)明提供的桃核承氣湯組合物的質(zhì)量控制方法提出采用指紋圖譜，結(jié)合多波長切換技術(shù)測定桃核承氣湯組合物種多個指標(biāo)成分。

7、本發(fā)明提供的桃核承氣湯組合物的質(zhì)量控制方法可以為桃核承氣湯組合物提供一種較全面的質(zhì)量控制方法。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是大黃素對照品DAD圖；

圖2是大黃酚對照品DAD圖；

圖3是大黃酸對照品DAD圖；

圖4是蘆薈大黃素對照品DAD圖；

圖5是大黃素甲醚對照品DAD圖；

圖6蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚混合對照品色譜圖；

圖7游離蒽醌供試品溶液色譜圖

圖8總蒽醌供試品溶液色譜圖

圖9苦杏仁苷、肉桂酸、甘草酸混合對照品溶液色譜圖

圖10苦杏仁苷、肉桂酸、甘草酸供試品溶液色譜圖

圖11指紋圖譜測定中的兒茶素參照物溶液色譜圖

圖12指紋圖譜測定中的對照指紋圖譜

圖13連續(xù)四批樣品指紋圖譜對比色譜圖

其中，圖13中的S1為第一桃核承氣湯組合物對照圖譜；S2為第二桃核承氣湯組合物160501；S3為第二桃核承氣湯組合物160502；S4為第二桃核承氣湯組合物160503；S5為第二桃核承氣湯組合物160504。

具體實(shí)施方式

提供下述實(shí)施例是為了更好地進(jìn)一步理解本發(fā)明，并不局限于所述最佳實(shí)施方式，不對本發(fā)明的內(nèi)容和保護(hù)范圍構(gòu)成限制，任何人在本發(fā)明的啟示下或是將本發(fā)明與其他現(xiàn)有技術(shù)的特征進(jìn)行組合而得出的任何與本發(fā)明相同或相近似的產(chǎn)品，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)步驟或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的常規(guī)實(shí)驗(yàn)步驟的操作或條件即可進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)試劑產(chǎn)品。

本發(fā)明試藥及儀器：

試藥：

蘆薈大黃素對照品(批號：110795-201007，中國藥品生物制品檢定研究院)、大黃酸對照品(批號：110757-200206，中國藥品生物制品檢定研究院)、大黃素對照品(批號：110756-200110，中國藥品生物制品檢定研究院)、大黃酚對照品(批號：201118，中國藥品生物制品檢定研究院)、大黃素甲醚對照品(批號：110758-201013，中國藥品生物制品檢定研究院)；苦杏仁苷對照品(批號：110820-201004，中國藥品生物制品檢定研究院)、肉桂酸對照品(批號：200503，中國藥品生物制品檢定研究院)、甘草酸對照品(批號：110731-201116，中國藥品生物制品檢定研究院)；甲醇(Fisher Scientific，色譜純)、乙睛(Fisher Scientific，色譜純)、石英砂(分析純，粒度范圍10～40目)，桃核承氣湯組合物(試驗(yàn)室自制)。試劑為分析純，水為超純水。

儀器：

Waters e2695高效液相色譜儀(2998DAD檢測器)；Agilent 1260高效液相色譜儀(1290DAD檢測器)；DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀；搖床innova 4000。

實(shí)施例1：桃核承氣湯組合物的制備

第一桃核承氣湯組合物：按重量份計(jì)稱取如下飲片燀桃仁12g，大黃12g，炙甘草6g，桂枝6g，芒硝6g；四味飲片(除芒硝外)置于4L砂鍋中，加1400ml水，浸泡30分鐘，加蓋，以sogo加熱板為加熱裝置，煮沸(約25min)，保持微沸(約85分鐘，蒸發(fā)量約10g/min)至煎液約500ml，采用兩層醫(yī)用紗布濾除藥渣，加入芒硝，煮沸，即得。

第二桃核承氣湯組合物：按重量份計(jì)稱取如下飲片燀桃仁1000g，大黃1000g，桂枝500g，芒硝500g，炙甘草500g；四味飲片(除芒硝外)，加8倍量的水，煎煮1.5h，得濾液；芒硝加入濾液中，減壓濃縮至相對密度為1.05-1.15(優(yōu)選為1.10)清膏(60℃～70℃)，加入適量麥芽糊精，干燥，混勻，加適量硬脂酸鎂，干壓制粒，制成1000g，即得。第二桃核承氣湯組合物第二桃核承氣湯組合物采用聚酯鍍鋁/聚乙烯復(fù)合膜，包裝規(guī)格為4.0g/袋。

實(shí)施例2.HPLC法測定桃核承氣湯組合物中游離蒽醌含量

(1)色譜條件及系統(tǒng)適用性

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，0.1％磷酸為流動相B，梯度洗脫；檢測波長為254nm。理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，流速：1.0ml/min，柱溫：30℃。

梯度洗脫程序

(2)對照品溶液的制備

精密稱取蘆薈大黃素對照品、大黃酸對照品、大黃素對照品、大黃酚對照品、大黃素甲醚對照品適量，加甲醇分別制成每1ml含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各80μg，大黃素甲醚40μg的溶液；分別精密量取上述對照品溶液各2ml，混勻，即得(每1ml中含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各16μg，含大黃素甲醚8μg)。

(3)供試品溶液的制備

第一桃核承氣湯組合物供試品溶液制備：精密量取第一桃核承氣湯組合物5ml置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，取適量離心，取上清液，即得；

第二桃核承氣湯組合物供試品溶液制備：取第二桃核承氣湯組合物1.0g，精密稱定，置于100ml量瓶中，加50％甲醇超聲溶解并定容至刻度，取適量離心，取上清液，即得供試品溶液。

(4)檢測波長的選擇

取大黃素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚的在線DAD圖譜觀察(見下圖1-5)，五者的吸收曲線較一致，參照《中國藥典》2010年版第一部收載的大黃的含量測定所使用的檢測波長，將大黃素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚的檢測波長定為254nm。

(5)測定法精密吸取對照品溶液與供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，測定，即得。(見圖6-7)

(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取五個對照品，分別配制成蘆薈大黃素配制成濃度為64.719、32.360、16.180、8.090、0.809、0.404和0.202μg/ml的對照品溶液；大黃酸配制成濃度為188.559、94.280、47.14、23.570、2.357、1.178和0.589μg/ml的對照品溶液；大黃素配制成濃度為66.340、33.170、16.585、8.293、0.829、0.415和0.207μg/ml的對照品溶液；大黃酚配制成濃度為104.435、52.218、26.109、13.054、1.305、0.653和0.326μg/ml的對照品溶液；大黃素甲醚配制成濃度為39.042、19.521、9.760、4.880、0.488、0.244和0.122μg/ml的對照品溶液；分別進(jìn)樣10μl，測定，記錄色譜圖。以濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，以濃度對平均峰面積進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別進(jìn)樣10μl，測定，記錄色譜圖。以濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，以濃度對平均峰面積進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蘆薈大黃素的線性回歸方程為：A＝1.1833C+0.0954，r＝1.0000，在濃度為0.202～64.719μg·ml^-1的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，大黃酸的線性回歸方程為：A＝1.0031C+0.2059，r＝1.0000，在濃度為0.589～188.559μg·ml^-1的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，大黃素的線性回歸方程為：A＝0.8559C+0.0607，r＝1.0000，在濃度為0.207～66.340μg·ml^-1的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，大黃酚的線性回歸方程為：A＝1.2195C+0.1586，r＝1.0000，在濃度為0.326～104.435μg·ml^-1的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，大黃素甲醚的線性回歸方程為：A＝0.8734C+0.0341，r＝1.0000，在濃度為0.122～39.042μg·ml^-1的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。本品所用供試品溶液與對照品溶液的濃度均在此范圍內(nèi)。

(7)方法學(xué)考察及樣品測定

該測定方法經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，陰性樣品對測定結(jié)果無干擾，樣品在48h的穩(wěn)定性良好，游離蒽醌五個指標(biāo)RSD值依次分別為：0.2％，0.4％，0.3％，0.7％，0.9％；重復(fù)性測定結(jié)果五個指標(biāo)RSD值分別為0.5％，0.7％，0.6％，0.8％，1.5％；五個指標(biāo)平均加樣回收率分別為：蘆薈大黃素99.1％(n＝9)，RSD％為1.3％；大黃酸99.3％(n＝9)，RSD％為1.3％；大黃素100.3％(n＝9)，RSD％為1.0％；大黃酚99.9％(n＝9)，RSD％為1.3％，大黃素甲醚100.3％(n＝9)，RSD％為2.6％。表明方法準(zhǔn)確度高，重復(fù)性良好。用本方法測定10批次第一桃核承氣湯組合物與連續(xù)四批次第二桃核承氣湯組合物的游離蒽醌含量，結(jié)果如下：

表1 10批第一桃核承氣湯組合物與連續(xù)四批次第二桃核承氣湯組合物游離蒽醌含量結(jié)果

(8)第一桃核承氣湯組合物要求每份煎煮液、第二桃核承氣湯組合物要求每4g含量，兩者游離蒽醌均不得少于1.4mg。

實(shí)施例3.HPLC法測定桃核承氣湯組合物中總蒽醌含量

(1)色譜條件及系統(tǒng)適用性

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇為流動相A，0.1％磷酸為流動相B，梯度洗脫；檢測波長為254nm。理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，流速：0.8ml/min，柱溫：30℃。

梯度洗脫程序

(2)對照品溶液的制備

精密稱取蘆薈大黃素對照品、大黃酸對照品、大黃素對照品、大黃酚對照品、大黃素甲醚對照品適量，加甲醇分別制成每1ml含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各80μg，大黃素甲醚40μg的溶液；分別精密量取上述對照品溶液各2ml，混勻，即得(每1ml中含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各16μg，含大黃素甲醚8μg)。

(3)供試品溶液的制備

第一桃核承氣湯組合物供試品溶液制備：取第一桃核承氣湯組合物30ml置于250ml平底燒瓶中，加入9ml的鹽酸或8％鹽酸溶液30ml，超聲溶解，搖勻；加入三氯甲烷40ml，95℃回流1h(注意回流時(shí)加入少量石英砂)，取出，冷卻，用三氯甲烷機(jī)械振搖萃取三次，每次30ml，合并三氯甲烷，無水硫酸鈉除水，水浴揮干，精密加入25ml甲醇，溶解；取適量過0.45μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得總蒽醌供試品溶液。

第二桃核承氣湯組合物供試品溶液制備：取第二桃核承氣湯組合物1.0g，精密稱定，加入8％鹽酸溶液30ml，超聲溶解，搖勻；加入三氯甲烷40ml，95℃回流1h(注意回流時(shí)加入少量石英砂)，取出，冷卻，用三氯甲烷機(jī)械振搖萃取三次，每次30ml，合并三氯甲烷，無水硫酸鈉除水，水浴揮干，精密加入25ml甲醇，溶解；取適量過0.45μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得總蒽醌供試品溶液。

(4)測定法精密吸取對照品溶液與供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。(見圖8)

(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密移取對照品儲備液，稀釋，蘆薈大黃素配制成濃度為81.438、40.719、20.360、10.180、1.018、0.509、0.254和0.127μg/ml的對照品溶液；大黃酸配制成濃度為236.176、118.088、59.044、29.522、2.952、1.476、0.738和0.369μg/ml的對照品溶液；大黃素配制成濃度為86.320、43.160、21.580、10.790、1.079、0.540、0.270和0.135μg/ml的對照品溶液；大黃酚配制成濃度為133.270、66.635、33.318、16.659、1.666、0.833、0.416和0.208μg/ml的對照品溶液；大黃素甲醚配制成濃度為51.297、25.649、12.824、6.412、0.641、0.321、0.160和0.080μg/ml的對照品溶液。分別進(jìn)樣10μl，測定，記錄色譜圖。以濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，以濃度對平均峰面積進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蘆薈大黃素的線性回歸方程為：A＝1.1834C+0.0952，r＝1.0000，在濃度為0.127～81.438μg·ml^-1的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，大黃酸的線性回歸方程為：A＝1.0028C+0.1861，r＝1.0000，在濃度為0.369～236.176μg·ml^-1的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，大黃素的線性回歸方程為：A＝0.8558C+0.0689，r＝1.0000，在濃度為0.135～86.320μg·ml^-1的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，大黃酚的線性回歸方程為：A＝1.2195C+0.1801，r＝1.0000，在濃度為0.208～133.270μg·ml^-1的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，大黃素甲醚的線性回歸方程為：A＝0.8734C+0.0360，r＝1.0000，在濃度為0.080～51.297μg·ml^-1的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，本品總蒽醌所用對照品、樣品的進(jìn)樣濃度均在此范圍內(nèi)。

(6)方法學(xué)考察及樣品測定

該測定方法經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，陰性樣品對測定結(jié)果無干擾，樣品在40h的穩(wěn)定性良好，總蒽醌五個指標(biāo)RSD值依次分別為：0.4％，0.4％，0.3％，0.3％，0.6％；重復(fù)性測定結(jié)果五個指標(biāo)RSD值分別為1.0％，1.3％，1.1％，1.8％，1.5％；五個指標(biāo)平均加樣回收率分別為：蘆薈大黃素99.4％(n＝9)，RSD％為2.4％；大黃酸99.5％(n＝9)，RSD％為2.8％；大黃素99.4％(n＝9)，RSD％為2.5％；大黃酚98.2％(n＝9)，RSD％為2.4％，大黃素甲醚98.0％(n＝9)，RSD％為3.1％。該方法準(zhǔn)確度高，重復(fù)性良好。用本方法測定10批次第一桃核承氣湯組合物與連續(xù)四批次第二桃核承氣湯組合物的總蒽醌含量，結(jié)果如下：

表210批第一桃核承氣湯組合物與連續(xù)四批次第二桃核承氣湯組合物總蒽醌含量結(jié)果

(7)第一桃核承氣湯組合物要求每份煎煮液、第二桃核承氣湯組合物要求每4g含量，兩者總蒽醌均不得少于6.7mg。

實(shí)施例4.HPLC法測定桃核承氣湯組合物中苦杏仁苷、肉桂酸、甘草酸含量

(1)色譜條件及系統(tǒng)適用性

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇為流動相A，乙腈為流動相B，0.1％磷酸為流動相C，按下表進(jìn)行梯度洗脫，流速：1.0ml/min，柱溫：30℃，理論板數(shù)按苦杏仁苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

梯度洗脫程序

檢測波長表

(2)對照品溶液的制備

取肉桂酸、苦杏仁苷、甘草酸銨適量，用50％甲醇制備成每ml含苦杏仁苷120μg，肉桂酸10μg，甘草酸銨80μg的混合對照品溶液。

(3)供試品溶液的制備

第一桃核承氣湯組合物供試品溶液制備：精密量取第一桃核承氣湯組合物5ml置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，取適量12000r/min離心10min，取上清液，即得供試品溶液。

第二桃核承氣湯組合物供試品溶液制備：取第二桃核承氣湯組合物1.0g，精密稱定，置于100ml量瓶中，50％甲醇超聲溶解并定容至刻度，取適量12000r/min離心10min，取上清液，即得供試品溶液。

(4)測定法

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。(見圖9-10)

(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

按照對照品溶液制備方法，取苦杏仁苷對照品，配制成濃度為6.400、12.800、25.601、51.202、102.404、204.808、409.615和819.230μg/ml的對照品溶液；肉桂酸配制成濃度為1.156、2.311、4.623、9.245、18.490、36.980、73.960和147.920μg/ml的對照品溶液；甘草酸配制成濃度為1.855、3.710、7.420、14.840、29.680、59.361、118.721和237.443μg/ml的對照品溶液。分別進(jìn)樣10μl，測定，記錄色譜圖。以濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，以濃度對平均峰面積進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？嘈尤受站€性回歸方程為：A＝0.1108C+0.1385，r＝1.0000，線性關(guān)系良好；肉桂酸線性回歸方程為：A＝0.9656C+0.0812，r＝1.0000，線性關(guān)系良好；甘草酸線性回歸方程為：A＝0.1032C+0.0224，r＝1.0000，線性關(guān)系良好。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，苦杏仁苷濃度的線性范圍為6.400～819.230μg·ml^-1，肉桂酸濃度的線性范圍為1.156～147.920μg·ml^-1，甘草酸濃度的線性范圍為1.855～237.443μg·ml^-1，本品對照品與供試品溶液濃度均在此范圍內(nèi)。

(6)方法學(xué)考察及樣品測定

該測定方法經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，陰性樣品對測定結(jié)果無干擾，樣品在40h的穩(wěn)定性良好，三個指標(biāo)RSD值依次分別為：0.2％，0.5％，0.3％；重復(fù)性測定結(jié)果五個指標(biāo)RSD值分別為0.9％，0.6％，1.0％；三個指標(biāo)平均加樣回收率分別為：苦杏仁苷96.8％(n＝9)，RSD％為1.3％；肉桂酸97.7％(n＝9)，RSD％為1.1％；甘草酸100.1％(n＝9)，RSD％為0.9％。該方法準(zhǔn)確度高，重復(fù)性良好。用本方法測定10批次第一桃核承氣湯組合物與連續(xù)四批次第二桃核承氣湯組合物的三個指標(biāo)的含量，結(jié)果如下：

表3 10批第一桃核承氣湯組合物與連續(xù)四批次第二桃核承氣湯組合物三個指標(biāo)含量結(jié)果

(7)第一桃核承氣湯組合物要求每份煎煮液、第二桃核承氣湯組合物要求每4g含量，兩者苦杏仁苷均不得少于34.7mg，肉桂酸均不得少于1.5mg，甘草酸均不得少于7.7mg。

實(shí)施例5.HPLC法建立桃核承氣湯組合物的指紋圖譜的檢測方法

(1)色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇為流動相A，以0.1％磷酸溶液為流動相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速1.0ml/ml，柱溫：30℃，檢測波長230nm。理論板數(shù)按兒茶素峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

指紋圖譜流動相梯度程序

(2)參照物溶液的制備

取兒茶素對照品適量，加50％甲醇配制成100μg/ml的參照物溶液，即得。(見圖11)

(3)供試品溶液的制備

取第一桃核承氣湯組合物5ml，12000r/min離心10min，取上清液，即得；或取第二桃核承氣湯組合物1.3g，置50ml容量瓶中，加水稀釋，超聲溶解，放冷，再加水定容，搖勻，取溶液，12000r/min離心10min，取上清液，即得

(4)測定法分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

(5)桃核承氣湯組合物對照指紋圖譜的確定及相似度分析

采用同一批次飲片，制備第一桃核承氣湯組合物10份，分別第一桃核承氣湯組合物供試品溶液，按指紋圖譜測定法測定，記錄圖譜。通過分析，確定其共有特征峰為15個(見附圖12)，所述的15個共有特征峰的相對保留時(shí)間偏差RSD均小于2％，即：

1號峰相對保留時(shí)間RRT為9.839，RSD％為1.39％；

2號峰相對保留時(shí)間RRT為17.973，RSD％為0.07％；

3號(S)峰相對保留時(shí)間RRT為22.210，RSD％為0.04％；

4號峰相對保留時(shí)間RRT為24.563，RSD％為0.05％；

5號峰相對保留時(shí)間RRT為31.572，RSD％為0.04％；

6號峰相對保留時(shí)間RRT為39.139，RSD％為0.03％；

7號峰相對保留時(shí)間RRT為43.253，RSD％為0.02％；

8號峰相對保留時(shí)間RRT為48.801，RSD％為0.02％；

9號峰相對保留時(shí)間RRT為55.976，RSD％為0.02％；

10號峰相對保留時(shí)間RRT為60.140，RSD％為0.01％；

11號峰相對保留時(shí)間RRT為61.066，RSD％為0.01％；

12(S)峰相對保留時(shí)間RRT為64.647，RSD％為0.01％；

13號峰相對保留時(shí)間RRT為67.075，RSD％為0.01％；

14號峰相對保留時(shí)間RRT為70.368，RSD％為0.01％；

15號峰相對保留時(shí)間RRT為71.504。其中，3號S峰是參照物的色譜峰。

運(yùn)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件(2012年版)處理圖譜，以160512-1作為參照圖譜，得到第一桃核承氣湯組合物對照指紋圖譜。采用夾角余弦法計(jì)算樣品相似度，結(jié)果表明，煎煮的10份第一桃核承氣湯組合物相似度在0.934～1.000之間，相似度較高。

表4 10份第一桃核承氣湯組合物相似度評價(jià)結(jié)果

取第一桃核承氣湯組合物所對應(yīng)的飲片，制備連續(xù)三批次第二桃核承氣湯組合物樣品，按指紋圖譜測定方法測定，記錄色譜圖(見附圖13)，以第一桃核承氣湯組合物生成的對照指紋圖譜作為隨行對照圖譜，計(jì)算4批次第二桃核承氣湯組合物的相似度。結(jié)果見下表。

第二桃核承氣湯組合物相似度計(jì)算結(jié)果

(6)按中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)計(jì)算，以mark峰計(jì)，供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度不得低于0.90。

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實(shí)施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。