本發(fā)明涉及一種肺癌篩查試劑盒。
背景技術(shù)：
：肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，目前發(fā)病率居世界首位，嚴(yán)重威脅著人類健康和生命。肺癌的病因復(fù)雜，一般認(rèn)為影響因素包括：①吸煙；②環(huán)境污染：如霧霾、室內(nèi)裝修；③不良生活方式：如飲食習(xí)慣差、生活壓力大；④慢性肺部疾?。喝绶谓Y(jié)核、塵肺，矽肺、慢性支氣管炎；⑤人體內(nèi)在因素：如家族遺傳、免疫機(jī)能降低、內(nèi)分泌功能失調(diào)等。同時，肺癌是一種善于隱匿的疾病，經(jīng)常在疾病發(fā)展到晚期才表現(xiàn)出臨床癥狀，70～80％的肺癌患者在診斷出患有肺癌癥狀時已是中、晚期，癌細(xì)胞已經(jīng)擴(kuò)散，錯過了最佳治愈時機(jī)，五年生存率低。對于早期的肺癌患者，經(jīng)過及時治療可大大提高患者的5年及以上生存率和生存質(zhì)量。因此肺癌的早期診斷和進(jìn)行有效的篩查至關(guān)重要。肺癌的篩查，是指對那些沒有肺癌相關(guān)癥狀的人群進(jìn)行常規(guī)體檢，在出現(xiàn)癥狀前及時發(fā)現(xiàn)肺癌。如果可以找到肺癌分子標(biāo)志物，用于提示臨床醫(yī)生早期對患者采取相關(guān)的治療措施或者決策具有重要的意義。MUSK(Muscle-specifictyrosine-proteinkinasereceptor，MuSK)，中文名稱為肌肉特異性受體酪氨酸激酶，是受體酪氨酸激酶家族成員之一，主要在肌肉細(xì)胞表面表達(dá)，對肌肉細(xì)胞接頭處的發(fā)育成熟、神經(jīng)電生理信號的傳遞起重要作用。目前，未見MUSK在肺癌中表達(dá)情況的報道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明人對肺癌進(jìn)行了詳細(xì)研究，發(fā)現(xiàn)了非磷酸化MUSK蛋白(non-phosphorylatedMUSK)可以作為其分子標(biāo)志物。其中，非磷酸化MUSK在肺組織中的表達(dá)水平與肺癌呈正相關(guān)。因此，通過檢測肺組織中非磷酸化MUSK的表達(dá)水平，可以預(yù)測待檢者患肺癌的風(fēng)險。據(jù)此，本發(fā)明提供了一種肺癌篩查試劑盒，以及檢測非磷酸化MUSK蛋白的表達(dá)水平的試劑在制備肺癌篩查試劑中的用途。本發(fā)明的肺癌篩查試劑盒，它包括任選的用于檢測非磷酸化MUSK蛋白表達(dá)水平的試劑。其中，所述試劑是用于檢測肺組織中非磷酸化MUSK蛋白表達(dá)水平的試劑。其中，所述檢測非磷酸化MUSK蛋白表達(dá)水平的試劑為免疫組化檢測方法用試劑。其中，所述檢測非磷酸化MUSK蛋白表達(dá)水平的試劑為WesternBlot或ELISA檢測方法用試劑。本發(fā)明還提供了檢測非磷酸化MUSK蛋白表達(dá)水平的試劑在制備肺癌篩查用試劑中的用途。其中，所述試劑是用于檢測肺組織中非磷酸化MUSK蛋白表達(dá)水平的試劑。其中，所述檢測非磷酸化MUSK蛋白表達(dá)水平的試劑為免疫組化檢測方法用試劑。其中，所述檢測非磷酸化MUSK蛋白表達(dá)水平的試劑為WesternBlot或ELISA檢測方法用試劑。本發(fā)明試劑盒通過檢測肺異常者的肺部異常部位與正常部位的非磷酸化MUSK表達(dá)水平，可以判斷肺異常者的非磷酸化MUSK表達(dá)水平差異，進(jìn)而判斷待檢者患肺癌的風(fēng)險：若非磷酸化MUSK的表達(dá)水平高，則患肺癌的風(fēng)險高，若非磷酸化MUSK的表達(dá)水平低，則患肺癌的風(fēng)險低，可用于臨床肺癌的輔助診斷，臨床應(yīng)用前景良好。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。具體實(shí)施方式實(shí)施例1非磷酸化MUSK表達(dá)水平與肺癌的關(guān)系一、實(shí)驗(yàn)方法1、臨床資料選取肺癌患者石蠟切片20例，遠(yuǎn)端對照20例(指肺癌患者的遠(yuǎn)端正常肺組織石蠟切片，距離癌組織5cm)，基本信息見表1。表1臨床基本信息*注：其他包括大細(xì)胞癌、腺鱗癌、小細(xì)胞癌。2、非磷酸化MUSK表達(dá)水平的檢測對肺癌患者石蠟切片、遠(yuǎn)端組織對照石蠟切片，進(jìn)行以MUSK為指標(biāo)的免疫組化(IHC)。MUSK抗體：購自AffinityBiosciences，貨號DF7040；EnVisionTMHRP二抗、抗體稀釋液、DAB顯色劑、抗原修復(fù)液、WashBuffer、免疫組化筆：均購自丹麥Dako公司。按照如下方法檢測非磷酸化MUSK的表達(dá)水平：(1)封閉過氧化物酶：取石蠟切片進(jìn)行脫蠟，脫蠟至水化(脫蠟過程如下：二甲苯Ⅰ10min→二甲苯Ⅱ10min→無水乙醇5min→95％乙醇5min→85％乙醇5min→75％乙醇5min)后，用3％H2O2溶液于暗處封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育15min；(2)蒸餾水漂洗：切片置于蒸餾水中，搖床上洗5min/次，共三次；(3)抗原修復(fù)：加入pH8.0的Tris-EDTA或pH6.0的檸檬酸鈉溶液，在98℃水浴鍋中水浴35min，進(jìn)行抗原修復(fù)；(4)蒸餾水漂洗：取出抗原修復(fù)盒，自然冷卻至室溫后，用蒸餾水洗三遍，再用WashBuffer潤洗一次；(5)孵育一抗：用免疫組化筆將組織圈住，在圈內(nèi)滴加MUSK抗體稀釋液(為MUSK抗體與抗體稀釋液混合配制，二者比例為MUSK/抗體稀釋液＝1/150)，4℃孵育過夜；(6)蒸餾水漂洗：用蒸餾水洗三遍，WashBuffer潤洗一次；(7)滴加二抗：滴加DakoHRP標(biāo)記的二抗工作液(即二抗原液)，室溫孵育60min；(8)蒸餾水漂洗：蒸餾水洗3次，每次5min；(9)DAB顯色：滴加顯色底物DAB，在顯微鏡下觀察顯色情況，于蒸餾水中終止反應(yīng)；(10)蘇木素復(fù)染：將切片放入蘇木素染液中染色2min，1％鹽酸酒精分化后，流水沖洗10min；(11)脫水透明：經(jīng)80％、95％、100％梯度酒精脫水、二甲苯透明，于通風(fēng)廚中干燥；(12)封片：用中性快干膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察，DPController圖像采集系統(tǒng)采圖。采圖后，根據(jù)肺癌患者和遠(yuǎn)端組織的腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽性面積給予免疫組化評分。3、免疫組化評分標(biāo)準(zhǔn)腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度*腫瘤細(xì)胞陽性面積＝0-9分，結(jié)果統(tǒng)計：陰性：0分；低度陽性：1-3分；高度陽性>3分。其中，腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度、陽性面積的評分@如下：@注：由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生獨(dú)立對免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行評分4、結(jié)果分析采用SPSS17.0肺癌組織組和遠(yuǎn)端組織對照組進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果肺癌組織與遠(yuǎn)端組織對照中非磷酸化MUSK的表達(dá)水平檢測結(jié)果見表2。表2非磷酸化MUSK的表達(dá)水平由表2可見，遠(yuǎn)端正常組織中非磷酸化MUSK的陽性表達(dá)率為10％，高度陽性表達(dá)率為0％；肺癌組織中的非磷酸化MUSK陽性表達(dá)率為95％，高度陽性表達(dá)率為85％；非磷酸化MUSK在肺癌組織中顯著升高，與遠(yuǎn)端正常組織相比，非磷酸化MUSK表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。由以上結(jié)果可以看出，與癌旁正常肺組織相比，肺癌組織的非磷酸化MUSK表達(dá)水平顯著升高(P<0.0001)，說明肺癌與非磷酸化MUSK表達(dá)水平呈正相關(guān)，非磷酸化MUSK的高表達(dá)會顯著提高患肺癌的可能性。由于癌旁正常肺組織的非磷酸化MUSK水平可反映正常人肺組織的非磷酸化MUSK水平，因此，可以通過檢測待檢者的非磷酸化MUSK的表達(dá)水平，將肺癌的易感人群篩查出來。實(shí)施例2本發(fā)明檢測非磷酸化MUSK表達(dá)水平的試劑盒組成及其使用方法一、免疫組化檢測試劑盒的組成檢測試劑盒(50人份)：組分體積非磷酸化MUSK抗體50μlEnVisionTMHRP二抗5ml抗體稀釋液5mlDAB顯色劑5ml抗原修復(fù)液1000mlWashBuffer*1000ml免疫組化筆1支注：本試劑盒按每張切片滴加各類實(shí)驗(yàn)試劑為100μl計，具體用量可根據(jù)組織大小適當(dāng)增減。二、試劑盒的使用方法將待檢樣本肺組織，制備石蠟切片，作為檢測標(biāo)本，按照如下方法檢測非磷酸化MUSK的表達(dá)水平：(1)封閉過氧化物酶：取石蠟切片進(jìn)行脫蠟，脫蠟至水化(脫蠟過程如下：二甲苯Ⅰ10min→二甲苯Ⅱ10min→無水乙醇5min→95％乙醇5min→85％乙醇5min→75％乙醇5min)后，用3％H2O2溶液于暗處封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育15min；(2)蒸餾水漂洗：切片置于蒸餾水中，搖床上洗5min/次，共三次；(3)抗原修復(fù)：加入pH8.0的Tris-EDTA或pH6.0的檸檬酸鈉溶液，在98℃水浴鍋中水浴35min，進(jìn)行抗原修復(fù)；(4)蒸餾水漂洗：取出抗原修復(fù)盒，自然冷卻至室溫后，用蒸餾水洗三遍，再用WashBuffer潤洗一次；(5)孵育一抗：用免疫組化筆將組織圈住，在圈內(nèi)滴加MUSK抗體稀釋液(為MUSK抗體與抗體稀釋液混合配制，二者比例為MUSK/抗體稀釋液＝1/150)，4℃孵育過夜；(6)蒸餾水漂洗：用蒸餾水洗三遍，WashBuffer潤洗一次；(7)滴加二抗：滴加DakoHRP標(biāo)記的二抗工作液(即二抗原液)，室溫孵育60min；(8)蒸餾水漂洗：蒸餾水洗3次，每次5min；(9)DAB顯色：滴加顯色底物DAB，在顯微鏡下觀察顯色情況，于蒸餾水中終止反應(yīng)；(10)蘇木素復(fù)染：將切片放入蘇木素染液中染色2min，1％鹽酸酒精分化后，流水沖洗10min；(11)脫水透明：經(jīng)80％、95％、100％梯度酒精脫水、二甲苯透明，于通風(fēng)廚中干燥；(12)封片：用中性快干膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察，DPController圖像采集系統(tǒng)采圖。采圖后，根據(jù)肺癌患者和遠(yuǎn)端組織的腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽性面積給予免疫組化評分。對肺部異常者，可分別取異常部位、正常部位組織，比較非磷酸化MUSK表達(dá)水平，進(jìn)而評價其患肺癌的可能性，作為臨床肺癌的輔助診斷手段。綜上，本發(fā)明試劑盒通過檢測非磷酸化MUSK的表達(dá)水平，可以判斷肺異常者的肺部異常部位與正常部位的非磷酸化MUSK表達(dá)水平差異，進(jìn)而篩查待檢者患肺癌的風(fēng)險：若非磷酸化MUSK的表達(dá)水平高，則患肺癌的風(fēng)險高，若非磷酸化MUSK的表達(dá)水平低，則患肺癌的風(fēng)險低，可用于臨床肺癌的輔助診斷，為患者采取相關(guān)的治療措施或者決策提供有效的依據(jù)，臨床應(yīng)用前景良好。當(dāng)前第1頁1 2 3