本發(fā)明屬于微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種金黃色葡萄球菌的檢測試劑盒及其使用方法。

背景技術(shù)：

金黃色葡萄球菌是人類的一種重要病原菌，是引起化膿性感染最常見的病原菌，包括局部化膿性感染、系統(tǒng)性感染和全身性感染。因此，建立快速、方便、靈敏的金黃色葡萄球菌檢測方法，對于人體健康有著重要意義。

金黃色葡萄球菌的現(xiàn)有檢測方法中，最為成熟的是基于細(xì)菌培養(yǎng)模式的傳統(tǒng)方法，應(yīng)用最廣泛的方法是基于細(xì)菌核酸的PCR法?；诩?xì)菌培養(yǎng)模式的傳統(tǒng)方法雖然可靠性好、靈敏度高，卻耗時(shí)費(fèi)力，通常需要數(shù)天的時(shí)間才能得到檢測結(jié)果，同時(shí)需要熟練的專業(yè)人員和大量的實(shí)驗(yàn)器具。基于細(xì)菌核酸的PCR法雖然特異性高、可實(shí)現(xiàn)多組分檢測，但卻需要經(jīng)過提取核酸和合成特異性引物等復(fù)雜的過程。另外，用于檢測金黃色葡萄球菌的方法還有基于DNA探針的Southern印跡雜交技術(shù)和噻唑藍(lán)比色法等，這些方法雖然特異性強(qiáng)，但靈敏度卻非常低，不能實(shí)現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的高靈敏檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種金黃色葡萄球菌的熒光檢測試劑盒及其使用方法，可以快速、方便、特異、靈敏、穩(wěn)定、低價(jià)地檢測金黃色葡萄球菌。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

1．金黃色葡萄球菌的熒光檢測試劑盒，包括以下組分：金黃色葡萄球菌特異性噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠和異硫氰酸熒光素偶聯(lián)Magainin I。

Magainin I是非洲爪蛙皮膚顆粒腺中由23個(gè)氨基酸組成的短肽，對細(xì)菌和真菌有一定的抗菌活性，其作用于細(xì)菌表面并具有熱穩(wěn)定性、抗菌譜廣、易于合成、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

優(yōu)選的，所述金黃色葡萄球菌特異性噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠是將親和素磁珠與生物素修飾的金黃色葡萄球菌特異性噬菌體多肽反應(yīng)后，再用明膠封閉制得。

優(yōu)選的，所述生物素修飾的金黃色葡萄球菌特異性噬菌體多肽是在金黃色葡萄球菌ATCC25923特異性噬菌體多肽的碳端連接3個(gè)甘氨酸殘基后再修飾生物素。

優(yōu)選的，所述異硫氰酸熒光素偶聯(lián)Magainin I是在Magainin I的碳端修飾上異硫氰酸熒光素。

在上述技術(shù)方案中，根據(jù)要檢測的金黃色葡萄球菌的型別，選擇該型別金黃色葡萄球菌特異性的噬菌體多肽制備噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠，即可實(shí)現(xiàn)對該型別金黃色葡萄球菌的檢測。

作為一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案，所述金黃色葡萄球菌為金黃色葡萄球菌ATCC25923；所述金黃色葡萄球菌特異性噬菌體多肽為金黃色葡萄球菌ATCC25923特異性噬菌體多肽，其氨基酸序列為Val-Pro-His-Asn-Pro-Gly-Leu-Ile-Ser-Leu-Gln-Gly（SEQ ID No.1）。

進(jìn)一步，所述試劑盒中還包括以下組分：金黃色葡萄球菌ATCC25923菌懸液、反應(yīng)緩沖液和檢測緩沖液。

優(yōu)選的，所述金黃色葡萄球菌ATCC25923菌懸液由以下方法制得：取金黃色葡萄球菌ATCC25923單個(gè)菌落接種于LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)，離心去除上清液，細(xì)菌用水清洗后，用0.01 mol/L、pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液重懸并調(diào)整細(xì)菌濃度；所述反應(yīng)緩沖液為0.01 mol/L、pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液，所述檢測緩沖液為0.01 mol/L、pH8.0的磷酸鹽緩沖液。

．所述金黃色葡萄球菌的熒光檢測試劑盒的使用方法，是向待測樣品中加入金黃色葡萄球菌特異性噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠，孵育，磁性分離，得到金黃色葡萄球菌-噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠復(fù)合物，再加入異硫氰酸熒光素偶聯(lián)Magainin I，孵育，磁性分離，得到異硫氰酸熒光素偶聯(lián)Magainin I-金黃色葡萄球菌-噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠復(fù)合物，檢測并記錄熒光信號，根據(jù)熒光強(qiáng)度求得待測樣品中金黃色葡萄球菌的濃度。

作為一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案，金黃色葡萄球菌ATCC25923的熒光檢測試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

(a) 將金黃色葡萄球菌ATCC25923菌懸液用反應(yīng)緩沖液稀釋制成金黃色葡萄球菌ATCC25923工作菌液；向金黃色葡萄球菌ATCC25923工作菌液中加入金黃色葡萄球菌ATCC25923特異性噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠，孵育，磁性分離，得到金黃色葡萄球菌ATCC25923-噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠復(fù)合物，用反應(yīng)緩沖液洗滌后，再加入異硫氰酸熒光素偶聯(lián)Magainin I，孵育，磁性分離，得到異硫氰酸偶聯(lián)Magainin I-金黃色葡萄球菌ATCC25923-噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠復(fù)合物，用反應(yīng)緩沖液洗滌后，再加入檢測緩沖液，檢測并記錄熒光信號，以熒光強(qiáng)度對金黃色葡萄球菌ATCC25923濃度作圖，繪制工作曲線；

(b) 向待測樣品中加入金黃色葡萄球菌ATCC25923特異性噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠，孵育，磁性分離，得到金黃色葡萄球菌ATCC25923-噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠復(fù)合物，用反應(yīng)緩沖液洗滌后，再加異硫氰酸熒光素偶聯(lián)Magainin I，孵育，磁性分離，得到異硫氰酸熒光素偶聯(lián)Magainin I-金黃色葡萄球菌ATCC25923-噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠復(fù)合物，用反應(yīng)緩沖液洗滌后，再加入檢測緩沖液，檢測并記錄熒光信號，根據(jù)熒光強(qiáng)度和步驟(a)繪制的工作曲線求得待測樣品中金黃色葡萄球菌ATCC25923的濃度。

優(yōu)選的，金黃色葡萄球菌ATCC25923的熒光檢測試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

(a)將金黃色葡萄球菌ATCC25923菌懸液用反應(yīng)緩沖液稀釋制成濃度在10~10×10⁵CFU/mL范圍內(nèi)的金黃色葡萄球菌ATCC25923工作菌液；向1.0 mL金黃色葡萄球菌ATCC25923工作菌液中加入10μg金黃色葡萄球菌ATCC25923特異性噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠，37℃孵育45分鐘，磁性分離，得到金黃色葡萄球菌ATCC25923-噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠復(fù)合物，用反應(yīng)緩沖液洗滌后，再加入5μg/mL異硫氰酸熒光素偶聯(lián)Magainin I 1.0mL，37℃孵育45分鐘，磁性分離，得到異硫氰酸熒光素偶聯(lián)Magainin I-金黃色葡萄球菌ATCC25923-噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠復(fù)合物，用反應(yīng)緩沖液洗滌后，再加入200μL 檢測緩沖液，檢測并記錄熒光信號，以熒光強(qiáng)度對金黃色葡萄球菌ATCC25923濃度作圖，繪制工作曲線；

(b) 向1.0 mL待測樣品中加入10μg金黃色葡萄球菌ATCC25923特異性噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠，37℃孵育45分鐘，磁性分離，得到金黃色葡萄球菌ATCC25923-噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠復(fù)合物，用反應(yīng)緩沖液洗滌后，再加入5μg/mL異硫氰酸熒光素偶聯(lián)Magainin I 1.0mL，37℃孵育45分鐘，磁性分離，得到異硫氰酸熒光素偶聯(lián)Magainin I-金黃色葡萄球菌ATCC25923-噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠復(fù)合物，用反應(yīng)緩沖液洗滌后，再加入200μL 檢測緩沖液，檢測并記錄熒光信號，根據(jù)熒光強(qiáng)度和步驟(a)繪制的工作曲線求得待測樣品中金黃色葡萄球菌ATCC25923的濃度。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了一種金黃色葡萄球菌的熒光檢測試劑盒，以金黃色葡萄球菌特異性噬菌體多肽和廣譜抗菌肽Magainin I作為細(xì)菌識別試劑，結(jié)合磁珠快速富集技術(shù)和高靈敏的熒光檢測方法，針對金黃色葡萄球菌全細(xì)胞進(jìn)行檢測，具有快速、方便、特異、靈敏、穩(wěn)定、低價(jià)的優(yōu)點(diǎn)，有望應(yīng)用于金黃色葡萄球菌的現(xiàn)場檢測和快速篩查，能夠?yàn)榕R床診斷、食品安全和環(huán)境檢測等領(lǐng)域檢測金黃色葡萄球菌提供有力的技術(shù)支持平臺。

附圖說明

圖1為金黃色葡萄球菌ATCC25923的熒光檢測試劑盒的使用流程示意圖。

圖2為采用金黃色葡萄球菌ATCC25923的熒光檢測試劑盒檢測金黃色葡萄球菌ATCC25923的工作曲線。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1 金黃色葡萄球菌ATCC25923的熒光檢測試劑盒的制備

本實(shí)施例的金黃色葡萄球菌ATCC25923的熒光檢測試劑盒，包括以下組分：金黃色葡萄球菌ATCC25923特異性噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠、異硫氰酸熒光素偶聯(lián)Magainin I、金黃色葡萄球菌ATCC25923菌懸液、反應(yīng)緩沖液和檢測緩沖液。

所述金黃色葡萄球菌ATCC25923特異性噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠的制備方法為：取親和素磁珠2mg與生物素修飾的金黃色葡萄球菌ATCC25923特異性噬菌體多肽30μg混合，反應(yīng)，磁性分離，用0.01 mol/L、pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液洗滌，再加入10μg/mL明膠水溶液1.0mL封閉，磁性分離，用0.01 mol/L、pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液洗滌，即得。所述金黃色葡萄球菌ATCC25923特異性噬菌體多肽的氨基酸序列為Val-Pro-His-Asn-Pro-Gly-Leu-Ile-Ser-Leu- Gln-Gly（SEQ ID No.1）。所述生物素修飾的金黃色葡萄球菌ATCC25923特異性噬菌體多肽是在金黃色葡萄球菌ATCC25923特異性噬菌體多肽的碳端連接3個(gè)甘氨酸殘基后再修飾生物素。

所述異硫氰酸熒光素偶聯(lián)Magainin I是在Magainin I的碳端修飾上異硫氰酸熒光素。

所述金黃色葡萄球菌ATCC25923菌懸液的制備方法為：取金黃色葡萄球菌ATCC25923（從廣東省微生物菌種保藏中心獲得）單個(gè)菌落接種于LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，離心去除上清液，用無菌水清洗細(xì)菌2次后，用0.01 mol/L、pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)菌并調(diào)整細(xì)菌濃度至1.0×10⁵ CFU/mL。

所述反應(yīng)緩沖液為0.01 mol/L、pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液。

所述檢測緩沖液為0.01 mol/L、pH8.0的磷酸鹽緩沖液。

實(shí)施例2 金黃色葡萄球菌ATCC25923的熒光檢測試劑盒的使用方法

如圖1所示，實(shí)施例1制備的金黃色葡萄球菌ATCC25923的熒光檢測試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

(a) 將金黃色葡萄球菌ATCC25923菌懸液用反應(yīng)緩沖液稀釋制成濃度在10~10×10⁵CFU/mL范圍內(nèi)的金黃色葡萄球菌ATCC25923工作菌液；向1.0 mL金黃色葡萄球菌ATCC25923工作菌液中加入10μg金黃色葡萄球菌ATCC25923特異性噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠，37℃孵育45分鐘，磁性分離，獲得金黃色葡萄球菌ATCC25923-噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠復(fù)合物，用反應(yīng)緩沖液洗滌，再加入5μg/mL異硫氰酸熒光素偶聯(lián)Magainin I 1.0mL，37℃孵育45分鐘，磁性分離，得到異硫氰酸熒光素偶聯(lián)Magainin I-金黃色葡萄球菌ATCC25923-噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠復(fù)合物，用反應(yīng)緩沖液洗滌，再加入200μL 檢測緩沖液，檢測并記錄熒光信號（激發(fā)光波長488nm，發(fā)射光波長525nm），以熒光強(qiáng)度對金黃色葡萄球菌ATCC25923濃度作圖，繪制工作曲線；

(b) 向1.0 mL待測樣品中加入10μg金黃色葡萄球菌ATCC25923特異性噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠，37℃孵育45分鐘，磁性分離，得到金黃色葡萄球菌ATCC25923-噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠復(fù)合物，用反應(yīng)緩沖液洗滌，再加入5μg/mL異硫氰酸熒光素偶聯(lián)Magainin I 1.0mL，37℃孵育45分鐘，磁性分離，得到異硫氰酸熒光素偶聯(lián)Magainin I-金黃色葡萄球菌ATCC25923-噬菌體多肽偶聯(lián)磁珠復(fù)合物，用反應(yīng)緩沖液洗滌，再加入200μL 檢測緩沖液，檢測并記錄熒光信號，根據(jù)熒光強(qiáng)度和步驟(a)繪制的工作曲線求得待測樣品中金黃色葡萄球菌ATCC25923的濃度。

上述步驟(a)中，金黃色葡萄球菌ATCC25923工作菌液的濃度分別為10、1.0×10²、1.0×10³、1.0×10⁴和1.0×10⁵ CFU/mL，以熒光強(qiáng)度對金黃色葡萄球菌ATCC25923濃度作圖，所得工作曲線如圖2所示。隨著金黃色葡萄球菌ATCC25923濃度的增加，熒光強(qiáng)度不斷增大，二者在10~1.0×10⁵ CFU/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R²=0.9995，檢測限（S/N=3）為12 CFU/mL，說明使用本發(fā)明的檢測試劑盒可以靈敏地檢測金黃色葡萄球菌ATCC25923。

上述步驟(a)中，在金黃色葡萄球菌ATCC25923工作菌液中分別加入6種模式菌（金黃色葡萄球菌CCTCC AB 91093、藤黃微球菌CCTCC AB 91100、表皮葡萄球菌GIM1.444、銅綠假單孢桿菌CCTCC AB 93078、大腸桿菌CCTCC AB 212355和鏈球菌ATCC35668），然后按上述同樣方法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，除了表皮葡萄球菌GIM1.444有微弱干擾外，其他5種模式菌對金黃色葡萄球菌ATCC25923的檢測均不構(gòu)成干擾，說明使用本發(fā)明的檢測試劑盒可以特異地檢測金黃色葡萄球菌ATCC25923。

上述步驟(b)中，分別以蘋果汁、湖水和健康人尿液作為待測樣品，將其高溫滅菌后，其中蘋果汁和湖水不稀釋，健康人尿液用去離子水稀釋十倍，向其中添加已知濃度的金黃色葡萄球菌ATCC25923菌懸液，然后按上述同樣方法進(jìn)行檢測。結(jié)果如表1所示，3種待測樣品中金黃色葡萄球菌ATCC25923的加標(biāo)回收率為81%~105%，RSD值不高于5.1%，說明使用本發(fā)明的檢測試劑盒可以準(zhǔn)確地檢測金黃色葡萄球菌ATCC25923。

最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。

<110> 西南大學(xué)

<120> 金黃色葡萄球菌的熒光檢測試劑盒及其使用方法

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 金黃色葡萄球菌ATCC25923特異性噬菌體多肽

<400> 1

Val Pro His Asn Pro Gly Leu Ile Ser Leu Gln Gly

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