本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)和獸醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及產(chǎn)腸毒素大腸桿菌ETEC F4菌毛直接受體蛋白豬氨肽酶N的驗(yàn)證及其功能結(jié)合域的確定。更具體地說，本發(fā)明提供能夠識(shí)別ETEC F4三種血清型主要功能性亞基FaeG的宿主受體蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。本發(fā)明中的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以用作區(qū)別和研究不同血清型ETEC F4感染的依據(jù)，以及用作以APN為靶標(biāo)篩選和研制F4受體模擬類似物和新型多肽疫苗的工具。

背景技術(shù)：

新生和斷奶仔豬腹瀉是全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展最為普遍的胃腸道疾病，主要與產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)F4(或K88)在仔豬腸道內(nèi)的黏附、定植和感染有關(guān)，該病原不僅能夠引發(fā)仔豬黃痢、白痢、水腫病和斷奶仔豬腹瀉等多種疾病，還易混合、并發(fā)和繼發(fā)多種疾病感染。ETEC F4病原菌有ab、ac、ad三種血清型變異株，其中以F4ac最為常見。這三種血清型F4大腸桿菌在腸道細(xì)胞黏附力、黏附素faeG基因和致病性上具有一定的差異。研究發(fā)現(xiàn)，ETEC F4能否特異性結(jié)合豬小腸黏膜上皮細(xì)胞，取決于豬小腸黏膜上有無相應(yīng)的受體，無F4受體的豬表現(xiàn)為抗性，不會(huì)感染F4大腸桿菌發(fā)病；而有受體的豬則表現(xiàn)為易感，在感染F4大腸桿菌后發(fā)病。

自1975年以來，有關(guān)F4菌毛受體的相關(guān)基因和蛋白陸續(xù)被報(bào)道：Gibbons等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)4ac受體由一對等位基因控制，符合孟德爾遺傳定律，即呈顯隱性遺傳模式，其中顯性基因S表現(xiàn)為有受體，隱性基因s表現(xiàn)為無受體。Edfors等將F4ac的受體基因準(zhǔn)確定位于豬13號(hào)染色體q41區(qū)域，與Tf基因座僅相差7.4厘米并與F4ab受體基因緊密連鎖(θ＝0.01，Z＝41.06)。等采用與Edfors定位F4ac受體基因所用的同一家系的豬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)將受體基因定位在SSC13q41的SW207、S0075和Sw225之間，并進(jìn)一步證實(shí)黏液素4(MUC4)基因內(nèi)含子7的一個(gè)多態(tài)性突變位點(diǎn)(SNP)與大腸桿菌F4ac的易感性呈現(xiàn)表型共分離。2009年1月，Andersson、和Vogeli等帶領(lǐng)各自團(tuán)隊(duì)聯(lián)合開展精細(xì)定位，將F4ac受體基因所在區(qū)域由原來的26Mb縮短至14Mb，即SSC13q41的Sw207-S0075區(qū)域，并提出該受體基因最有可能位于Sw207-MUC4區(qū)域的設(shè)想。因此，MUC4基因很可能是大腸桿菌F4ac黏附易感性的一個(gè)極其重要的功能位置候選基因。但是，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)黃路生研究組發(fā)現(xiàn)MUC4基因標(biāo)記在構(gòu)建的白色杜洛克×二花臉資源家系始祖動(dòng)物中沒有多態(tài)性，而F2家系個(gè)體中有著充分分離的F4ac黏附表型，這表明該SNP標(biāo)記只是與F4ac受體基因因果突變(causative mutation)呈一定連鎖不平衡的分子標(biāo)記，不能解釋所有群體的F4ac受體遺傳基礎(chǔ)。Goetstouwers等和Rasschaert等的研究也發(fā)現(xiàn)，MUC4的分型與豬F4ETEC黏附分型結(jié)果并不完全一致，并進(jìn)一步提出了存在其他受體基因或蛋白的假設(shè)。

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)張勤研究組以久仰香豬(抗性豬)、劍白香豬和長白豬為研究材料，采用差異顯示技術(shù)，通過對比分析抗性個(gè)體和易感個(gè)體的表達(dá)譜帶，篩選到了5條抗性相關(guān)特異性表達(dá)的EST。施啟順研究組則分析了沙子嶺豬和約克夏豬對ETEC F4三種抗原型的黏附差異，并對13號(hào)染色體與ETEC F4受體基因相連鎖的兩個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記S0223和S0068在沙子嶺豬和約克夏豬的遺傳差異性進(jìn)行了研究。黃路生研究組根據(jù)比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)分析結(jié)果，在ETEC F4ac受體基因所在的SSC13q41區(qū)域選擇了MUC4、MUC13、MUC20和TFRC 4個(gè)位置候選基因，并完成了對這些基因的染色體定位、多態(tài)位點(diǎn)鑒別及其與ETEC F4黏附表型的關(guān)聯(lián)性研究。

但是，選擇并鑒別真正的受體基因或候選蛋白仍然是研究的難點(diǎn)和關(guān)鍵，而對于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的受體基因和蛋白，也仍然缺乏直接有效的方法和證據(jù)來進(jìn)行鑒別。以MUC13和MUC20為例，學(xué)者們對于這兩種基因以及所表達(dá)的蛋白在F4ac受體表型分類中所發(fā)揮的作用有較大的分歧。Schroyen等研究發(fā)現(xiàn)，由于脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP2)的表達(dá)可以反映小腸黏膜上皮的狀態(tài)，而胰島調(diào)節(jié)蛋白(PAP)的表達(dá)則可以作為鑒定腸道炎癥的標(biāo)準(zhǔn)。利用這兩種蛋白對應(yīng)的基因IFABP和REG3A作為看家基因進(jìn)行熒光定量PCR，可以同時(shí)監(jiān)測腸道內(nèi)MUC13和MUC20蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，MUC13和MUC20兩種基因的表達(dá)在不同表型豬的個(gè)體之間沒有明顯差異，這說明MUC13和MUC20基因與豬F4ac的黏附表型沒有直接的關(guān)聯(lián)。Goetstouwer等也證實(shí)，MUC4和MUC13與ETEC F4ab/ac的易感性分型并不相關(guān)。而陳一杰等認(rèn)為，MUC13基因存在兩種拷貝類型：MUC13-A和MUC13-B，兩者在內(nèi)含子2上存在突變，而ETEC F4ac與豬小腸的黏附取決于MUC13-B的變異。Ren等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)4ac黏附表型與MUC13-A和MUC13-B都密切相關(guān)，其中MUC13-B含有一個(gè)獨(dú)特的O-糖基化位點(diǎn)可與細(xì)菌結(jié)合，而所有易感動(dòng)物至少攜帶一個(gè)MUC13-B等位基因。Zhou等研究表明豬的ITGB-5(integrin beta-5)和MUC13基因在保護(hù)腸道黏膜抵抗病原菌ETEC感染中具有重要的作用。

豬源氨肽酶N(APN)是一種含有Zn²⁺的膜結(jié)合型外肽酶，從屬于依賴鋅離子的金屬蛋白酶M1家族，分子量約為150KDa，廣泛存在于多種組織和細(xì)胞中，尤其在小腸黏膜上可高效表達(dá)。該蛋白已被證實(shí)是豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)等一系列冠狀病毒的受體蛋白。Goetstouwers等報(bào)道稱，豬源APN基因多態(tài)性和表達(dá)量與F4ETEC的易感性并不完全相關(guān)，并提出假設(shè)，F(xiàn)4與APN關(guān)聯(lián)的差異性依賴于碳水化合物結(jié)構(gòu)的修飾。Erickson和Melkebeek等的研究發(fā)現(xiàn)，APN與菌毛黏附的刷狀緣受體之間具有類似的特性，它們都有能夠構(gòu)成糖軛合物特殊的碳水化合物結(jié)構(gòu)。而利用某種特殊的神經(jīng)氨酸酶處理刷狀緣細(xì)胞后，受體的α^2,3,6,8唾液酸結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生了明顯的變化，表現(xiàn)為其與腸道內(nèi)F4ac菌毛的黏附明顯減少。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，N-糖苷酶F可以去除刷狀緣受體N端的糖鏈，從而減少受體與F4ac菌毛的黏附，而高甘露糖型的內(nèi)切糖苷酶H僅能去除非唾液酸化的N端糖鏈，其對受體與F4ac菌毛的黏附?jīng)]有影響。這一結(jié)果表明，APN與F4ac菌毛的黏附是通過唾液酸結(jié)合凝集素和APN的唾液酸殘基共同作用完成的。Melkebeek等研究證實(shí)，APN可以促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞內(nèi)吞F4ac菌毛，并且在沒有佐劑或輔助性物質(zhì)存在的情況下，也可以引起腸道強(qiáng)烈的黏膜免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生數(shù)量較多的IgA、IgG抗體，甚至連初次免疫后產(chǎn)生的IgM抗體也可檢測到。而即使是遠(yuǎn)低于可檢測水平的APN也可以促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的吞噬作用，并能夠誘導(dǎo)一定的免疫應(yīng)答。這一結(jié)果表明APN是疫苗抗原靶向穿越上皮屏障的作用靶標(biāo)。本發(fā)明旨在證明APN是ETEC F4菌毛的直接受體蛋白基礎(chǔ)上，通過確定APN與F4菌毛發(fā)生相互作用的功能結(jié)合域，為進(jìn)一步研究三種血清型F4的致病機(jī)制和防治措施提供工具，同時(shí)，為開發(fā)APN蛋白多肽制品和研制新型疫苗奠定基礎(chǔ)和平臺(tái)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本文申請建立在自主獲得APN基因、制備APN多克隆抗體和明晰ETEC F4菌毛特性的基礎(chǔ)上，利用蛋白-蛋白互相作用的原理，通過酵母雙雜交、Pull-down和Western blot等方法驗(yàn)證APN蛋白和F4菌毛主要亞單位FaeG蛋白間的相互作用，為APN蛋白與菌毛蛋白的直接互作提供證據(jù)，同時(shí)，探討并證明APN蛋白能夠影響F4大腸桿菌的體外黏附。更重要的是，在確定APN蛋白與F4菌毛蛋白互作的功能性結(jié)合域基礎(chǔ)上，分析比較不同血清型F4結(jié)合結(jié)構(gòu)域的差異，為進(jìn)一步研究F4三種血清型的致病機(jī)制提供佐證；同時(shí)，以獲得的APN結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)多肽序列為靶標(biāo)，進(jìn)行后續(xù)多肽制品和疫苗的開發(fā)。

ETEC F4受體基因可被精細(xì)定位于豬染色體SSC13q41區(qū)域，并與MUC4基因密切相關(guān)。根據(jù)MUC4基因內(nèi)含子7在限制性內(nèi)切酶Xba I作用下所表現(xiàn)出的多態(tài)性，可以在基因水平上將所檢測的豬分為易感型純合子SS，易感型雜合子SR和抵抗型RR。結(jié)合新鮮屠宰豬腸道刷狀緣細(xì)胞的黏附表型結(jié)果篩選目的樣本，選取基因分型結(jié)果和細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致的易感型豬進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。提取樣本豬空腸RNA后PCR獲得APN的全長基因，體外表達(dá)、純化APN蛋白，免疫小鼠并制備相應(yīng)的多克隆抗體。利用Red同源重組的方法構(gòu)建F4⁺ETECΔfaeG缺失株，同時(shí)構(gòu)建攜帶fae全操縱子基因表達(dá)的SE5000重組菌，檢測APN蛋白與F4三種血清型大腸桿菌不同菌株的凝集反應(yīng)；并利用細(xì)菌黏附、細(xì)菌黏附抑制(F4單克隆抗體或APN多克隆抗體預(yù)處理細(xì)胞)、酵母雙雜交、pull-down等實(shí)驗(yàn)證明APN能夠影響細(xì)菌和細(xì)胞的黏附，且FaeG亞單位蛋白與APN蛋白之間存在直接的蛋白互作。

在此基礎(chǔ)上，以未處理的IPEC-J2/Caco-2細(xì)胞作為對照，利用篩選獲得的APN過表達(dá)細(xì)胞系pEC129-APN IPEC-J2/Caco-2和APN沉默細(xì)胞系pcDNA^TM6.2-GW/miR-APN IPEC-J2/Caco-2進(jìn)行細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)，證明APN表達(dá)量的高低能夠直接影響細(xì)胞對細(xì)菌的黏附。

利用重疊多肽陣列技術(shù)高通量篩查APN與F4ab、F4ac、F4ad菌毛FaeG亞單位的互作位點(diǎn)，并結(jié)合Pull-down、Western-blot、ELISA等技術(shù)手段對多肽進(jìn)行驗(yàn)證，確定了APN蛋白與菌毛(FaeG蛋白)發(fā)生作用的功能性結(jié)合域和靶標(biāo)多肽序列，其中，主要識(shí)別F4ab的是TITTTAAITLDQSKPWNRY(SEQ ID NO.1)、ATFNITLIHPNNLTALSNM(SEQ ID NO.2)、VINRAQVIYDSFNLATAHM(SEQ ID NO.3)；主要識(shí)別F4ac的是ATFNITLIHPNNLTALSNM(SEQ ID NO.4)、WIVPISSIKNGVMQDHYWL(SEQ ID NO.5)、VINRAQVIYDSFNLATAHM(SEQ ID NO.6)、VLRGVGDSQVPEIDRT(SEQ ID NO.7)和GVTRRFSSEFELQQLE(SEQ ID NO.8)；主要識(shí)別F4ad的是TITTTAAITLDQSKPWNRY(SEQ ID NO.9)、ATFNITLIHPNNLTALSNM(SEQ ID NO.10)、VINRAQVIYDSFNLATAHM(SEQ ID NO.11)。

本發(fā)明公開了豬源氨肽酶N蛋白上序列如SEQ ID NO.1-3所示的多肽作為識(shí)別ETECF4ab的功能性結(jié)合域和靶標(biāo)的用途。

公開了豬源氨肽酶N蛋白上序列如SEQ ID NO.4-8所示的多肽作為識(shí)別ETECF4ac的功能性結(jié)合域和靶標(biāo)的用途。

公開了豬源氨肽酶N蛋白上序列如SEQ ID NO.9-11所示的多肽作為識(shí)別ETECF4ad的功能性結(jié)合域和靶標(biāo)的用途。

本發(fā)明還公開了豬氨肽酶N作為靶標(biāo)在篩選和研制產(chǎn)腸毒素大腸桿菌ETEC F4受體模擬類似物和多肽疫苗中的應(yīng)用。

本技術(shù)存在以下優(yōu)勢和特點(diǎn)：

1.本研究首次證明豬源氨肽酶N(APN)是大腸桿菌F4菌毛的直接受體蛋白：FaeG不僅是F4菌毛有效的黏附功能亞基，也是候選受體蛋白APN作用的靶點(diǎn)；APN-FaeG蛋白間存在直接的互作，且APN能夠影響F4大腸桿菌的黏附。

2.確定了APN與FaeG蛋白互作的功能結(jié)合域，為進(jìn)一步探討APN的作用機(jī)理和F4三種血清型的不同致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，考慮到配體-受體的相互作用是闡明疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵，通過病原菌和宿主受體特異性的相互作用來進(jìn)行疾病治療是一個(gè)很有前景的抗感染策略。因此，以APN蛋白作為靶標(biāo)開發(fā)F4受體模擬類似物，可以用來減少F4菌與宿主細(xì)胞的黏附和定植，預(yù)防ETEC F4的感染。

附圖說明

圖1：不同種類豬MUC4intron 7基因的酶切鑒定結(jié)果

M:100bp plusⅡDNA Marker；1-11為不同種類豬DNA樣品的酶切產(chǎn)物。

圖2：豬的ETEC F4黏附表型結(jié)果對比((a)抵抗型；(b)弱黏附型；(c)黏附型)。

圖3：不同種類大腸桿菌F4與IPEC-J2和Caco-2細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)對比。

圖4：不同血清型F4大腸桿菌與豬小腸刷狀緣細(xì)胞的黏附對比。

圖5：不同濃度F4單抗和APN多抗處理后的IPEC-J2、Caco-2細(xì)胞與F4⁺細(xì)菌的黏附實(shí)驗(yàn)。

圖6：酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證APN-FaeG相互作用

樣品1-3：F4ab FaeG-APN；樣品 4-6：F4ac FaeG-APN；7-9：F4ad FaeG-APN；

N＝陰性對照；P＝陽性對照。

圖7：Western-blot驗(yàn)證APN-FaeG蛋白的相互作用。

圖8：流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證不同細(xì)胞對ETEC F4細(xì)菌的內(nèi)化作用。

圖9：比較IPEC-2和Caco-2不同細(xì)胞系與ETEC F4細(xì)菌的黏附實(shí)驗(yàn)。

圖10：FaeG蛋白的多肽陣列膜雜交反應(yīng)結(jié)果。

圖11：APN蛋白的多肽陣列膜雜交反應(yīng)結(jié)果。

圖12：FaeG蛋白的結(jié)合位點(diǎn)分析。

圖13：APN蛋白的結(jié)合位點(diǎn)分析。

圖14：多肽應(yīng)用的共聚焦檢測，圖B中每組對應(yīng)的標(biāo)號(hào)從左至右為：4201、4301、4401、4501、5401、5501、5601、5701、5801、6001、8001、8101、9101、mix、APN。

圖15：多肽應(yīng)用的ELISA檢測。其中每組對應(yīng)的標(biāo)號(hào)從左至右為：4201、4301、4401、4501、5401、5501、5601、5701、5801、6001、8001、8101、9101、mix、APN。

具體實(shí)施方式

1、根據(jù)NCBI基因庫(GenBank)發(fā)表的豬MUC4基因參考序列(DQ848681)設(shè)計(jì)合成一對引物MUC4-N7Up 1/Lo 1(SEQ ID NO.12:5’-GTGCCTTGGGTGAGAGGTTA-3’,SEQ ID NO.13:5’-CACTCTGCCGTTCTCTTTCC-3’,367bp)，以送檢的新鮮屠宰豬的小腸提取的DNA樣品為模板，擴(kuò)增豬源MUC4內(nèi)含子7基因大小為367bp的片段，反應(yīng)條件為：95℃5min；95℃1min，63℃1min，72℃1min(30cycles)；72℃10min。純化PCR產(chǎn)物后進(jìn)行Xba I酶切鑒定，其中抵抗型個(gè)體所對應(yīng)的的基因片段不能被Xba I酶切，如圖1中泳道1-4，而易感型個(gè)體的基因片段則可以被酶切分為151bp和216bp兩個(gè)片段，如圖1泳道5-11。

2、刷狀緣大分子(BBV)細(xì)胞的制備：取新鮮屠宰豬的約20cm的小腸放置于PBS(0.05％疊氮鈉，0.2mM PMSF，pH 7.5)溶液中(冰上預(yù)冷)；用注射器沖洗腸道后，以載玻片刮取腸粘膜；用冰預(yù)冷的PBS洗滌刮取的腸粘膜，200g×10min，洗4次(直至腸細(xì)胞沉淀干凈)；將沉淀重懸于100mL 5mM NaHCO₃(0.05％疊氮鈉，0.2mM PMSF，pH 8.0-8.2)，使用研磨器上下研磨40次；450g離心12min；沉淀用45mL分離液(0.5mM EDTA，0.05％疊氮鈉，0.2mM PMSF)重懸，研磨10-20次；沉淀用30mL相同的buffer重懸，300g離心10min，至少洗滌4次；再用30mL Mg²⁺buffer(10mM MgCl₂，0.05％疊氮鈉，0.2mM PMSF)重懸沉淀，研磨10-20次；沉淀加200mL Mg²⁺buffer重懸，4℃靜置30-60min；制作濾器：將羊毛酯(1g/10mL)放入10-30mL漏斗中，用buffer潤濕；將上清通過羊毛酯過濾(去除細(xì)胞核)；濾液使用450g離心12min；用20μL final buffer(含0.05％疊氮鈉)重懸沉淀，小樣分裝后儲(chǔ)存于-80℃。

取上述仔豬空腸BBV細(xì)胞懸液，加入等體積的F4菌液和1％D-甘露糖溶液，37℃孵育1h并輕輕搖動(dòng)；將混合液取出后500rpm離心5min，用PBR緩沖液重新懸浮，離心洗滌4次，再用1mL PBR緩沖液懸浮細(xì)胞團(tuán)塊，取50μL懸浮液滴于潔凈的玻片上，自然干燥，火焰固定，用美蘭染色3-5min，油鏡下觀察。判型標(biāo)準(zhǔn)：計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野中的20個(gè)或以上刷狀緣，并記下每一個(gè)刷狀緣結(jié)合的細(xì)菌個(gè)數(shù)，再對其判型。若10％以上刷狀緣至少有2個(gè)細(xì)菌粘附，則判為粘附型，如圖2(a)所示；若至少有兩個(gè)細(xì)菌粘附的細(xì)胞不到10％，但有1-2個(gè)細(xì)菌的粘附刷狀緣多于10％，則判定為弱粘附型，如圖2(b)所示，否則則為不粘附型，如圖2(c)所示。

3、F4菌毛蛋白的制備：配制MME培養(yǎng)液(MgSO4·7H₂O 1g、檸檬酸·H₂O 10g、K₂HPO₄·H₂O 65.5g、Na(NH₄)HPO₄ 11.47g，定容至500mL，加NaOH約250μL調(diào)至pH7.0)。高壓滅菌后，在加入菌液之前，還應(yīng)在每250mL已配制好的溶液中加入8mL維生素VB1(1mg/mL)、250μL VB5(5mg/mL)、2.5mL20％甘油，充分混勻。由于細(xì)菌在該培養(yǎng)液中生長速度較慢，因此可以適當(dāng)提高所加入的維生素和甘油的比例，促進(jìn)細(xì)菌進(jìn)一步增殖。取傳代后并維持在對數(shù)期生長的菌液4mL，加入混勻后的MME培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)72h。取出菌液后8000rpm離心20min，棄上清，保留沉淀；用10mL 0.5mM Tris-HCl+75mM NaCl混合液懸浮沉淀，8000rpm離心20min，棄上清，保留沉淀；加入20mL 0.5mM Tris-HCl，60℃水浴作用1h，8000rpm離心30min，取上清；滴加飽和(NH4)₂SO₄至終濃度為20％，4℃過夜；取出后10000rpm離心40min后棄去上清，用TBS懸浮沉淀，裝入處理好的透析袋中放入TBS緩沖液中透析過夜；PEG 2000濃縮后取出，-20℃保存。

4、細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)：調(diào)整所培養(yǎng)IPEC-J2、Caco-2細(xì)胞的狀態(tài)，傳代3-5次待其進(jìn)入對數(shù)生長期，完全消化后鋪96孔板；同時(shí)接種細(xì)菌于LB培養(yǎng)液中，次日將種子液1:100轉(zhuǎn)接于新鮮的LB培養(yǎng)液中；通過一次或二次轉(zhuǎn)接活化細(xì)菌，待其進(jìn)入對數(shù)期生長時(shí)(OD₆₀₀＝3-4)，吸取OD₆₀₀＝1時(shí)對應(yīng)體積的菌液，4500rpm離心10min；吸凈培養(yǎng)基，再用細(xì)胞培養(yǎng)液500μL充分懸浮，將對數(shù)期生長的細(xì)菌按100:1的比例(100μL)加入至96孔板中生長的細(xì)胞單層，在37℃，6％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中共孵育1h；然后用PBS將未與細(xì)胞黏附的細(xì)菌沖洗干凈；每孔加入200μL 0.5％TritonX-100溶液，37℃培養(yǎng)30min以裂解細(xì)胞；充分吹勻后吸出液體，并取300μL PBS充分沖洗培養(yǎng)孔，然后按1:10的比例進(jìn)行梯度稀釋，選取10^-3和10^-4稀釋度對應(yīng)的混合液涂布LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，次日進(jìn)行單菌落計(jì)數(shù)。同時(shí)，按照仔豬黏附分型實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行F4三種血清型大腸桿菌與BBV細(xì)胞的黏附實(shí)驗(yàn)，包括野生菌，ΔfaeG缺失株，以及體外表達(dá)fae操縱子的重組菌，具體見圖3、圖4。由圖中可知，體外表達(dá)fae操縱子的重組菌的黏附能力最強(qiáng)，ΔfaeG缺失株的黏附能力最弱。

調(diào)整所培養(yǎng)的IPEC-J2、Caco-2以及相應(yīng)的pcDNA^TM6.2-GW/miR-APN IPEC-J2/Caco-2和pEC129-APN IPEC-J2/Caco-2細(xì)胞的狀態(tài)，傳代3-5次待其進(jìn)入對數(shù)生長期，完全消化后鋪96孔板；按照前述方法進(jìn)行操作，最后選取10^-3和10^-4稀釋度對應(yīng)的混合液涂布LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，次日進(jìn)行單菌落計(jì)數(shù)，具體見圖9。由圖中可知，APN蛋白的表達(dá)量高低能夠顯著影響細(xì)胞黏附細(xì)菌的能力，且pEC129-APN IPEC-J2/Caco-2細(xì)胞的細(xì)菌黏附數(shù)最高，而pcDNA^TM6.2-GW/miR-APN IPEC-J2/Caco-2細(xì)胞的細(xì)菌黏附數(shù)最低。

細(xì)菌黏附抑制實(shí)驗(yàn)：用F4⁺單抗、不同稀釋度的APN多抗與96孔板上的細(xì)胞共孵育1h，然后再按照常規(guī)黏附實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，細(xì)菌計(jì)數(shù)的方法與黏附實(shí)驗(yàn)相同，具體見圖5。由圖中可知，F(xiàn)4單抗和APN多抗的處理均能顯著降低細(xì)胞對細(xì)菌的黏附能力。

5、酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證APN-FaeG相互作用：按照MATCHMAKER GAL4Two-Hybrid System 3User Manual(clontech)重組方法將構(gòu)建好的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-FaeG及待檢測質(zhì)粒pGADT7-APN共轉(zhuǎn)化酵母AH109菌株，菌液涂布于SD/-Trp/-Leu培養(yǎng)基，30℃暗培養(yǎng)3-5天，待平板上長出直徑2mm的酵母菌落，挑取單菌落溶于10μL 0.9％NaCl中，滴加在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+3mM 3’AT平板上培養(yǎng)3-5天，觀察生長狀況。將陽性克隆挑轉(zhuǎn)移至SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-gal平板上培養(yǎng)3-5天，拍照留存。由圖6的結(jié)果可知，F(xiàn)4ab對應(yīng)樣品1-3，F(xiàn)4ac對應(yīng)樣品4-6，F(xiàn)4ad對應(yīng)樣品7-9和陽性對照樣品P一樣均能夠在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-gal平板上生長，而陰性對照樣品N和空白對照樣品均無法正常生長。

按照Pierce^TM GST Protein Interaction Pull-Down Kit(Thermo)方法進(jìn)行操作：25℃條件下，0.1mM IPTG誘導(dǎo)構(gòu)建獲得的pGEX-6p-1-FaeG，待OD₆₀₀≥1.0時(shí)，取5mL菌液到收集管中，5000g離心5min，棄去上清；用1mL/5mL TBS緩沖液重懸沉淀，取1mL混懸液至指形管中，同上離心，棄去上清；再用預(yù)冷的200μL TBS重懸沉淀，添加適量的蛋白酶抑制劑；再加200μL Pull-down Lysis buffer至離心管中，混勻后冰上孵育30min，顛倒混勻后12,000g離心5min，吸取上清裂解液備用；同時(shí)按照相同的操作收集pET28a(+)-APN蛋白上清液備用；準(zhǔn)備1:1混勻的TBS和Pull-down Lysis buffer作為洗液，8mL/次；取50μL/支吸附用填充料填入吸附柱中，再加入400μL/支洗液，上下顛倒幾次，放回離心管中，1250g離心30-60s，重復(fù)洗5次；將帶有GST標(biāo)簽的FaeG蛋白上清加入吸附柱中，4℃輕柔振搖30min，再次轉(zhuǎn)入離心管，同上離心；加入400μL/支洗液，上下顛倒幾次，放回離心管中，1250g離心30-60s，重復(fù)洗5次；再加入800μL帶有His標(biāo)簽的APN蛋白，4℃輕柔振搖1-2h，再次轉(zhuǎn)入離心管，同上離心；加入400μL/支洗液，上下顛倒幾次，放回離心管中，1250g離心30-60s，重復(fù)洗5次，棄去液體；配制10mM谷胱甘肽洗脫緩沖液(3.1mg谷胱甘肽加入1mL TBS緩沖液中，調(diào)pH為8.0)；在吸附柱中加入250μL洗脫液，輕柔振搖5min，1250g離心30-60s收集液體。注意所有操作均在冰上進(jìn)行。將上步收集的液體經(jīng)15％SDS-PAGE電泳后，利用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至NC膜上，用含5％脫脂奶粉的PBST溶液4℃過夜封閉，用PBST洗滌3次，5min/次；再分別與鼠抗APN多克隆抗體(1:1000)和F4⁺單抗(1:1000)在4℃共孵育1-2h，同上洗滌后再和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗(1:5000)4℃共孵育1h，同上洗滌；取出后與ECL發(fā)光液共孵育3-5min，取出瀝干后，進(jìn)行曝光掃描，拍照保存，具體見圖7。由圖中可知，帶有GST標(biāo)簽的F4FaeG蛋白能夠與APN蛋白發(fā)生直接的作用。

6、流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證不同細(xì)胞對ETEC F4細(xì)菌的內(nèi)化作用：提前一天鋪布單層細(xì)胞，將熒光標(biāo)記后的細(xì)菌與細(xì)胞4℃共孵育1h左右，利用37℃預(yù)熱的PBS進(jìn)行洗滌，洗滌4次，除去未結(jié)合的細(xì)菌；再放入37℃培養(yǎng)箱中作用30min，使細(xì)菌胞吞進(jìn)入細(xì)胞，用3％的低聚甲醛固定后，收集細(xì)胞(106/mL)；加入PI熒光抗體至終濃度為50μg/mL，冰上避光孵育30min；用染色緩沖液(PBS 900mL，F(xiàn)BS 50mL(終濃度5％)，4％NaNO3 50mL(終濃度0.2％))沖洗2次去除未結(jié)合的抗體，300g離心5min，小心棄去上清；用100μL染色緩沖液重懸細(xì)胞，銅網(wǎng)過濾后4小時(shí)內(nèi)利用流式細(xì)胞儀分析染色結(jié)果，具體見圖8。由圖中可知，APN蛋白的表達(dá)量和細(xì)胞內(nèi)化細(xì)菌的能力呈現(xiàn)正相關(guān)，即pEC129-APN IPEC-J2細(xì)胞內(nèi)化細(xì)菌的能力最強(qiáng)，而pcDNA^TM6.2-GW/miR-APN IPEC-J2細(xì)胞內(nèi)化細(xì)菌的能力最弱。

7、FaeG蛋白和APN蛋白的功能結(jié)合位點(diǎn)分析：根據(jù)多肽陣列設(shè)計(jì)原理，選用F4三種血清型的FaeG蛋白序列和APN蛋白序列分別作為靶標(biāo)，以3個(gè)aa的步移，13個(gè)aa的多肽長度設(shè)計(jì)合成多肽陣列。以F4ab FaeG蛋白(長度為286aa)為例，陣列共計(jì)包含93個(gè)多肽點(diǎn)；取F4ac FaeG蛋白中aa變異區(qū)段設(shè)計(jì)陣列，可得56個(gè)多肽點(diǎn)；取F4ad FaeG蛋白中aa變異區(qū)段設(shè)計(jì)陣列，可得56個(gè)多肽點(diǎn)；因此，一個(gè)FaeG蛋白陣列共計(jì)205個(gè)多肽點(diǎn)。APN蛋白按照同樣的方法設(shè)計(jì)陣列，可得318個(gè)多肽點(diǎn)；分別合成至少三個(gè)陣列用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將干燥的多肽陣列膜從-20℃取出后，置于無水乙醇中震蕩洗滌3次，5min/次，使多肽陣列得以充分活化；將活化后的多肽陣列膜放入潔凈的平皿中，使用TBST溶液震蕩洗滌3次，10min/次；將平衡后的多肽陣列膜放入潔凈的平皿中，加入封閉液，室溫震蕩封閉4h后，使用TBST溶液震蕩洗滌3次，5min/次；用封閉液稀釋純化的誘餌蛋白溶液，獲得終濃度1μg/ml的誘餌蛋白反應(yīng)液，將多肽陣列膜與上述反應(yīng)液4℃震蕩孵育過夜或室溫震蕩孵育至少2h；使用TBST溶液震蕩洗滌3次，10min/次；再用封閉液稀釋一抗(針對誘餌蛋白的抗體)溶液，稀釋比例為1:500，與多肽陣列膜室溫共孵育2h；陰性對照中，多肽陣列膜與封閉液孵育2h；使用TBST溶液震蕩洗滌3次，15min/次；用封閉液稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，稀釋比例為1:5000-1:10000(可根據(jù)抗體說明書推薦使用稀釋度調(diào)整)，與多肽陣列膜室溫共孵育2h；使用TBST溶液震蕩洗滌3次，15min/次；棄去多肽陣列膜上多余的緩沖溶液，在膜上滴加ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液，反應(yīng)液完全覆蓋膜片表面后充分反應(yīng)2-5min，保持膜片濕潤；將膜片放入化學(xué)發(fā)光檢測儀中掃描膜片上發(fā)光斑點(diǎn)，掃描保存圖片。成像圖片使用Total Lab圖像分析軟件分析顯色點(diǎn)光密度值，使用軟件中“Spot Edge Average”算法，以每個(gè)顯色點(diǎn)周邊背景值為參照，計(jì)算每個(gè)顯色點(diǎn)的光密度值以辨別陽性顯色點(diǎn)。

制備pEC129-APN-IPEC-J2細(xì)胞爬片(細(xì)胞密度在60％-70％)，次日將細(xì)胞爬片分別與基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋的1mL多肽溶液(濃度為10^-6mol/L)共孵育，37℃孵育30min；用基礎(chǔ)培養(yǎng)基輕柔洗滌爬片，2mL/次，洗滌3次；再用4％預(yù)冷的多聚甲醛室溫固定20min，自然風(fēng)干；用DAPI染核10-15min，使細(xì)胞核染為藍(lán)色，用PBS充分洗滌，封片后進(jìn)行TCS SP8STED超高分辨率激光共聚焦觀察(以與PBS共孵育的細(xì)胞爬片作為陰性對照)。按照常規(guī)ELISA操作，分別包被表達(dá)純化后的目的蛋白(陽性對照，與多肽陣列為同一蛋白)、合成好的目的蛋白對應(yīng)多肽以及多肽蛋白的Mix樣品(10μg/ml)，100μL/孔，4℃孵育過夜；用含有1％BSA的PBST封閉，4℃孵育過夜；PBST洗滌3次，5min/次，拍干后-20℃保存?zhèn)溆?；次日取出?7℃復(fù)溫30min后，分別加入與多肽互作的誘餌蛋白(10μg/ml)或PBS(陰性對照)，100μL/孔，37℃孵育2h；PBST洗滌3次，5min/次；拍干后，與誘餌蛋白抗體(1:1000)37℃孵育1h后，同上洗滌，拍干后再與HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗(1:10000)孵育，100μL/孔，37℃孵育30min；PBST洗滌同前，拍干；加入新鮮配制的TMB底物顯色液，100μL/孔，37℃作用15min后以2mol/L H₂SO₄終止顯色，50μL/孔；酶標(biāo)儀測定孔內(nèi)的OD₄₅₀，比較不同組的顯色值。最終將驗(yàn)證的陽性多肽在目的蛋白氨基酸序列上進(jìn)行標(biāo)注以進(jìn)行分析，具體見圖12、圖13。由圖10、11可知，APN-FaeG的互作位點(diǎn)存在于圖中以單點(diǎn)形式表現(xiàn)出來的多肽序列中，且生物素標(biāo)記和抗體標(biāo)記兩種檢測方法的結(jié)合位點(diǎn)類似(圖10)；天然F4菌毛蛋白和重組F4菌毛蛋白的陣列反應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)類似(圖11)。由圖14、15可知，不同F(xiàn)aeG多肽與APN蛋白及其多肽反應(yīng)孔的顯色值存在組間差異，其中標(biāo)號(hào)為1801、1901、2101、3001、3101和3201的FaeG多肽對應(yīng)孔顯色值明顯強(qiáng)于標(biāo)號(hào)為2201、2301的FaeG多肽對應(yīng)孔的顯色值。由圖15可知，F(xiàn)4ab組(包括F4ab菌毛蛋白，標(biāo)號(hào)為1901、2201、3001的F4ab FaeG多肽)中，標(biāo)號(hào)為4201、4301、4501的APN多肽對應(yīng)孔的顯色值較強(qiáng)；F4ac組(包括F4ac菌毛蛋白，標(biāo)號(hào)為2001、1801、3101的F4ac FaeG多肽)中，標(biāo)號(hào)為4301、4401、4501、5501、5801的APN多肽對應(yīng)孔的顯色值較強(qiáng)；F4ad組(包括F4ad菌毛蛋白，標(biāo)號(hào)為2101、2301、3201的F4ad FaeG多肽)中，標(biāo)號(hào)為4201、4301、4501的APN多肽對應(yīng)孔的顯色值較強(qiáng)。根據(jù)各標(biāo)號(hào)對應(yīng)的多肽可知，也就是說，主要識(shí)別F4ab的是TITTTAAITLDQSKPWNRY、ATFNITLIHPNNLTALSNM、VINRAQVIYDSFNLATAHM；主要識(shí)別F4ac的是ATFNITLIHPNNLTALSNM、WIVPISSIKNGVMQDHYWL、VINRAQVIYDSFNLATAHM、VLRGVGDSQVPEIDRT和GVTRRFSSEFELQQLE；主要識(shí)別F4ad的是TITTTAAITLDQSKPWNRY、ATFNITLIHPNNLTALSNM、VINRAQVIYDSFNLATAHM。