本發(fā)明涉及一種新型的基于CdSe/ZnS量子點(diǎn)納米簇的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的研制新方法，以及利用該電化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測(cè)癌細(xì)胞的分析方法。

背景技術(shù)：
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電致化學(xué)發(fā)光(ECL)具有操作簡(jiǎn)單，快速，靈敏度高，可控性好等諸多優(yōu)良的性能特點(diǎn)，ECL生物傳感器作為一種新型的分析檢測(cè)裝置正逐漸應(yīng)用于各種生物分析檢測(cè)。[Piper,D.J.E.；Barbante,G.J.；Brack,N.；Pigram,P.J.；Hogan,C.F.Langmuir 2011,27,474–480.]。最近，以量子點(diǎn)為發(fā)光材料的ECL生物傳感器和生物分析技術(shù)由于其顯著的ECL發(fā)光性能、良好的生物相容性以及本身的納米放大效應(yīng)等諸優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于分析科學(xué)領(lǐng)域。[Lei,J.；Ju,H.TrendsAnal.Chem.2011,30,1351–1359.]?；诹孔狱c(diǎn)ECL的免疫分析測(cè)定[Lin,D.；Wu,J.；Yan,F.；Deng,S.；Ju,H.Anal.Chem.2011,83,5214–5221.]，適配體技術(shù)[Jie,G.F.；Yuan,J.X.；Zhang,J.Biosens.Bioelectron.2012,31,69–76.]，DNA檢測(cè)[Divsar,F.；Ju,H.Chem.Commun.2011,47,9879–9881.]以及細(xì)胞傳感技術(shù)等許多方法[Jie,G.F.；Wang,L.；Yuan,J.X.；Zhang,S.S.Anal.Chem.2011,83,3873–3880.]越來越多地應(yīng)用于生物分子的高靈敏檢測(cè)。

癌癥是目前最難治療的疾病之一，嚴(yán)重威脅著人們的身心健康。因此對(duì)癌細(xì)胞靈敏準(zhǔn)確的識(shí)別和檢測(cè)對(duì)于癌癥的診斷和治療相當(dāng)重要。目前，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的方法有很多，比如流式細(xì)胞術(shù)[Raddatz,M.-S.L.；Dolf,A.；Endl,E.；Knolle,P.；Famulok,M.；Mayer,G.Angew.Chem.Int.Ed.2008,47,5190–5193.]，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[Zhang,X.；Yu,R.M.K.；Jones,P.D.；Lam,G.K.W.；Newsted,J.L.；Gracia,T.；Hecker,M.；Hilscherova,K.；Sanderson,J.T.；Wu,R.S.S.；Giesy,J.P.Environ.Sci.Technol.2005,392777–2785.]，微量測(cè)定技術(shù)[Xu,Y.；Phillips,J.A.；Yan,J.；Li,Q.；Fan,Z.H.；Tan,W.Anal.Chem.2009,81,7436–7442.]以及細(xì)胞濃縮技術(shù)[Phillips,J.A.；Xu,Y.；Xia,Z.；Fan,Z.H.；Tan,W.Anal.Chem.2009,81,1033–1039.]等。到目前為止，許多DNA信號(hào)放大的技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于生物分析，比如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[Wan,G.；EnLim,Q.；Too,H.P.RNA2010,16,1436–1445.]，滾環(huán)復(fù)制放大[Zhou,Y.；Huang,Q.；Gao,J.；Lu,J.；Shen,X.；Fan,C.Nucleic Acids Res.2010,38,e156.]，鏈置換放大[Qiu,L.P.；Wu,Z.S.；Shen,G.L.；Yu,R.Q.Anal.Chem.2011,83,3050–3057.]以及基于核酸外切酶和內(nèi)切酶的放大技術(shù)[Zhang,H.；Li,F.；Dever,B.；Li,X.F.；Le,X.C.Chem.Rev.2013,113,2812–2841.]，然而這些方法均需要穩(wěn)定的熱環(huán)境或者生物酶的參與。最近報(bào)道的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)作為一種DNA自聚合的過程[Choi,H.M.T.；Chang,J.Y.；Trinh,L.A.；Padilla,J.E.；Fraser,S.E.；Pierce,N.A.Nat.Biotechnol.2010,28,1208–1212.]，在沒有生物酶參與的情況下實(shí)現(xiàn)了對(duì)生物分子的高選擇性和特異性檢測(cè)。所有無酶放大技術(shù)中，雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)受到研究者的廣泛青睞[Peng,Y.；Choi,H.M.T.；Calvert,C.R.；Pierce,N.A.Nature 2008,451,318-322.]，已經(jīng)應(yīng)用于核酸和蛋白質(zhì)的分析檢測(cè)[Zhu,G.,Zheng,J.,Song,E.,Donovan,M.,Zhang,K.,Liu,C.,Tan,W.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2013,1107998–8003.]。然而，還鮮有報(bào)道將雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大技術(shù)與ECL結(jié)合，并應(yīng)用于癌細(xì)胞的高靈敏檢測(cè)。

以CdSe/ZnS量子點(diǎn)為發(fā)光材料，以納米金表面DNA雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為放大手段，研制一種新型的CdSe/ZnS量子點(diǎn)納米簇ECL生物信號(hào)探針。合成一種新型的具有良好導(dǎo)電性和磁性的納米金棒，構(gòu)建具有納米放大效應(yīng)的磁性修飾電極，用以負(fù)載大量的捕捉DNA分子。納米金表面引發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，大量量子點(diǎn)通過發(fā)卡DNA修飾到電極上，產(chǎn)生放大的ECL信號(hào)。基于目標(biāo)細(xì)胞對(duì)適體(c-DNA1)的特異性識(shí)別，將CdSe/ZnS量子點(diǎn)納米簇ECL生物探針與DNA雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞高靈敏、高選擇性的檢測(cè)，該項(xiàng)研究對(duì)癌細(xì)胞的早期臨床檢測(cè)具有很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的之一是提供一種具有良好導(dǎo)電性和磁性的Au-Fe₂O₃磁性納米金棒，構(gòu)建具有納米放大效應(yīng)的磁性修飾電極，用以負(fù)載大量的捕捉DNA(c-DNA1)分子。具體包括以下步驟：

步驟1.納米金種子生成：

0.25mL 0.01M的HAuCl₄和9.75mL 0.1M的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)加入到15mL的塑料管中混合均勻，再將0.6mL 0.01M的NaBH₄溶液迅速倒入到上混合液中，然后快速的反復(fù)倒置搖晃塑料管2min，室溫下將混合物放置2h后備用。

步驟2.納米金棒的生成：

2.0mL0.01M的HAuCl₄和0.4mL 0.01M的AgNO₃與40.0mL0.1M的CTAB加入到50.0mL的三口燒瓶中，混合均勻后用1.0M的HCl溶液調(diào)節(jié)pH大約在1-2，再加入0.32mL的抗壞血酸(維生素C)，然后取0.02mL上述合成的CTAB穩(wěn)定的納米金種子溶液加入到增長(zhǎng)液中，將溶液搖勻后靜置16h。

步驟3.Au-Fe₂O₃磁性金棒的合成：

首先將10.0mL納米金溶液加到0.12mL0.05M的乙酰丙酮鐵(以乙腈為溶液)中，然后用1.0M的NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH至9左右(大約用0.3mL)，攪拌混勻，將溶液轉(zhuǎn)入25.0mL的聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，在190℃的恒溫烤箱中加熱3h后拿出，自然冷卻至室溫，將獲得的產(chǎn)物離心清洗兩次后重新分散到去離子水中。

步驟4.磁性修飾電極的形成

磁性金電極依次使用1.0μm、0.3μm和0.05μm的α-Al₂O₃拋光粉拋光，用二次蒸餾水超聲洗滌后自然晾干，將8μL的磁性納米金棒溶液滴到磁性金電極的表面并自然晾干。然后將10μL的適體DNA(C1)滴加到電極的表面，溫浴反應(yīng)10～16h。

本發(fā)明的目的之二是提供一種新型的CdSe/ZnS量子點(diǎn)納米簇ECL信號(hào)探針。具體包括以下步驟：

步驟1.NaHSe的制備：0.0950g的NaBH₄加入10mL的離心管中，在離心管中加入6mL的去離子水，加入磁子攪拌溶解，通氮?dú)馀懦龆嘤嗟难鯕?，稱取0.0947g的Se粉快速加入體系中，在常溫下攪拌至無色透明(即Se粉完全溶解)

步驟2.CdSe量子點(diǎn)的制備：將0.5709g的CdCl₂·2.5H₂O加入100mL的三口燒瓶中，50.0mL的去離子水溶解，通氮?dú)馀懦龆嘤嗟难鯕?，移?00μL的巰基乙酸加到三口燒瓶中，用1M的NaOH調(diào)pH至10-11，溶液變得澄清透明，然后把制得的NaHSe溶液迅速加入到三口燒瓶中，加熱沸騰30-40min得淡黃色澄清溶液。

步驟3.CdSe@ZnS量子點(diǎn)的制備：將制得的CdSe量子點(diǎn)溶液在水浴中保持45℃，分別在5mL的去離子水中溶解0.21gNaS·9H₂O和0.25gZnSO₄，然后將兩溶液交替加入到CdSe量子點(diǎn)中，反應(yīng)30min，冷卻至室溫，即得到CdSe@ZnS量子點(diǎn)。所得量子點(diǎn)于棕色瓶中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

步驟4.CdSe/ZnS量子點(diǎn)-發(fā)夾DNA信號(hào)探針的組裝(溶液b)：按照使用說明，將帶有氨基的發(fā)夾DNAH1和H2溶解，再稀釋至濃度為1.0×10^-5M，以備實(shí)驗(yàn)使用。取100μL的CdSe@ZnS-COOH的量子點(diǎn)加入到1.5mL的離心管中，加入10μL的0.1mol/L的EDC和10μL的0.025mol/L的NHS溶液，室溫下活化反應(yīng)30min?；罨箅x心管中加入100μL的H1和H2，室溫下反應(yīng)16h后10000rpm下離心重新分散至100μL溶液，記為溶液b，保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明的目的之三是提供一種基于CdSe/ZnS量子點(diǎn)納米簇信號(hào)探針的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，以及采用該生物傳感器檢測(cè)癌細(xì)胞的分析方法。它由下列步驟組成：

步驟1.納米金-DNA引發(fā)鏈的組裝(溶液a)：取1mL的金膠溶液，按一定的比例加入P1和S1，在37℃下震蕩溫育16h，反應(yīng)完全后在10000rpm下離心30min后重新分散至100μL，記為溶液a，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

步驟2.將帶有適體DNA的電極浸入到溶液a中，用鋁箔紙封好后，在37℃的條件下震蕩溫育1～2h后用pH＝7.4的PBS緩沖溶液沖洗未反應(yīng)的溶液，然后將此標(biāo)記的電極浸入到溶液b中，同樣用鋁箔紙封好，在37℃的條件下震蕩溫育1～2h，取回電極用pH＝7.4的PBS緩沖溶液沖洗未反應(yīng)的溶液，制成檢測(cè)細(xì)胞的ECL的生物傳感器。

步驟3.癌細(xì)胞的電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)。將ECL傳感器分別與100μL含有不同濃度(例如1000個(gè)細(xì)胞每毫升)細(xì)胞的PBS溶液震蕩溫浴45～60分鐘。

將步驟3處理后的基于CdSe/ZnS量子點(diǎn)納米簇的電化學(xué)發(fā)光傳感器清洗，在含有0.05M K₂S₂O₈和0.1M KCl的0.1M PBS(pH 7.4)緩沖液中，進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光的測(cè)試，發(fā)光強(qiáng)度與待測(cè)樣品(癌細(xì)胞)的濃度成線性關(guān)系。

所述的電化學(xué)發(fā)光測(cè)試是以修飾好的金電極(基于CdSe/ZnS量子點(diǎn)納米簇的電化學(xué)發(fā)光傳感器)為工作電極、Pt電極為對(duì)電極、甘汞電極為參比電極的三電極體系，用MPI-A型電致化學(xué)發(fā)光儀，在0到-1.5V進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，光電倍增管高壓設(shè)為500～700V。

本發(fā)明利用了磁性納米金棒良好的磁性、導(dǎo)電性以及CdSe/ZnS量子點(diǎn)具有極強(qiáng)的發(fā)光強(qiáng)度等特點(diǎn)，制備了基于CdSe/ZnS量子點(diǎn)納米簇ECL探針及雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大技術(shù)相結(jié)合的電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)癌細(xì)胞的高靈敏、高選擇性檢測(cè)。該項(xiàng)研究對(duì)癌細(xì)胞的早期臨床檢測(cè)具有很好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，主要優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明制備的磁性納米金棒作為修飾電極具有很好的性能，增加了適體DNA在電極上的附著量以及附著的穩(wěn)定性，提高了檢測(cè)的靈敏度；本發(fā)明制備的新型的CdSe/ZnS量子點(diǎn)納米簇ECL探針具有極強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，研制了一種高靈敏的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)癌細(xì)胞高選擇性的ECL檢測(cè)。本發(fā)明將納米金放大效應(yīng)與雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大技術(shù)相結(jié)合，大量的CdSe/ZnS量子點(diǎn)組裝到納米簇上，作為ECL探針，極大地放大了ECL信號(hào)，成功對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行了高靈敏、高選擇性的檢測(cè)，檢測(cè)限為23個(gè)細(xì)胞/100μL。

本發(fā)明的電化學(xué)發(fā)光傳感器表現(xiàn)出了優(yōu)良的準(zhǔn)確性、高靈敏性，穩(wěn)定性與重現(xiàn)性，分析檢測(cè)迅速、方便，該方法在癌細(xì)胞的早期臨床分析中具有巨大的應(yīng)用潛力，可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

附圖說明：

圖1(A)CdSe-ZnS量子點(diǎn)的透射電鏡圖，(B)CdSe-ZnS量子點(diǎn)的熒光光譜圖。

圖2基于CdSe/ZnS量子點(diǎn)納米簇信號(hào)探針電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)癌細(xì)胞的原理圖。

圖3(A)純納米金，(B)基于納米金表面雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)形成的量子點(diǎn)納米簇的原子力顯微鏡圖。

圖4(A)磁性納米金棒修飾到電極上，(B)納米金探針組裝到電極上的掃描電鏡圖。

圖5該傳感器對(duì)應(yīng)不同濃度目標(biāo)細(xì)胞的ECL響應(yīng)信號(hào)，細(xì)胞濃度為：個(gè)/毫升：(a)0；(b)500；(c)1000；(d)2000；(e)4000；(f)6000；(g)8000；(h)15000。插圖A為ECL的信號(hào)變化ΔI與細(xì)胞濃度的關(guān)系，細(xì)胞的濃度為500～20000個(gè)/毫升。

圖6(A)該傳感器檢測(cè)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線(500～10000個(gè)mL^-1)；(B)該傳感器檢測(cè)細(xì)胞的選擇性：a)為細(xì)胞媒介中純的靶細(xì)胞b)靶細(xì)胞和干擾細(xì)胞加入到細(xì)胞媒介中的ECL選擇性柱形圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1.電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備及其對(duì)癌細(xì)胞的檢測(cè)

首先將磁性金電極依次使用1.0μm、0.3μm和0.05μm的α-Al₂O₃拋光粉拋光，用二次蒸餾水超聲洗滌后自然晾干，將8μL的磁性納米金棒溶液滴到電極的表面并自然晾干。然后將10μL的適體DNA(C1)滴到電極表面，溫浴反應(yīng)10h。

將上述帶有適體的電極洗凈后浸入到納米金-DNA引發(fā)鏈(溶液a)中，在37℃的條件下震蕩溫育2h，清洗后再將電極浸入到CdSe/ZnS量子點(diǎn)-發(fā)夾DNA信號(hào)探針(溶液b)中，在37℃的條件下震蕩溫育2h，制成檢測(cè)細(xì)胞的ECL的生物傳感器。

將ECL傳感器分別與100μL含有不同濃度(例如：1000個(gè)細(xì)胞/毫升)細(xì)胞的PBS溶液在37℃下震蕩溫浴60分鐘，適體與細(xì)胞反應(yīng)，清洗后的電極可用于電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)

實(shí)施例2.電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備及其對(duì)癌細(xì)胞的檢測(cè)

“將10μL的適體DNA(C1)滴到電極表面，溫浴反應(yīng)10h”改為”將10μL的適體DNA(C1)滴到電極表面，溫浴反應(yīng)12h”。制備的其他條件同實(shí)施例1，得到形貌與性質(zhì)類似于實(shí)施例1的生物傳感器。對(duì)癌細(xì)胞檢測(cè)的結(jié)果同實(shí)施例1。

實(shí)施例3.電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備及其對(duì)癌細(xì)胞的檢測(cè)

“將ECL傳感器分別與100μL含有不同濃度細(xì)胞的PBS溶液在37℃下震蕩溫浴60分鐘”改為“將ECL傳感器分別與100μL含有不同濃度細(xì)胞的PBS溶液在37℃下震蕩溫浴50分鐘”。制備的其他條件同實(shí)施例1，得到形貌與性質(zhì)類似于實(shí)施例1的生物傳感器。對(duì)癌細(xì)胞檢測(cè)的結(jié)果同實(shí)施例1。

實(shí)施例4.電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備及其對(duì)癌細(xì)胞的檢測(cè)

“將電極浸入到CdSe/ZnS量子點(diǎn)-發(fā)夾DNA信號(hào)探針(溶液b)中，在37℃的條件下震蕩溫育2h”改為“將電極浸入到CdSe/ZnS量子點(diǎn)-發(fā)夾DNA信號(hào)探針(溶液b)中，在37℃的條件下震蕩溫育1h”，制備的其他條件同實(shí)施例1，得到形貌與性質(zhì)類似于實(shí)施例1的生物傳感器。對(duì)癌細(xì)胞檢測(cè)的結(jié)果同實(shí)施例1。

實(shí)施例5.電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備及其對(duì)癌細(xì)胞的檢測(cè)

“將上述帶有適體的電極洗凈后浸入到納米金-DNA引發(fā)鏈(溶液a)中，在37℃的條件下震蕩溫育2h”改為“將上述帶有適體的電極洗凈后浸入到納米金-DNA引發(fā)鏈(溶液a)中，在37℃的條件下震蕩溫育1h”，制備的其他條件同實(shí)施例1，得到形貌與性質(zhì)類似于實(shí)施例1的生物傳感器。對(duì)癌細(xì)胞檢測(cè)的結(jié)果同實(shí)施例1。