本發(fā)明屬于中藥分析領域，具體涉及達原飲組合物的指紋圖譜。

背景技術：

達原飲組合物由檳榔、厚樸、草果仁、知母、芍藥、黃芩、甘草七味中藥組成的中藥制劑，主治瘟疫或瘧疾，邪伏膜原證，現(xiàn)代臨床常用瘧疾、流行性感冒、病毒性腦炎，病毒性肝炎等屬溫熱疫毒伏于膜原，濕熱雍盛者等。為了更全面、有效的控制本中藥組合物的質量控制水平，和國際接軌，讓臨床用藥安全及療效更加有所保證，需要對本中藥組合物采用更為先進的質量控制手段。

由于中藥及其復方制劑均為多組分復雜體系，因此評價其質量應采用與之相適應的，能提供豐富鑒別信息的檢測方法，但現(xiàn)行的顯微鑒別、理化鑒別和含量測定等方法都不足以解決這一問題。中藥指紋圖譜是指某些中藥材或中藥剖劑經適當處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標示其化學特征的色譜圖或光譜圖。中藥指紋圖譜是一種綜合的，可量化的鑒定手段，能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學，成分的種類與數(shù)量進而對藥品質量進行整體描述和評價。所以，中藥指紋圖譜已經成為目前國際上較為先進的中藥質量控制手段。本中藥組合物還沒有作為質量控制標準的指紋圖譜公開報道。

美國食品藥品管理局(FDA)植物藥產品工業(yè)指南、WHO草藥評價指南中均指出，如果草藥制劑的活性成分不能鑒別，可以通過指紋圖譜(fingerprint spectrum)證明產品質量的一致。歐共體在草藥質量指南注釋中也指出，草藥及其制劑是以整體作為有效物質，因此，草藥的質量穩(wěn)定性僅靠測定己知的有效成分是不夠的，應該通過指紋圖譜顯示其所含的各種成分。印度草藥典、英國草藥典、德國藥用植物協(xié)會、加拿大藥用及芳香植物協(xié)會等，也接受用指紋圖譜來保證有效成分未明的草藥產品質量的一致性。目前國家藥品監(jiān)督管理局對中藥注射劑己要求具有相關的指紋圖譜，對提高中藥注射劑的質量起到了關鍵作用，但對其他劑型的中藥尚沒有強制性要求。

中藥指紋圖譜包括中藥化學指紋圖譜、蛋白指紋圖譜、DNA指紋圖譜及生物效應指紋圖譜等。通常說的指紋圖譜是指化學指紋圖譜，是中藥材、中藥提取物或中成藥經適當處理后，采用一定分析手段，得到的能夠標示該中藥主要化學成分特性的色譜或光譜。

中藥化學指紋圖譜可以分為中藥光譜指紋圖譜，如紅外光譜(IR)、紫外光譜(UV)、X射線衍射圖譜等；色譜指紋圖譜，如薄層色譜(TLC)、氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、毛細管電泳圖譜(CE)等；波譜指紋圖譜，如質譜(MS)、核磁共振波譜(NMR)等；DNA指紋圖圖譜；以及采用多種現(xiàn)代分析儀器聯(lián)用得到的多維多息特征譜(characteristic fingerprint of muhrdimension andmuhrdata)，如HPLC/MS、HPLC/Ms/MS、GC/MS、CE/MS等。

中藥指紋圖譜研究方法雖然較多，但色譜學方法應是主流方法，尤其是TLC，HPLC和GC色譜技術，已經成為大家所公認的三種常規(guī)的分析手段，是目前研究中藥指紋圖譜應優(yōu)先考慮的方法。

中藥指紋圖譜有兩個作用：一是通過指紋圖譜的特征性，能有效鑒別中藥材的真?zhèn)位虍a地：二是通過指紋圖譜主要特征峰的面積或比例的制定，能有效控制產品的質量，確保產品質量的相對一致。

中藥指紋圖譜的制作和應用常包括：(1)采集具有代表性的中藥樣品，采取適當?shù)姆椒ㄖ苽涔┰嚻啡芤海⑦x用適當?shù)臉藴蕵藴势?參照物)，進行分析方法的優(yōu)選；(2)根據(jù)確定的分析方法，對一定批次的中藥樣品進干了分離分析，將所得的多批次數(shù)據(jù)進行處理，得到標準指紋圖譜；(3)將樣品按照與標準指紋圖譜制作相同的方法進行樣品處理、分離分析后，將所得的指紋圖譜與標準指紋圖譜進行相似度比較，一般相以度達到80％以上即可視為該樣品為合格。相似度的計算和評價方法通常采用相關系數(shù)與相合系數(shù)或夾角余弦法。我國中南大學、浙江大學等單位提據(jù)以上方法，編制了相應的計算機軟件用于完成相假度評價，其中以國家藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”應用較多。因此采用指紋圖譜技術全面反映教材的整體特征，并進一步與其活性相關聯(lián)，對于完善目前的質量控制方法，保證臨床用藥的安全有效是十分必要的。目前，關于達原飲組合物的指紋圖譜的研究尚未有文獻報道更沒有建立達原飲組合物的指紋圖譜，從質量控制方面，有關達原飲組合物的標準指紋圖譜亦沒有報道。

技術實現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明要解決的技術問題在于克服現(xiàn)有技術中的沒有關于達原飲組合物的指紋圖譜以及建立達原飲組合物的指紋圖譜的文獻報道的缺陷，從而提供一種達原飲組合物指紋圖譜的建立方法及指紋圖譜。

為此，本發(fā)明提供如下技術方案：

達原飲組合物指紋圖譜的建立方法包括采用高效液相色譜法建立指紋圖譜，色譜條件為：

色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；

流速0.8ml/ml；柱溫：25℃～35℃；

檢測儀器采用紫外-可見分光檢測器，指紋圖譜的檢測波長為215nm～240nm；

理論板數(shù)按參照物黃芩苷峰計算，應不低于3000；

參照物溶液為黃芩苷的甲醇溶液；

流動相以乙腈-0.1％磷酸溶液為系統(tǒng)按照如下洗脫順序進行梯度洗脫：

所述指紋圖譜包括20個共有峰：各峰的相對保留時間分別為：1號峰相對保留時間RRT為11.554,2號峰相對保留時間RRT為20.589,3號峰相對保留時間RRT為24.434，4號峰相對保留時間RRT為26.558，5號峰相對保留時間RRT為29.776，6號峰相對保留時間RRT為31.082，7號峰相對保留時間RRT為34.114，8號峰相對保留時間RRT為37.788，9號峰相對保留時間RRT為38.742，10號峰相對保留時間RRT為39.778，11號峰相對保留時間RRT為40.583，S峰相對保留時間RRT為50.099，13號峰相對保留時間RRT為53.925，14號峰相對保留時間RRT為54.927，15號峰相對保留時間RRT為57.315，16號峰相對保留時間RRT為61.652，17號峰相對保留時間RRT為68.702，18號峰相對保留時間RRT為72.735，19號峰相對保留時間RRT為84.317，20號峰相對保留時間RRT為86.291，其中，12號S峰是參照物的色譜峰。

用于高效液相色譜測定的供試品溶液采用水作為溶劑，參照物溶液采用甲醇作溶劑。

參照物溶液的制備過程為：取黃芩苷對照品，加甲醇配制成80μg/ml的參照物溶液，即得。

所述達原飲組合物按如下兩種方法制備：

(1)按重量份計稱取如下飲片：檳榔6g，厚樸3g，草果仁1.5g，知母3g，白芍3g，黃芩3g，甘草1g，置于2L煎藥砂鍋中，加400ml水，浸泡30分鐘，加蓋，武火加熱煮沸，文火保持微沸至藥材藥液為150-170ml，濾除藥渣，放冷，即得第一達原飲組合物；

(2)按重量份計稱取如下飲片：檳榔1200g，厚樸600g，草果仁300g，知母600g，白芍600g，黃芩600g，甘草300g；加8倍量的水，煎煮1.0h；濾過，得濾液；減壓濃縮至相對密度1.10-1.30的稠膏，加入麥芽糊精，干燥；混勻，加硬脂酸鎂，干壓顆粒，制成1000g，即得第二達原飲組合物。

測定達原飲組合物指紋圖譜時的供試品溶液與和參照物溶液按如下方法制得：

(1)供試品溶液的制備：取第一達原飲組合物5ml，離心，取上清液，即得；

或取第二達原飲組合物1.7g，精密稱定，置50ml容量瓶中，加水稀釋，超聲溶解，放冷，再加水定容，搖勻，取溶液適量，離心，取上清液，即得。

(2)參照物溶液的制備：

取黃芩苷對照品，加甲醇配制成80μg/ml的參照物溶液，即得。

進樣量為10μl。

檢測波長表如下：

采用高效液相色譜法，色譜條件為：

色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；

流速0.8ml/ml；柱溫：25℃～35℃；

檢測儀器采用紫外-可見分光檢測器，指紋圖譜的檢測波長為215nm～240nm；

理論板數(shù)按參照物黃芩苷峰計算，應不低于3000；

參照物溶液為黃芩苷的甲醇溶液；

流動相以乙腈-0.1％磷酸溶液為系統(tǒng)采用如下洗脫順序進行梯度洗脫：

包括20個共有峰，各峰的相對保留時間分別為：1號峰相對保留時間RRT為11.554，2號峰相對保留時間RRT為20.589，3號峰相對保留時間RRT為24.434，4號峰相對保留時間RRT為26.558，5號峰相對保留時間RRT為29.776，6號峰相對保留時間RRT為31.082，7號峰相對保留時間RRT為34.114，8號峰相對保留時間RRT為37.788，9號峰相對保留時間RRT為38.742，10號峰相對保留時間RRT為39.778，11號峰相對保留時間RRT為40.583，S峰相對保留時間RRT為50.099，13號峰相對保留時間RRT為53.925，14號峰相對保留時間RRT為54.927，15號峰相對保留時間RRT為57.315，16號峰相對保留時間RRT為61.652，17號峰相對保留時間RRT為68.702，18號峰相對保留時間RRT為72.735，19號峰相對保留時間RRT為84.317，20號峰相對保留時間RRT為86.291；其中，12號S峰是參照物的色譜峰。

本發(fā)明技術方案，具有如下優(yōu)點：

1、本發(fā)明提供的達原飲組合物指紋圖譜，全面反映出達原飲組合物的質量信息，從而能夠達到更加全面、有效地控制達原飲組合物制劑產品質量的目的。

2、本發(fā)明提供的達原飲組合物指紋圖譜，采用國家藥典委員會提供的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)對所測指紋圖譜的辨認所得；而且結論較為客觀、準確。

3、提供的達原飲組合物指紋圖譜的建立方法參照中藥注射劑指紋圖譜的要求，對本發(fā)明涉及的指紋圖譜進行了研究，經過對供試品制備方法的考察及測定指紋圖譜的儀器，色譜柱、流動相、檢測波長等條件進行系統(tǒng)的優(yōu)選，建立了指紋圖譜測定條件并進行了方法學考察，在對多批本中藥組合物指紋圖譜檢測結果的基礎上，逐漸積累數(shù)據(jù)，提出了標準指紋圖譜，作為本品指紋圖譜標準，從而達到能夠更全面、有效地控制制劑質量的目的。

4、本發(fā)明提供的達原飲組合物指紋圖譜的建立方法采用國家藥典委員會提供中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)作為本中藥組合物指紋圖譜相似度計算軟件對指紋圖譜的辨認，經多次試驗研究，通過與計算相對保留時間及相對峰面積的方法相比較，所得出的評價結論基本一致，使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)評價指紋圖譜的相似度，操作方便、快捷，以其得出的相似度結果，對制劑指紋圖譜進行評價，結論較為客觀、準確。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為多波長檢測結果圖；

圖2為200～400nm掃描光譜3D圖；

圖3為210、215、220nm檢測波長的考察色譜對比圖；

圖4為流動相1供試品溶液色譜對比圖；

圖5為流動相2供試品溶液色譜對比圖；

圖6-1為流動相3供試品溶液色譜圖(完整圖)；

圖6-2為流動相3供試品溶液色譜圖(縮放圖)；

圖7為流動相4混合對照品與供試品溶液色譜對比圖；

圖8為指紋圖譜混合對照品溶液3D掃描圖；

圖9為指紋圖譜供試品溶液3D掃描圖；

圖10為流動相5混合對照品與供試品溶液色譜對比圖；

圖11為流動相6色譜圖；

圖12為不同濃度溶劑(甲醇)色譜對比圖；

圖13為不同濃度溶劑(乙醇、乙腈、甲醇)色譜對比圖；

圖14為指紋圖譜黃芩苷對照品溶液(參照物)色譜圖；

圖15為第一達原飲組合物對照指紋圖譜；

圖16為第二達原飲組合物連續(xù)三批次達原飲組合物②指紋對比圖；

圖17為空白溶劑色譜圖。

具體實施方式

提供下述實施例是為了更好地進一步理解本發(fā)明，并不局限于所述最佳實施方式，不對本發(fā)明的內容和保護范圍構成限制，任何人在本發(fā)明的啟示下或是將本發(fā)明與其他現(xiàn)有技術的特征進行組合而得出的任何與本發(fā)明相同或相近似的產品，均落在本發(fā)明的保護范圍之內。

實施例中未注明具體實驗步驟或條件者，按照本領域內的文獻所描述的常規(guī)實驗步驟的操作或條件即可進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)試劑產品。

本發(fā)明試藥及儀器：

試藥：

氫溴酸檳榔堿(批號：111684-200401，中國藥品生物制品檢定研究院)，

厚樸酚(批號：1100729-201513，中國藥品生物制品檢定研究院)，

和厚樸酚(批號：110730-200402，中國藥品生物制品檢定研究院)，

黃芩苷(批號：110715-201318，中國藥品生物制品檢定研究院)，

芍藥苷(批號：110736-201136，中國藥品生物制品檢定研究院)，

芒果苷(批號：110607-200402，中國藥品生物制品檢定研究院)，

甘草酸銨(批號：110731-201116，中國藥品生物制品檢定研究院)，

甲醇(色譜純，Thermo Fisher)

甲醇(色譜純，天津市康科德科技有限公司)

乙睛(色譜純，Thermo Fisher)

其余試劑為分析純，水為超純水。

儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀(DAD檢測器)

Waters E2695高效液相色譜儀(2998DAD檢測器)

實施例1.配制對照品溶液

氫溴酸檳榔堿對照品溶液：取氫溴酸檳榔堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得(檳榔堿重量＝氫溴酸檳榔堿重量/1.5214)；

芒果苷對照品溶液：取芒果苷對照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每1ml含50μg的溶液，即得。

芍藥苷對照品溶液：取芍藥苷適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得。

厚樸酚、和厚樸酚對照品溶液：取厚樸酚對照品、和厚樸酚對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1ml含厚樸酚40μg、和厚樸酚24μg的溶液，即得。

黃芩苷對照品溶液：取在黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得。

甘草苷、甘草酸銨對照品溶液：取甘草苷對照品、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加70％乙醇分別制成每1ml含甘草苷20μg、甘草酸銨0.2mg的溶液，即得(甘草酸重量＝甘草酸銨重量/1.0207)。

混合對照品溶液：分別取上述對照品溶液1ml，混勻，即得。

實施例2.達原飲組合物的制備

第一達原飲組合物：按重量份計稱取如下飲片檳榔6g，厚樸3g，草果仁1.5g，知母3g，白芍3g，黃芩3g，甘草1g，置于2L煎藥砂鍋中，加400ml水，浸泡30分鐘，加蓋，砂鍋置于電加熱板上，武火(電壓值220V)加熱煮沸(約13分鐘)，文火(電壓值約170V)保持微沸至藥材藥液約160ml(約40分鐘)，采用兩層醫(yī)用紗布濾除藥渣，放冷，即得。

第二達原飲組合物：按重量份計稱取如下飲片檳榔1200g，厚樸600g，草果仁300g，知母600g，白芍600g，黃芩600g，甘草300g；加8倍量的水，煎煮1.0h；濾過，得濾液；減壓濃縮至相對密度為1.10-1.30優(yōu)選1.20(60℃～70℃)的稠膏，加入適量麥芽糊精，干燥；混勻，加適量硬脂酸鎂，干壓顆粒，制成1000g，即得。第二達原飲組合物采用聚酯鍍鋁/聚乙烯復合膜，包裝規(guī)格為5.0g/袋。

實施例3.指紋圖譜色譜條件的確定

(1)檢測波長的選擇

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑：以甲醇為流動相A，0.05mol/L磷酸(pH約3.5)為流動相B，按照下表進行梯度洗脫，進樣量10μl，流速：1.0ml/min，柱溫：30℃。梯度程序如下：

梯度洗脫程序1

根據(jù)藥典藥材含量指標檢測波長主要有λ＝215(氫溴酸檳榔堿)、λ＝237(甘草苷)，λ＝280(黃芩苷)，λ＝294(厚樸酚、和厚樸酚)，λ＝258(芒果苷)、λ＝230(芍藥苷)，因此對同一份樣品，采用多波長檢測手段對五個波長進行考察，以色譜峰數(shù)、分離度等評價，所得結果見圖1-2。

由3D光譜掃描圖可知，達原飲組合物中所含大部分物質處于末端吸收，其在290nm附近有強吸收，分析應為厚樸酚類木質素物質，結合圖1所考察的波長可知，在盡可能的選擇紫外末端波長能較全面的反應組合物的指紋信息。因此對210～220之間進行不同檢測波長的再次考察，結果見圖3。

從色譜圖可以看出，三者色譜峰基本一致，考慮到210nm過于靠近紫外末端，在甲醇或乙腈—水系統(tǒng)下會存在一定溶劑干擾，綜合考慮選擇λ＝215作為指紋圖譜研究的波長。

(2)流動相選擇及梯度條件的確定

由于達原飲組合物采用水提取，浸出成分往往極性較大，且成分多為生物堿類、苷類、酚類等，極性亦較大。結合HPLC采用的常用流動相組成，分別采用甲醇—水、乙腈—水系統(tǒng)進行考察。

流動相1：甲醇—水系統(tǒng)，甲醇-乙腈(50：50)—水系統(tǒng)，乙腈—水系統(tǒng)；色譜柱：Diamonsil C18 200mm*4.6mm，5μm三種不同有機相色譜對比圖表明：甲醇或甲醇：乙腈在色譜圖末端均存在一定基線不平，且色譜峰分離沒有乙腈系統(tǒng)好，因此選擇乙腈—水系統(tǒng)進行進一步優(yōu)化。結果見圖4.

流動相2：(A)乙腈—0.01mol/L磷酸氫二鉀溶液(磷酸調節(jié)pH值為6.8)，(B)乙腈—0.1％磷酸溶液；色譜柱：Diamonsil C18 200mm*4.6mm，5μm。結果表明：水相為磷酸緩沖鹽時與0.1％磷酸溶液色譜圖基本一致，考慮到磷酸溶液配置更便捷，因此選定水相為0.1％磷酸系統(tǒng)。結果見圖5.

流動相3：在選定的流動相組成(乙腈—0.1％磷酸溶液)基礎上，對流動相梯度系統(tǒng)進行不斷的調整和優(yōu)化，色譜柱：Diamonsil C18 200mm*4.6mm，5μm。初步確定以下色譜梯度系統(tǒng)作為指紋圖譜檢測流動相之一。結果見圖6-1、6-2.

梯度洗脫程序2

流動相4:在流動相3系統(tǒng)的基礎上，通過色譜峰的歸屬發(fā)現(xiàn)，在芒果苷，芍藥苷，甘草苷的色譜峰位上分離度均較差(見圖8)，在兼顧分離效果、梯度洗脫時間情況下，進一步重點對流動相梯度洗脫程序進行優(yōu)化，同時考慮到200mm的色譜柱在分離效能上存在一定不足，因此選擇用碳載量較高的250mm的色譜柱用于其分離，色譜柱：waters symmetry C18 250mm*4.6mm，5μm。其流速調整為0.8ml/min。梯度程序見下表，圖7。

梯度洗脫程序3

由圖9-2可知：供試品色譜圖大部分色譜峰分離良好，色譜圖中對照品對應色譜峰均得到較好分離，其中芒果苷、芍藥苷、甘草苷三個色譜峰均較流動相5有較大的改善，但由于黃芩苷在此波長下吸收強度較大，導致色譜圖大部分峰被壓低；根據(jù)指紋圖譜的完整性原則以及相似度的計算方法，若色譜圖中某一個峰峰面積過大，會對相似度計算值貢獻較大，導致其余色譜峰峰面積發(fā)生變化時難以被較準確通過相似度反應，因此應該對色譜圖中黃芩苷色譜峰以切換波長的方式使其峰面積保持一定的大小。另外試驗中發(fā)現(xiàn)某些樣品黃芩苷色譜峰存在裂峰的情況，分析與達原飲組合物中黃芩苷濃度過高造成溶劑效應有關。

流動相5：在流動性4的基礎上，結合對照品與供試品DAD光譜掃描圖(見圖8、9)，黃芩苷吸收強度較低的吸收波長在230nm～250nm，315nm左右，為兼顧切換波長后其余色譜峰的檢測，選擇240nm；色譜柱：waters symmetry C18 250mm*4.6mm，5μm，同時結合其保留時間下確定以下波長切換的方法，結果見圖10。

檢測波長表

由圖10可知，通過切換波長的方式使得色譜圖整體形態(tài)較好，在芒果苷、甘草苷的位置上，色譜峰分離較好，芍藥苷略有拖尾；供試品溶液黃芩苷色譜峰峰面積適中。

流動相6：流動相5所確定的指紋圖譜檢測條件雖能較好的使的峰分離，但因120min檢測時間較長，且10min～20min，55min～65min，105min～120min的運行時間下基本檢測不到色譜峰，為提高指紋圖譜檢測效率，減少有機溶劑使用量，在不影響色譜峰分離的情況下，進一步重點對檢測梯度程序進行了壓縮，以減少檢測時間，色譜柱：waters symmetry C18 250mm*4.6mm，5μm，所得結果見圖11。結果表明該色譜條件各色譜峰分離好，保留時間緊湊，檢測時間適宜。因此確定達原飲組合物指紋圖譜的色譜條件如下：

檢測波長：215nm，流速：0.8ml/min，柱溫：30℃，進樣量:5～10μl。

梯度洗脫程序4

檢測波長表

實施例4.達原飲組合物供試品溶劑的選擇

溶劑、溫度是影響物質溶解度的重要因素，相同的物質在不同溶劑中溶解度存在差異，相同溶劑中物質的溶解度隨溫度的升高而增大。第一達原飲組合物在提取過程中溫度較高，物質的溶解度相對較高，當冷卻至室溫后，部分物質因溶解度減少將析出，造成第一達原飲組合物呈現(xiàn)一定的沉淀或混懸物，此沉淀或混懸物作為組合物組成的一部分，應該對其質量進行相應的研究，同時供試品溶液的制備過程應該考慮此部分物質的保留。

將實施例2方法制備的達原飲組合物水溶液，分別按照以下方式制備供試品溶液：①直接離心進樣(原液)：取組合物水溶液適量，12000r/min離心10min，取上清液進樣，進樣量10μl，即得。②不同濃度甲醇作溶劑：分別精密量取5ml組合物水溶液置于10ml容量瓶中，分別加入甲醇1ml、2ml、3ml、4ml，5ml，搖勻，加水至刻度，取適量，12000r/min離心10min，取上清液進樣，進樣量20μl，即得。③30％乙腈、30％乙醇作溶劑：分別精密量取5ml組合物水溶液置于10ml容量瓶中，一式兩份，一份加入3ml乙腈，另外一份加入3ml的乙醇，搖勻，加水至刻度，取適量，12000r/min離心10min，取上清液進樣，進樣量20μl，即得。試驗結果見圖12、13。

試驗結果表明：不同濃度甲醇作為溶劑時，在指紋圖譜上與原液相比均有一定差別，其中在1號、2號峰位置上，均出現(xiàn)了原液才能具備的特征峰，3號峰位置上原液的色譜峰均較其余色譜峰大，10％、20％甲醇做溶劑時色譜峰峰高均較小，4號峰位置上30％甲醇、50％甲醇相對比原液色譜峰大，分析可能與相應色譜峰代表的成分在一定濃度的甲醇中溶解度偏低有關。采用一定比例的乙腈或乙醇做為溶劑時，基準湯劑色譜峰與原液相比，在1、2號峰位置上亦存在不出峰的情況，分析可能與達原飲組合物采用水提取工藝有關。因此從指紋圖譜的整體性考慮，為盡可能的兼顧混懸液和沉淀的質量，供試品的制備所選溶劑為水。確定達原飲組合物供試品溶液制備方法如下：

達原飲組合物供試品溶液制備：取第一達原飲組合物5ml，12000r/min離心10min，取上清液，即得?；蛉〉诙_原飲組合物1.7g，精密稱定，置50ml容量瓶中，加水稀釋，超聲溶解，放冷，再加水定容，搖勻，取溶液適量，12000r/min離心10min，取上清液，即得。

實施例5.參照物的選擇

參照物在指紋圖譜中主要用于辨認和評價指紋圖譜特征的指引，不等同于含量測定的對照品。按照《中藥質量標準研究制定技術要求》指紋圖譜的參照物一般選取容易獲取的一個或一個以上制劑中的主要活性成分或指標成分，用于考察指紋圖譜的穩(wěn)定程度和重現(xiàn)性。中藥復方制劑的參照物首選君藥的活性成分或指標成分，而參照物應為保留時間適中、峰面積大小合適、分離穩(wěn)定的色譜峰。

參照物溶液的制備：取氫溴酸檳榔堿、厚樸酚、和厚樸酚、黃芩苷、芍藥苷、知母皂苷、芒果苷、甘草苷、甘草酸銨適量，加入甲醇配制成每ml含有氫溴酸檳榔堿0.1mg，厚樸酚40μg、和厚樸酚24μg，芍藥苷50μg，芒果苷50μg，黃芩苷60μg，甘草苷20μg，甘草酸銨0.2mg，即得。

結果表明：在供試品溶液中芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、和厚樸酚、厚樸酚色譜峰均能良好分離、芍藥苷色譜峰略有拖尾，且有一定干擾，檳榔堿無對應色譜峰，分析由于檳榔堿為小分子生物堿，在普通C18柱上難以保留，而正文擬定的指紋圖譜方法為反相高效液相色譜法，因此檳榔堿不適合作為參照物；草果、厚樸為臣藥，草果主含揮發(fā)油，厚樸指標成分為厚樸酚、和厚樸酚，兩者在圖譜中保留時間過長，不適合作為參照物，黃芩、白芍、知母為佐，指標成分黃芩苷、芍藥苷、知母皂苷、芒果苷，其中黃芩苷在色譜圖中位置適中，峰面積穩(wěn)定，符合參照物的選擇要求，最終確定黃芩苷作為指紋圖譜參照物。

實施例6：共有峰的確定及對照指紋圖譜的建立

采用同一批次飲片，分別制備10份第一達原飲組合物，依法制備供試品溶液，進樣，測定，根據(jù)10批次供試品溶液色譜圖各色譜峰的情況，確定共有峰應20個，各共有峰依次標號為1,2，……，N，其中參照峰標記為12(S)，通過分析，確定其共有特征峰為20個，所述的20個共有特征峰的相對保留時間偏差RSD均小于2％，即：

1號峰平均保留時間RRT為11.554，RSD％為0.18％；

2號峰平均保留時間RRT為20.589，RSD％為0.03％；

3號峰平均保留時間RRT為24.434，RSD％為0.15％；

4號峰平均保留時間RRT為26.558，RSD％為0.14％；

5號峰平均保留時間RRT為29.776，RSD％為0.12％；

6號峰平均保留時間RRT為31.082，RSD％為0.10％；

7號峰平均保留時間RRT為34.114，RSD％為0.08％；

8號峰平均保留時間RRT為37.788，RSD％為0.11％；

9號峰平均保留時間RRT為38.742，RSD％為0.07％；

10號峰平均保留時間RRT為39.778，RSD％為0.07％；

11號峰平均保留時間RRT為40.583，RSD％為0.08％；

12(S)峰平均保留時間RRT為50.099，RSD％為0.07％；

13號峰平均保留時間RRT為53.925，RSD％為0.09％；

14號峰平均保留時間RRT為54.927，RSD％為0.11％；

15號峰平均保留時間RRT為57.315，RSD％為0.17％；

16號峰平均保留時間RRT為61.652，RSD％為0.18％；

17號峰平均保留時間RRT為68.702，RSD％為0.14％；

18號峰平均保留時間RRT為72.735，RSD％為0.05％；

19號峰平均保留時間RRT為84.317，RSD％為0.01％；

20號峰平均保留時間RRT為86.291，RSD％為0.01％；

運用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2012年版)處理圖譜，以160504-1作為參照圖譜，扣除0min～5min，90min～95min的溶劑峰，進行多點校正，匹配20個共有峰，并生成對照指紋圖譜(見圖14-15)，得到第一達原飲組合物對照指紋圖譜。計算樣品相似度，結果表明，采用不同產地飲片組合煎煮的10份第一達原飲組合物相似度在0.983～1.000之間(見表1)，相似度較高。

表1 10份第一達原飲組合物相似度評價結果

根據(jù)10批供試品溶液色譜圖所給出的相關參數(shù)，選擇具有特征性的20共有峰，以12號參照峰峰面積作為1，計算其他各共有特征指紋峰峰面積的比值，結果見表2。

表2 10份第一達原飲組合物共有峰面積比值結果

取第一達原飲組合物所對應的飲片，制備連續(xù)三批次第二達原飲組合物樣品，按指紋圖譜測定方法測定，記錄色譜圖(見附圖16)，以第一達原飲組合物生成的對照指紋圖譜作為隨行對照圖譜，計算3批次第二達原飲組合物的相似度。結果見下表。

第二達原飲組合物相似度計算結果

實施例7.指紋圖譜方法學驗證.

(1)空白試驗

為考察空白溶劑對指紋圖譜中各色譜峰的干擾，進行空白試驗。按擬定方法，進樣10μl超純水運行梯度，記錄色譜圖(圖17)，結果表明空白樣品基線平穩(wěn)、基本無干擾。

(2)指紋圖譜精密度試驗

按照指紋圖譜精密度規(guī)定方法操作，取第二達原飲組合物(編號：1509002S-2)，依法制備，連續(xù)進樣6次，每次10μl，記錄色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)計算相似度，計算RSD值，所得結果見下表.

表3精密度試驗相似度結果

試驗結果表明：連續(xù)進樣6次相似度結果相對標準偏差小于2.0％，儀器精密度良好。

(3)指紋圖譜重復性試驗

按照指紋圖譜重復性試驗規(guī)定方法操作，取同一批達原飲組合物(批號1509003S-2)6份，依法制備，分別進樣10μl，記錄色譜圖，采用2012年版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)計算相似度，計算RSD值，所得結果見表4.

表4重復性試驗相似度結果

試驗結果表明：指紋圖譜檢測方法重復性良好。

(4)指紋圖譜供試品溶液穩(wěn)定性

按照指紋圖譜穩(wěn)定性試驗規(guī)定方法操作，取同一供試品溶液，分別于0h、2h、4h、8h、16h、24h、36h時間點進樣，記錄色譜圖，計算相似度及RSD值，所得結果見表5。

表5供試品穩(wěn)定性試驗相似度結果

試驗結果表明：供試品溶液在36h以內相對標準偏差小于2.0％，穩(wěn)定性良好。

顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。