本發(fā)明屬于食品領(lǐng)域，涉及一種三唑包裹的熒光金納米簇合成方法及檸檬黃測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

檸檬黃(TZ)，其系統(tǒng)命名為：3-羧基-5-羥基(對(duì)苯磺酸)-4-(對(duì)苯磺酸偶氮)-吡唑三鈉鹽，其結(jié)構(gòu)式如圖-1所示。是一種人工合成的偶氮有機(jī)食用染料，廣泛用于烘焙產(chǎn)品、糖果和飲料等食品工業(yè)。近來研究顯示，當(dāng)人體攝入過量的檸檬黃，可能會(huì)對(duì)機(jī)體健康造成不利影響，如哮喘、蕁麻疹、染色體損傷、生殖毒性、神經(jīng)行為毒性甚至癌癥。越來越多的研究也證實(shí)了檸檬黃潛在的毒性。因此食品中檸檬黃的含量必須得到嚴(yán)格的控制。為了食品安全和人類健康，建立一種快速、靈敏、簡(jiǎn)單、便宜的檢測(cè)檸檬黃的方法是十分有必要的。

目前，越來越多的儀器分析方法已運(yùn)用到食品中檸檬黃的檢測(cè)。主要包括紫外可見分光光度法(UV-vis)、高效液相色譜法(HPLC)、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(CZE)、電化學(xué)檢測(cè)等。然而其中有些方法由于其樣品前處理復(fù)雜、耗時(shí)、靈敏度低或選擇性差，不適合用于常規(guī)檢測(cè)。熒光金納米團(tuán)簇由于其具有獨(dú)特的物理化學(xué)特性，如極小的粒徑尺寸、良好的生物相容性、良好的光穩(wěn)定性，使其在傳感檢測(cè)、分子成像、癌癥的診斷及治療等方面表現(xiàn)突出，并由此對(duì)生物醫(yī)學(xué)和分析化學(xué)領(lǐng)域的科研發(fā)展起到巨大的推動(dòng)作用。而熒光傳感探針因?yàn)楹?jiǎn)單、高靈敏度以及快速的優(yōu)點(diǎn)，近來備受關(guān)注。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明專利的目的在于提供一種三唑包裹的熒光金納米簇合成方法及檸檬黃測(cè)定方法，將金納米材料與分析檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，建立了一種簡(jiǎn)單、快速的對(duì)飲品中檸檬黃的檢測(cè)方法。

三唑包裹的熒光金納米簇合成方法，向盛有80mL三重蒸餾水的三口燒瓶中加入1.0mL、10mM的HAuCl₄水溶液；然后在劇烈攪拌的條件下，加入5.0mL、10mM的3-巰基-1,2,4-三唑水溶液，用1M的HCl調(diào)節(jié)溶液的pH為3左右；90℃條件下反應(yīng)13個(gè)小時(shí)得無色溶液，按Au原子濃度計(jì)算濃度約為0.11mM，置于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

三唑包裹的熒光金納米簇測(cè)定檸檬黃的方法，將濃度為0.0385mM 1.4mL三唑包裹的熒光金納米簇、500uL 30mM pH為3.0的磷酸鹽緩沖溶液，以及檸檬黃溶液或其他干擾物質(zhì)，依次加入5mL的離心管中，并用超純水定容至4mL，然后搖勻在25℃下平衡5分鐘，最后在λ_ex＝315nm時(shí)測(cè)定其熒光強(qiáng)度，通過光譜分析測(cè)定檸檬黃

本發(fā)明合成了3-巰基-1,2,4-三唑(TRO)保護(hù)的水溶性熒光金納米團(tuán)簇(TRO-AuNCs)，將金納米材料與分析檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，利用TRO-AuNCs具有強(qiáng)且穩(wěn)定的熒光發(fā)射性質(zhì)，TRO-AuNCs作為熒光分子，檸檬黃作為猝滅劑，二者間通過共振能量轉(zhuǎn)移使熒光分子TRO-AuNCs的熒光被猝滅。本發(fā)明即是基于以上原理，建立了一種簡(jiǎn)單、快速的對(duì)飲品中檸檬黃的檢測(cè)方法。

附圖說明

圖-1為檸檬黃(TZ)的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖；

圖-2為TRO-AuNCs的紫外-可見吸收光譜圖；

圖-3為TRO-AuNCs熒光激發(fā)(a)和發(fā)射光譜圖(b)；

圖-4為TRO(a)和TRO-金納米團(tuán)簇(b)的紅外光譜圖；

圖-5(A)為不同反應(yīng)比例合成的TRO-AuNCs的熒光光譜圖；

圖-5(B)為另一比例合成的TRO-AuNCs的熒光光譜圖；

圖-6為不同pH下合成的TRO-AuNCs的熒光強(qiáng)度示意圖；

圖-7(A)為不同時(shí)間合成的TRO-AuNCs的熒光光譜圖；

圖-7(B)為另一時(shí)間合成的TRO-AuNCs的熒光光譜圖；

圖-8為TRO-AuNCs的合成和傳感檢測(cè)檸檬黃示意圖；

圖-9為TRO-AuNCs的熒光發(fā)射光譜(a)與檸檬黃的紫外吸收光譜(b)重疊圖；

圖-10為pH對(duì)熒光猝滅的影響圖；

圖-11為TRO-AuNCs濃度對(duì)熒光猝滅的影響圖；

圖-12為反應(yīng)溫度對(duì)體系熒光猝滅的影響圖；

圖-13反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系熒光猝滅的影響圖；

圖-14為檸檬黃和TRO-AuNCs體系的干擾試驗(yàn)圖；

圖-15(A)為檸檬黃對(duì)體系的熒光猝滅作用曲線；

圖-15(B)為熒光猝滅與檸檬黃濃度的線性關(guān)系圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員正在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)驗(yàn)部分

1 儀器

本實(shí)驗(yàn)所用主要儀器見表1：

表1主要儀器

2 試劑

本實(shí)驗(yàn)所用主要試劑見表2：

表2主要試劑

3 試驗(yàn)方法

3.1 TRO修飾的水溶性金納米團(tuán)簇的合成

本發(fā)明采用水熱法合成了TRO修飾的具有熒光性能的水溶性金納米團(tuán)簇。具體制備方法如下：向盛有80mL三重蒸餾水的三口燒瓶中加入1.0mL、10mM的HAuCl₄水溶液；然后在劇烈攪拌的條件下，加入5.0mL、10mM的3-巰基-1,2,4-三唑水溶液，用1M的HCl調(diào)節(jié)溶液的pH為3左右；90℃條件下反應(yīng)13個(gè)小時(shí)得無色溶液，濃度約為0.11mM(按Au原子濃度計(jì)算)，置于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 TRO-AuNCs的表征

利用UV-2550紫外可見分光光度計(jì)測(cè)得物質(zhì)的紫外吸收光譜圖。采用Nicolet 6700型傅立葉變換紅外光譜儀，KBr壓片法分別測(cè)定4000-500cm^-1內(nèi)TRO和TRO-AuNCs。采用JSM-6510掃描電子顯微鏡以及配套的EDS對(duì)金納米簇元素進(jìn)行分析。金納米簇?zé)晒夤庾V測(cè)定利用Cary Eclipse熒光光度計(jì)，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10nm，在315nm的激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)其發(fā)射譜圖。

3.3 檸檬黃儲(chǔ)備液的配制

準(zhǔn)確稱取0.0053g的檸檬黃，用水溶解后定容至100mL容量瓶中，得到檸檬黃儲(chǔ)備液濃度為0.1mM，并置于4℃的冰箱保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋到所需濃度。

3.4 熒光檢測(cè)方法

檢測(cè)檸檬黃的步驟按照如下方法操作：將1.4mL TRO-AuNCs(大概濃度為0.0385mM)、500uL 30mM pH為3.0的磷酸鹽緩沖溶液，以及不同體積的檸檬黃溶液或其他干擾物質(zhì)，依次加入5mL的離心管中，并用超純水定容至4mL，然后搖勻在25℃下平衡5分鐘，最后在λ_ex＝315nm時(shí)測(cè)定其熒光強(qiáng)度。

4結(jié)果與討論

4.1 TRO修飾的AuNCs的紫外-可見光譜

圖-2為濃度為0.11mM的TRO-金納米團(tuán)簇的紫外-可見光區(qū)的吸收光譜。由圖可見，在整個(gè)掃描的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，除了315nm處的肩峰以外，沒有觀察到明顯的表面等離子共振吸收峰。文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)單層保護(hù)的金納米簇的粒徑小于2nm時(shí)，金納米粒子在520nm處的特征等離子吸收帶將消失，這是由于阻尼效應(yīng)所造成的。側(cè)面表明合成的TRO-金納米團(tuán)簇的粒徑小于2nm。而紫外區(qū)315nm處出現(xiàn)的肩峰，與研究報(bào)道的8原子的金納米簇384nm處的吸收峰的結(jié)果類似，該峰位即熒光金納米團(tuán)簇的最大激發(fā)峰位。因此對(duì)于TRO-AuNCs，315nm處的肩峰值得我們關(guān)注。

4.2 TRO修飾的AuNCs的熒光光譜

TRO作為修飾劑，90℃下反應(yīng)13個(gè)小時(shí)制備的AuNCs的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜如圖-3所示，掃描得到的熒光激發(fā)和發(fā)射位置分別為315nm和401nm，315nm處的熒光激發(fā)波長(zhǎng)與圖-2所觀察到的肩峰315nm一致。將所得的AuNCs溶液在4℃的冰箱中放置6個(gè)月后沒有產(chǎn)生沉淀，其熒光強(qiáng)度降低僅約9％，表明合成的熒光金納米團(tuán)簇能在水溶液中長(zhǎng)期穩(wěn)定的存在。將試驗(yàn)過程中使用到的試劑如氯金酸、3-巰基-1,2,4-三唑、氯金酸和3-巰基-1,2,4-三唑的混合溶液、水等都在相同的熒光測(cè)試條件下進(jìn)行了測(cè)定，沒有觀察到熒光現(xiàn)象，輔助說明了具有強(qiáng)且穩(wěn)定的熒光發(fā)射性質(zhì)的TRO修飾的水溶性AuNCs的成功合成。

4.3 TRO-AuNCs的傅立葉變換紅外光譜(FTIR)分析

為證實(shí)配體3-巰基-1,2,4-三唑(TRO)與金納米團(tuán)簇的成功結(jié)合，同時(shí)確定其結(jié)合方式，采用了傅立葉變換紅外光譜(FTIR)對(duì)AuNCs和TRO配體進(jìn)行了研究，測(cè)定結(jié)果如圖-4(a)和(b)所示。從該圖中可以得到：配體TRO在2620cm^-1處出現(xiàn)-SH的伸縮振動(dòng)峰。對(duì)比TRO保護(hù)的AuNCs(TRO-Au NPs)的紅外譜圖，后者峰數(shù)較少，而2620cm^-1處的-SH伸縮振動(dòng)峰消失，主要是因?yàn)榉磻?yīng)后TRO上的巰基與金原子表面通過Au-S鍵進(jìn)行了配位結(jié)合。由此可知配體TRO與Au發(fā)生了配位作用，形成穩(wěn)定的Au-S鍵并阻止生成的AuNCs發(fā)生團(tuán)聚，起到修飾和穩(wěn)定AuNCs的作用。通過TRO-AuNCs的能量分散X射線光譜分析顯示，合成的金納米材料中含有N、C、S、Au元素，輔助說明TRO-AuNCs合成成功。

4.4 TRO-AuNCs合成條件的考察

4.4.1 反應(yīng)物比例的考察

在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，不同的配體與氯金酸的摩爾比會(huì)影響合成的金納米材料的熒光性能，為了獲得熒光強(qiáng)度較高的金納米材料，我們分別對(duì)1:1、3:1、5:1、7:1、9:1的反應(yīng)比例進(jìn)行了考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖-5(A)與(B)所示。從圖中可以看出，反應(yīng)比例為1:1時(shí)，合成金納米溶液呈淺紅色，在520nm處有特征吸收峰，表明有大顆粒金納米形成，且沒有明顯的熒光性能；隨著反應(yīng)比例的增大，TRO-AuNCs熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，在反應(yīng)比為5:1時(shí)TRO-AuNCs的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大；隨著反應(yīng)比例繼續(xù)增大，熒光強(qiáng)度反而降低，可能是由于修飾在金納米表面的配體已達(dá)飽和，過量的配體之間的相互作用引起金納米簇的聚集，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。綜上，本試驗(yàn)中選擇的最佳合成比例為5:1。

4.4.2 反應(yīng)酸度的考察

TRO包裹的熒光金納米簇水溶液對(duì)體系酸度的變化十分靈敏，因此對(duì)反應(yīng)酸度進(jìn)行了考察。在pH為1-11范圍內(nèi)TRO-AuNCs溶液熒光強(qiáng)度變化如圖-6所示，在pH＝1.00～3.00的酸度范圍內(nèi)，合成的TRO-AuNCs為透明溶液，且隨體系pH增加熒光強(qiáng)度值逐漸增大；當(dāng)pH＝3.00左右，TRO-AuNCs溶液熒光強(qiáng)度達(dá)到最大；然后隨著pH的繼續(xù)增加，合成的TRO-AuNCs熒光強(qiáng)度反而降低。并在pH>6.00以后，合成的金納米簇溶液開始變渾濁，有團(tuán)聚現(xiàn)象產(chǎn)生，出現(xiàn)白色沉淀。由此可見合成的TRO-AuNCs溶液不能在堿性條件下穩(wěn)定存在。因此為了制備出穩(wěn)定的、強(qiáng)熒光發(fā)射性能的金納米團(tuán)簇溶液，試驗(yàn)最終選擇的體系最佳反應(yīng)酸度為pH＝3.00。

4.4.3 反應(yīng)時(shí)間的選擇

為研究反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成TRO-AuNCs的光譜性能的影響，試驗(yàn)測(cè)定了合成TRO-AuNCs過程中1-15h間溶液的熒光光譜，結(jié)果如圖-7所示。圖-7(A)為不同時(shí)間合成的TRO-AuNCs的熒光光譜圖，圖-7(B)為另一時(shí)間合成的TRO-AuNCs的熒光光譜圖；從圖中可以看出隨著反應(yīng)，時(shí)間的增加，TRO-AuNCs的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，到13h左右熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，然后隨著時(shí)間的增加熒光強(qiáng)度基本保持穩(wěn)定，且熒光發(fā)射峰的位置基本不移動(dòng)。因此，為獲得穩(wěn)定的強(qiáng)熒光發(fā)射性質(zhì)的金納米團(tuán)簇，實(shí)驗(yàn)中選擇的最佳反應(yīng)時(shí)間為13h。

4.5 水溶性TRO-AuNCs作為檢測(cè)檸檬黃的熒光探針

水溶性TRO保護(hù)的金納米團(tuán)簇的制備過程及熒光傳感檢測(cè)檸檬黃的示意圖如圖-8所示。以TRO與氯金酸為原材料，以1M的HCl調(diào)節(jié)溶液pH制備出的金納米簇溶液在激發(fā)波長(zhǎng)315nm下具有強(qiáng)的熒光發(fā)射。向體系加入檸檬黃后，金納米團(tuán)簇溶液的熒光發(fā)生明顯猝滅現(xiàn)象。

圖-9為TRO包裹金納米簇的熒光發(fā)射光譜與檸檬黃的紫外-可見光譜的重疊譜圖?？梢杂^察到二者譜圖發(fā)生了很大程度的重疊，以此推測(cè)檸檬黃與金納米簇之間是通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)導(dǎo)致熒光分子TRO-AuNCs的熒光被猝滅。為證實(shí)這一猜想我們作了以下研究。根據(jù)Foster的非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，能量轉(zhuǎn)移在以下幾種條件下才會(huì)發(fā)生；(a)贈(zèng)體與受體之間的間隔在2-8nm之間；(b)贈(zèng)體的熒光峰與受體的吸收峰之間的有效重疊；(c)贈(zèng)體和受體的偶極子間的適當(dāng)取向。贈(zèng)體和受體之間的距離和能量轉(zhuǎn)移效率可由方程式(4-1)、(4-2)、(4-3)計(jì)算得出：

$E=1-\frac{F}{F_0}=\frac{R_0^6}{R_0^6+r^6}---(4-1)$

R₀⁶＝8.8×10^-25K²N^-4φJ(rèn) (4-2)

$J=\frac{{\∫}_0^{\mathrm{\∞}}F\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{\ϵ}\left(\mathrm{\λ}\right){\mathrm{\λ}}^{4}d\mathrm{\λ}}{{\∫}_0^{\mathrm{\∞}}F\left(\mathrm{\λ}\right)d\mathrm{\λ}}---(4-3)$

其中，r代表贈(zèng)體和受體間的間隔；R₀表示當(dāng)能量轉(zhuǎn)移率為50％時(shí)由以上方程計(jì)算得到的距離；K²是贈(zèng)體-受體偶極子間的取向因子；n是介質(zhì)的折射率；φ是贈(zèng)體的熒光量子產(chǎn)率；J代表贈(zèng)體的熒光發(fā)射峰與受體的吸收峰間的重疊程度；F(λ)是贈(zèng)體在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度；ε(λ)是受體在波長(zhǎng)λ處的摩爾吸光系數(shù)。在以上方程中，K²＝2/3，n＝1.36，φ＝0.13，將其代入方程(4-1)、(4-2)、(4-3)，得出J＝5.83×10^-15cm³·L·mol^-1，E＝0.3287，R₀＝3.38nm，r＝4.83nm。得出的r值小于8nm，說明TRO-AuNCs與檸檬黃之間確實(shí)存在相互作用，并且極有可能發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移。結(jié)合二者熒光發(fā)射和紫外光譜明顯重疊，表明TRO-AuNCs作為能量供體，檸檬黃作為能量受體，二者間發(fā)生了共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，從而導(dǎo)致檸檬黃對(duì)TRO-AuNCs的熒光猝滅。并且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)檸檬黃濃度與金納米團(tuán)簇的熒光猝滅程度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，基于此我們將水溶性的TRO-AuNCs作為檢測(cè)檸檬黃的熒光探針。為獲得更為靈敏的檢測(cè)信號(hào)，并對(duì)一系列如pH、金納米簇用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。

4.5.1 pH對(duì)猝滅效率的影響

本發(fā)明合成的TRO-AuNCs在堿性的環(huán)境下不穩(wěn)定，有沉淀產(chǎn)生且熒光發(fā)射強(qiáng)度極低，因此實(shí)驗(yàn)主要考察了酸性范圍內(nèi)pH對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)操作如下：向8支5mL離心管中分別加入1.4mL TRO-AuNCs(大概濃度為0.0385mM)、500μL 30mM pH在1-6的磷酸鹽緩沖溶液，以及0.5mL 100μM的檸檬黃儲(chǔ)備溶，定容到4.0mL，混合均勻。在25℃下平衡5min后，測(cè)定其熒光強(qiáng)度。結(jié)果如圖-10所示，當(dāng)pH≤3.0時(shí)，體系的熒光猝滅效率隨著pH值的增大而逐漸增強(qiáng)；當(dāng)pH≥3.0時(shí)，體系的熒光猝滅效率隨著pH值的增大而急劇降低；當(dāng)pH＝3.0時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度和熒光猝滅效率均達(dá)到最大值，反應(yīng)最為靈敏，并且此時(shí)獲得的線性關(guān)系良好。因此，本實(shí)驗(yàn)選取3.0作為最佳的檢測(cè)檸檬黃的pH值。

4.5.2 TRO-AuNCs用量的選擇

TRO-AuNCs的濃度不僅會(huì)影響體系的熒光發(fā)射強(qiáng)度，還會(huì)對(duì)檢測(cè)目標(biāo)物的靈敏度及線性工作范圍造成嚴(yán)重的影響，故在其它實(shí)驗(yàn)測(cè)試條件同上情況下，本實(shí)驗(yàn)對(duì)TRO-AuNCs的濃度在0.0055-0.0550mM范圍內(nèi)進(jìn)行了考察。結(jié)果如圖-11所示，隨著TRO-AuNCs濃度的增加，熒光猝滅效率呈增大趨勢(shì)；在0.0385mM時(shí)達(dá)到最大值，然后隨著TRO-AuNCs濃度的增加，體系的熒光猝滅效率逐漸降低。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是由于TRO-AuNCs濃度過高時(shí)，產(chǎn)生了TRO-AuNCs的自猝滅。因此，為了獲得比較滿意的檢測(cè)信號(hào)，最后實(shí)驗(yàn)選擇金納米簇的濃度為0.0385mM。

4.5.3 反應(yīng)溫度的考察

由于在熒光光度法的測(cè)定中，反應(yīng)溫度對(duì)TRO-AuNCs-TZ體系熒光強(qiáng)度會(huì)產(chǎn)生影響，因此，在其它實(shí)驗(yàn)測(cè)試條件同上情況下，本發(fā)明考察了溫度對(duì)體系熒光猝滅效率的影響。如圖-12所示，當(dāng)溫度為25℃時(shí)，體系熒光猝滅效率最強(qiáng)。當(dāng)反應(yīng)溫度低于25℃或者是高于25℃時(shí)，熒光猝滅效率都較低。這說明低溫和高溫都不利于反應(yīng)的進(jìn)行。因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明選擇最佳反應(yīng)溫度為25℃。

4.5.4 反應(yīng)時(shí)間的考察

在室溫25℃條件下，考察了反應(yīng)時(shí)間對(duì)TRO-AuNCs-TZ體系的熒光猝滅效率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖-13所示，從0-5min，熒光猝滅效率增強(qiáng)比較明顯；在5min的時(shí)候，體系熒光猝滅程度達(dá)到最大；5min以后，熒光猝滅效率趨于穩(wěn)定且熒光強(qiáng)度變化不大。這說明整個(gè)反應(yīng)在5min內(nèi)完成，能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)際樣品中檸檬黃的快速檢測(cè)。因此本實(shí)驗(yàn)選擇在室溫25℃下反應(yīng)5min后進(jìn)行檢測(cè)。

4.5.5 共存物質(zhì)的干擾試驗(yàn)

為了進(jìn)一步研究本發(fā)明基于TRO-AuNCs與檸檬黃之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致熒光猝滅原理所制備的熒光探針對(duì)檢測(cè)實(shí)際樣品中檸檬黃的選擇性情況，本發(fā)明對(duì)飲品如果汁、橙汁中可能與檸檬黃共存的干擾物質(zhì)進(jìn)行了考察。結(jié)果見圖14，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cl^-、NO₃^-、SO₄^2-、CO₃^2-、CH₃COO^-、葡萄糖、果糖等濃度為檸檬黃濃度的150倍時(shí)，不會(huì)對(duì)檢測(cè)檸檬黃產(chǎn)生影響；當(dāng)Cr³⁺、維生素C、羅丹明B、亞甲基藍(lán)濃度為檸檬黃30倍時(shí)，不會(huì)對(duì)檸檬黃檢測(cè)造成太大的干擾。

圖-14檸檬黃和TRO-AuNCs體系的干擾試驗(yàn)，磷酸鹽緩沖液pH＝3.0，TZ的濃度為5.93μM；Na+、K+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Cl-、NO3-、SO42-、CO32-、CH3COO-、葡萄糖、果糖的濃度為0.89mM；Cr3+、維生素C、羅丹明B、亞甲基藍(lán)的濃度為0.18mM。

綜上，一些常見的食品添加劑及常見的無機(jī)鹽離子在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)于檸檬黃的定量檢測(cè)均沒有顯著影響。證實(shí)該方法可以選擇性檢測(cè)實(shí)際飲品中檸檬黃。

4.6 方法學(xué)考察

4.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

體系在選擇的最佳條件即pH為3.0的磷酸鹽緩沖溶液，濃度為0.0385mM的TRO-AuNCs溶液，作用時(shí)間為5.0min，反應(yīng)溫度為25℃下，加入不同體積的檸檬黃儲(chǔ)備液，使其最終濃度分別為0.00，0.08，0.90，1.50，2.50，5.00，7.50，10.00、12.50、17.50、22.50、27.50、32.50和37.50μM，測(cè)定其熒光強(qiáng)度。得到加入不同濃度檸檬黃體系的熒光光譜如圖-15(A)所示，可以看出隨著檸檬黃的加入，TRO-AuNCs的熒光強(qiáng)度逐漸降低；以TZ濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度猝滅程度(F₀/F)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖-15(B)所示。實(shí)驗(yàn)得到的線性回歸方程為F₀/F＝0.9817+0.0514C(R²＝0.9993)。表明，檸檬黃濃度在0.08～37.50μM范圍內(nèi)與體系熒光強(qiáng)度的猝滅程度呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)12.50μM的檸檬黃11次平行實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.7％，檢測(cè)限(3σ/K)為0.028μM。

4.6.2 飲品實(shí)樣加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)

為了考察該熒光探針的實(shí)樣分析能力，將其應(yīng)用于實(shí)際飲品果汁、橙汁、蜂蜜中檸檬黃的測(cè)定。樣品的處理：開瓶前搖勻以確保樣品均勻，準(zhǔn)確移取樣品1mL于15mL的離心管中，用超純水稀釋至10mL，超聲波超聲15min，過0.45um的濾膜以待檢測(cè)。

回收率實(shí)驗(yàn)：通過對(duì)飲品果汁、橙汁、蜂蜜的分析測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，果汁和蜂蜜中沒有發(fā)現(xiàn)檸檬黃的存在；橙汁中檢測(cè)到0.21μΜ檸檬黃存在。為了考證該方法的準(zhǔn)確度和精密度，本實(shí)驗(yàn)將檸檬黃的標(biāo)準(zhǔn)樣品加入到果汁、橙汁、蜂蜜樣品中，對(duì)其進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。

精密度試驗(yàn)：0.0385mM TRO-AuNCs溶液，0.5mL pH為3.0的磷酸鹽緩沖溶液，和一定量的實(shí)際樣品，再加入不同體積的檸檬黃儲(chǔ)備液，定容至4mL，使果汁和蜂蜜加入的檸檬黃低、中、高三個(gè)水平的最終濃度分別為0.40，4.00，8.00uM；使橙汁加入的檸檬黃的濃度為實(shí)際檢測(cè)含量的0.5-2.0倍即最終濃度分別為0.20，0.30，0.40uM。每個(gè)濃度平行3份，25℃恒溫水槽中平衡5min后測(cè)定。沒有加實(shí)際樣品和檸檬黃儲(chǔ)備液的作為空白組。將上述樣品日內(nèi)、日間重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算日內(nèi)、日間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

本實(shí)驗(yàn)得到日內(nèi)和日間回收率范圍分別為果汁949％-95.53％和88.8％0-99.27％、橙汁92.60％-102.15％和89.25％-92.65％、蜂蜜92.38％-105.02％和90.24％-103.40％，回收率結(jié)果較好。RSD分別為果汁2.81％-4.48％和3.16％-5.91％、橙汁2.90％-6.25％和2.27％-5.63％、蜂蜜2.50％-5.54％和3.36％-5.92％。綜上，該方法具有很好的可靠性，表明本發(fā)明建立的方法可應(yīng)用于實(shí)際飲品中檸檬黃含量的測(cè)定。

表3實(shí)際飲品中對(duì)檸檬黃的回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果(n＝3)

4.7 方法比較

通過與文獻(xiàn)報(bào)道的方法比較發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提出的方法得到的線性相關(guān)系數(shù)r值是比較理想的；精密度雖不是最好的，但可以滿足實(shí)際檢測(cè)檸檬黃的需求；本發(fā)明的方法得到的檢測(cè)限(LOD)能達(dá)到28nM(0.015ppm)與文獻(xiàn)報(bào)道的相近甚至更好，遠(yuǎn)低于我國(guó)食品添加劑檸檬黃的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定值，即人體日攝入量的最高限定標(biāo)準(zhǔn)(0.75ppm)，因此本發(fā)明所提出的方法能夠滿足實(shí)際樣品中檸檬黃測(cè)定的需要。