本發(fā)明涉及細菌性陰道炎檢測試劑領域，具體涉及一種脯氨酸氨基肽酶檢測試劑、反應墊及試劑盒。
背景技術：
陰道炎是陰道黏膜及黏膜下結締組織的炎癥，是婦科門診常見的疾病。正常健康婦女，由于解剖學及生物化學特點，陰道對病原體的侵入有自然防御功能，當陰道的自然防御功能遭到破壞，則病原體易于侵入，導致陰道炎癥。常見的陰道炎有細菌性陰道炎(BV/AV)、霉菌性陰道炎(VVC)及滴蟲性陰道炎(TV)三大類。其中，女性細菌性陰道感染可分為兩種，一種由厭氧菌和兼性厭氧菌引起，臨床上稱細菌性陰道病(BV)，另一種由需氧菌引起，臨床上稱需氧菌性陰道炎(AV)。兩種細菌性陰道炎的病原體不同，臨床癥狀、治療方案和結局也不相同，區(qū)別這兩種細菌性陰道感染，在陰道感染的診療中具有重要意義。BV是指一類在生殖學上正常菌群(產(chǎn)H2O2乳酸桿菌)減少，代之以加德納菌、厭氧菌，動彎桿菌大量繁殖，陰道內生態(tài)平衡系統(tǒng)改變引起的一類疾病。脯氨酸氨基肽酶是由加德納菌和動彎桿菌產(chǎn)生，是BV相關病原體所分泌的特異性標志酶，故陰道分泌物中存在脯氨酸氨基肽酶即可針對BV。但目前用于檢測脯氨酸氨基肽酶的檢測試劑其精確度有所欠缺。
技術實現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種脯氨酸氨基肽酶檢測試劑，該檢測試劑通過添加二硫蘇糖醇(DTT)和牛血清白蛋白(BSA)特異增強脯氨酸氨基肽酶活性的穩(wěn)定性，檢測更加準確。
實現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術方案達到：一種脯氨酸氨基肽酶檢測試劑：包括二硫蘇糖醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、Z-甘氨酰-脯氨酸-對硝基苯胺、牛血清白蛋白和Tris-Hcl緩沖液。
作為優(yōu)選，所述脯氨酸氨基肽酶檢測試劑中的成分按重量份計包括：
其中，牛血清白蛋白占脯氨酸氨基肽酶檢測試劑的體積百分比0.5～10％；
Tris-Hcl緩沖液的摩爾濃度為0.01～1mol/L。
再優(yōu)選地，所述脯氨酸氨基肽酶檢測試劑中的成分按重量份計包括：
其中，牛血清白蛋白占脯氨酸氨基肽酶檢測試劑的體積百分比2％；
Tris-Hcl緩沖液的摩爾濃度為0.1mol/L。
作為優(yōu)選，所述聚乙烯吡咯烷酮為聚乙烯吡咯烷酮-K90。
作為優(yōu)選，使用所述脯氨酸氨基肽酶檢測試劑進行檢測的樣品的稀釋液為生理鹽水。
本發(fā)明的第二個目的是為了提供一種反應墊，該反應墊使用方便快捷，精確性高。
實現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術方案達到：一種反應墊，包括載體和如上所述的脯氨酸氨基肽酶檢測試劑的成分；所述脯氨酸氨基肽酶檢測試劑的成分包被在載體上；所述反應墊用于檢測脯氨酸氨基肽酶。
作為優(yōu)選，使用所述反應墊進行檢測的樣品的稀釋液為生理鹽水。
本發(fā)明的第三個目的是為了提供一種反應墊的制備方法，通過該制備方法結合檢測試劑的成分獲得一種靈敏度高、精確度高的反應墊。
實現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術方案達到：一種如上所述的反應墊的制備方法，包括以下步驟：
1)制備浸泡液：將二硫蘇糖醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、Z-甘氨酰-脯氨酸-對硝基苯胺和牛血清白蛋白溶于Tris-Hcl緩沖液中，得到浸泡液；
2)浸泡液處理：將載體置于浸泡液中充分浸泡后取出，然后進行干燥，得到反應墊。
作為優(yōu)選，步驟2)中，所述載體置于浸泡液中充分浸泡10～20s。
作為優(yōu)選，步驟2)中，所述干燥的溫度為20～75℃，時間為30～40min。
作為優(yōu)選，所述載體為濾紙。
本發(fā)明的第四個目的是為了提供一種試劑盒，該試劑盒用于檢測脯氨酸氨基肽酶，使用方便靈活。
實現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術方案達到：
一種試劑盒，包括如上所述的反應墊；所述試劑盒用于檢測脯氨酸氨基肽酶。
本發(fā)明的設計原理如下：
當陰道分泌物中正常菌群(產(chǎn)H2O2乳酸桿菌)減少，代之以加德納菌、厭氧菌，動彎桿菌大量繁殖時，加德納菌和動彎桿菌產(chǎn)生脯氨酸氨基肽酶，脯氨酸氨基肽酶水解Z-甘氨酰-脯氨酸-對硝基苯胺，對硝基苯胺呈現(xiàn)黃色；二硫蘇糖醇和牛血清白蛋白輔助增強脯氨酸氨基肽酶活性的穩(wěn)定性，使得檢測結果準確。
相比現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果在于：
1、本發(fā)明的檢測試劑通過添加二硫蘇糖醇和牛血清白蛋白特異增強脯氨酸氨基肽酶活性的穩(wěn)定性，檢測更加準確；
2、本發(fā)明的反應墊可使用生理鹽水作為檢測樣品的稀釋液，使用條件簡單方便，并可結合使用條件相同的其他菌種預成酶的檢測反應墊同時對樣品進行檢測，效率更高；
3、本發(fā)明的反應墊制備方法最大限度地將檢測試劑的成分包被在反應墊中，獲得的反應墊靈敏度高，精確性好。
附圖說明
圖1為實施例7的顯色結果示意圖。
具體實施方式
下面，結合附圖以及具體實施方式，對本發(fā)明做進一步描述：
一種脯氨酸氨基肽酶檢測試劑，按重量份計包括以下成分：
其中，牛血清白蛋白占脯氨酸氨基肽酶檢測試劑的體積百分比0.5～10％；
Tris-Hcl緩沖液的摩爾濃度為0.01～1mol/L。
聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-K90，在25℃下，體積百分數(shù)為5％的水溶液(aq)，其粘度為39.5～45.8mPas。
脯氨酸氨基肽酶檢測試劑通過以下制備方法制得：
將二硫蘇糖醇(DTT)、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、Z-甘氨酰-脯氨酸-對硝基苯胺和牛血清白蛋白(BSA)依次溶于Tris-Hcl緩沖液中，得到脯氨酸氨基肽酶檢測試劑。
一種反應墊，包括載體和如上所述的脯氨酸氨基肽酶檢測試劑的成分；所述脯氨酸氨基肽酶檢測試劑的成分包被在載體上；所述反應墊用于檢測脯氨酸氨基肽酶；使用該反應墊進行樣品檢測時，樣品的稀釋液為生理鹽水。
該反應墊的制備方法包括以下步驟：
1)備料：按以上重量份準備二硫蘇糖醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、Z-甘氨酰-脯氨酸-對硝基苯胺和牛血清白蛋白；
2)配制緩沖液：配制0.01mol/L～1mol/L的Tris-Hcl緩沖液；
3)制備浸泡液：將二硫蘇糖醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、Z-甘氨酰-脯氨酸-對硝基苯胺和牛血清白蛋白溶于Tris-Hcl緩沖液中，得到浸泡液；
4)浸泡液處理：將濾紙置于浸泡液中充分浸泡10～20s后取出，然后在溫度為20～75℃，時間為30～40min的條件下進行干燥，得到反應墊。
更具體地，所述濾紙可以是Whatman玻璃纖維濾紙、GF/A Whatman的纖維濾紙Grade3或普通定量濾紙。
應用反應墊制備試劑盒：將反應墊置于試劑盒的反應孔中，然后將反應孔密封，得到試劑盒；試劑盒置于2～8℃中保存。
實施例1～3
實施例1～3公開了脯氨酸氨基肽酶檢測試劑，按表1的分別準備三組原料成分，按表2準備濃度不同的Tris-Hcl緩沖液；A組用于實施例1，B組用于實施例2，C組用于實施例3。
將二硫蘇糖醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、Z-甘氨酰-脯氨酸-對硝基苯胺和牛血清白蛋白依次溶于100mL的Tris-Hcl緩沖液中，得到脯氨酸氨基肽酶檢測試劑。
表1檢測試劑的成分及含量
表2 Tris-Hcl緩沖液的配制參數(shù)
對實施例1～3中獲得的檢測試劑進行檢測：分別制備酶活性濃度不同的脯氨酸氨基肽酶標準品溶液，脯氨酸氨基肽酶標準品溶液以生理鹽水作為溶劑，檢測實施例1～3的靈敏度。
分別取實施例1～3的脯氨酸氨基肽酶檢測試劑各1mL，然后分別滴加標準品溶液35uL，在溫度為37±2℃的條件下水浴8～10min，然后觀察溶液中的顏色變化，溶液顯色為黃色表示陽性，無顯色表示陰性；結果如表3所示：
表3實施例1～3的檢測結果
+表示陽性，-表示陰性。
實施例1～3均可檢測脯氨酸氨基肽酶，且當脯氨酸氨基肽酶活性較低時仍然能夠檢測到脯氨酸氨基肽酶；其中在酶活性濃度為3.75U/mL時，實施例1仍可檢測得到少量的脯氨酸氨基肽酶，實施例1檢測試劑的靈敏度最高。
實施例4～6
實施例4～6公開了一種反應墊及其制備方法：
1)按表1進行備料，按表2配制Tris-Hcl緩沖液；A組用于實施例4，B組用于實施例5，C組用于實施例6；
2)制備浸泡液：將二硫蘇糖醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、Z-甘氨酰-脯氨酸-對硝基苯胺和牛血清白蛋白溶于Tris-Hcl緩沖液中，得到浸泡液；
3)浸泡液處理：將濾紙置于浸泡液中充分浸泡10～20s后取出，然后在溫度為45℃，時間40min的條件下進行干燥，得到反應墊。
對實施例4～6中獲得的反應墊進行檢測：分別制備酶活性濃度不同的脯氨酸氨基肽酶標準品溶液，脯氨酸氨基肽酶標準品溶液以生理鹽水作為溶劑，檢測實施例4～6的靈敏度；在實施例4～6的反應墊中分別滴加標準品溶液35uL，在溫度為37±2℃的條件下水浴8～10min，然后觀察反應墊中的顏色變化，反應墊顯色為黃色表示陽性，無顯色表示陰性；結果如表5所示：
表4實施例4～6的檢測結果
+表示陽性，-表示陰性。
實施例4～6的反應墊均可檢測脯氨酸氨基肽酶，且當脯氨酸氨基肽酶活性較低時仍然能夠檢測到脯氨酸氨基肽酶；其中在酶活性濃度為3.75U/mL時，實施例4仍可檢測得到少量的脯氨酸氨基肽酶，實施例4的反應墊靈敏度最高。
實施例7
在實施例4中，浸泡液采用鹽酸緩沖液、雙甘氨肽-Tris-Hcl溶液、2％吐溫、生理鹽水替代二硫蘇糖醇，并采用與實施例4～6相同的脯氨酸氨基肽酶標準品溶液進行檢測；檢測結果如表5所示：
表5采用不同試劑替代二硫蘇糖醇所得到的反應墊的檢測結果
+表示陽性，-表示陰性。
結果顯示：添加二硫蘇糖醇的反應墊的靈敏度最高，在酶活性濃度為3.75U/mL時仍然能夠檢測得到。
實施例8
本實施例將實施例4得到和對比例的反應墊置于不同的保存條件，檢測其穩(wěn)定性，對比例為未添加牛血清白蛋白的反應墊；處理后采用與實施例4～6相同的檢測方法進行檢測，反應墊的顯色結果如圖1所示，圖示中的空白對照為生理鹽水，結果如表6所示：
表6不同條件下處理后的反應墊靈敏度檢測結果
+表示陽性，-表示陰性。
檢測結果顯示，冷藏保存反應墊可以使反應墊更加穩(wěn)定，而添加了牛血清白蛋白的反應墊比未添加牛血清白蛋白的反應墊更加靈敏，表明牛血清白蛋白提高了反應墊的穩(wěn)定性。
對于本領域的技術人員來說，可根據(jù)以上描述的技術方案以及構思，做出其它各種相應的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應該屬于本發(fā)明權利要求的保護范圍之內。