本發(fā)明涉及需氧菌性陰道炎檢測試劑領(lǐng)域，具體涉及一種β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑、反應(yīng)墊、其制備方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

陰道炎是陰道黏膜及黏膜下結(jié)締組織的炎癥，是婦科門診常見的疾病。正常健康婦女，由于解剖學(xué)及生物化學(xué)特點(diǎn)，陰道對病原體的侵入有自然防御功能，當(dāng)陰道的自然防御功能遭到破壞，則病原體易于侵入，導(dǎo)致陰道炎癥。常見的陰道炎有細(xì)菌性陰道炎(BV/AV)、霉菌性陰道炎(VVC)及滴蟲性陰道炎(TV)三大類。其中，女性細(xì)菌性陰道感染可分為兩種，一種由厭氧菌和兼性厭氧菌引起，臨床上稱細(xì)菌性陰道病(BV)，另一種由需氧菌引起，臨床上稱需氧菌性陰道炎(AV)。兩種細(xì)菌性陰道炎的病原體不同，臨床癥狀、治療方案和結(jié)局也不相同，區(qū)別這兩種細(xì)菌性陰道感染，在陰道感染的診療中具有重要意義。BV是指一類在生殖學(xué)上正常菌群(產(chǎn)H₂O₂乳酸桿菌)減少，代之以加德納菌、厭氧菌，彎曲弧菌大量繁殖，陰道內(nèi)生態(tài)平衡系統(tǒng)改變引起的一類疾病。AV是由陰道乳酸桿菌減少，需氧菌感染引起的陰道炎癥。常見病原體為鏈球菌、葡萄球菌以及大腸埃希菌。正常陰道是以乳酸桿菌為優(yōu)勢菌的正常微生物群，陰道pH＜4.5。而當(dāng)患需氧菌性陰道炎時(shí)，陰道乳酸桿菌減少，而需氧菌繁殖導(dǎo)致陰道壁黏膜充血、水腫和產(chǎn)生膿性分泌物。臨床表現(xiàn)以陰道異常分泌物、性交痛為主。細(xì)菌預(yù)成酶是細(xì)菌在生長繁殖過程中合成的一系列與生長代謝有關(guān)的酶類，這些酶類能分解多種生化反應(yīng)的底物，并且在有氧環(huán)境中能較長時(shí)間地保留其活性。不同種屬的細(xì)菌，其預(yù)成酶的種類不同。B族鏈球菌和大腸埃希菌代謝可產(chǎn)生β葡萄糖醛酸苷酶。通過檢測β葡萄糖醛酸苷酶來診斷陰道中需氧菌菌群結(jié)構(gòu)是一個(gè)有效、可行的方法。但目前用于檢測β葡萄糖醛酸苷酶的檢測試劑其精確度有所欠缺。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑，該檢測試劑通過添加新生牛血清特異增強(qiáng)β-葡萄糖醛酸苷酶活性的穩(wěn)定性，檢測更加準(zhǔn)確。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：一種β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑，包括聚乙烯吡咯烷酮、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷鹽和新生牛血清和磷酸鹽緩沖液。

作為優(yōu)選，所述β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑中的成分按重量份計(jì)包括：

聚乙烯吡咯烷酮 1～10份；

5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷鹽 2.5～25份；

其中，新生牛血清占β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑的體積百分比為1～10％；

磷酸鹽緩沖液的摩爾濃度為50～150mmol/L。

作為優(yōu)選，所述β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑中的成分按重量份計(jì)包括：

聚乙烯吡咯烷酮 2份；

5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷鹽 5份；

其中，新生牛血清占β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑的體積百分比為1％；

磷酸鹽緩沖液的摩爾濃度為100mmol/L。

作為優(yōu)選，所述聚乙烯吡咯烷酮為聚乙烯吡咯烷酮-K90。

作為優(yōu)選，所述5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷鹽為5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷鈉。

作為優(yōu)選，使用所述β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑進(jìn)行檢測的樣品的稀釋液為生理鹽水。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是為了提供一種反應(yīng)墊，該反應(yīng)墊使用方便快捷，精確性高。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：一種反應(yīng)墊，包括載體和如上所述的β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑的成分；所述β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑的成分包被在載體上；所述反應(yīng)墊用于檢測β-葡萄糖醛酸苷酶。

作為優(yōu)選，使用所述反應(yīng)墊進(jìn)行檢測的樣品的稀釋液為生理鹽水。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是為了提供一種反應(yīng)墊的制備方法，通過該制備方法結(jié)合檢測試劑的成分獲得一種靈敏度高、精確度高的反應(yīng)墊。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：一種如上所述的反應(yīng)墊的制備方法，包括以下步驟：

1)制備浸泡液A：將聚乙烯吡咯烷酮和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷鹽溶于磷酸鹽緩沖液中，得到浸泡液A；

2)制備浸泡液B：將新生牛血清充分溶于磷酸鹽緩沖液中，得到浸泡液B；

3)浸泡液A處理：將載體置于浸泡液A中充分浸泡后取出，然后進(jìn)行干燥，得到浸泡液A載體；

4)浸泡液B處理：將浸泡液A載體置于浸泡液B中充分浸泡后取出，然后進(jìn)行干燥，得到反應(yīng)墊。

作為優(yōu)選，步驟1)和2)中，所述磷酸鹽緩沖液的pH為6.8～7.5；再優(yōu)選地，所述磷酸鹽緩沖液的pH為6.8。

作為優(yōu)選，步驟1)和2)中，所述磷酸鹽緩沖液為磷酸鈉緩沖液。

作為優(yōu)選，步驟3)中，所述載體置于浸泡液A中充分浸泡10～20s；步驟4)中，所述載體置于浸泡液B中充分浸泡10～20s。

作為優(yōu)選，步驟3)中，所述干燥的溫度為20～70℃，時(shí)間為30～40min；步驟4)中，所述干燥的溫度為20～70℃，時(shí)間為30～40min。

作為優(yōu)選，所述載體為濾紙。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是為了提供一種試劑盒，該試劑盒用于檢測β-葡萄糖醛酸苷酶。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：一種試劑盒，包括如上所述的反應(yīng)墊；所述試劑盒用于檢測β-葡萄糖醛酸苷酶。

本發(fā)明的設(shè)計(jì)原理如下：

當(dāng)陰道分泌物中的葡萄糖醛酸苷酶活性異常時(shí)，葡萄糖醛酸苷酶水解5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷鹽，吲哚基在有氧的條件下呈現(xiàn)藍(lán)色，呈色的深度與β-葡萄糖醛酸苷酶的活性成正比；新生牛血清輔助增強(qiáng)β-葡萄糖醛酸苷酶活性的穩(wěn)定性，使得檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明的檢測試劑通過添加新生牛血清特異增強(qiáng)β-葡萄糖醛酸苷酶活性的穩(wěn)定性，檢測更加準(zhǔn)確；

2、本發(fā)明的反應(yīng)墊可使用生理鹽水作為檢測樣品的稀釋液，使用條件簡單方便，并可結(jié)合使用條件相同的其他菌種預(yù)成酶的檢測反應(yīng)墊同時(shí)對樣品進(jìn)行檢測，效率更高；

3、本發(fā)明的反應(yīng)墊制備方法最大限度地將檢測試劑的成分包被在反應(yīng)墊中，獲得的反應(yīng)墊靈敏度高，精確性好。

附圖說明

圖1為實(shí)施例8的顯色結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

下面，結(jié)合附圖以及具體實(shí)施方式，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：

一種β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑，按重量份計(jì)包括以下成分：

聚乙烯吡咯烷酮-K90 1～10份；

5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷鈉 2.5～25份；

其中，新生牛血清占β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑的體積百分比為1～10％；

磷酸鹽緩沖液的摩爾濃度為50～150mmol/L；

聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-K90，在25℃下，體積百分?jǐn)?shù)為5％的水溶液(aq)，其粘度為39.5～45.8mPas。

β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑通過以下制備方法制得：

將聚乙烯吡咯烷酮、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷鈉和新生牛血清依次溶于pH為6.8～7.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，得到β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑。

一種反應(yīng)墊，包括載體和如上所述的β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑的成分；所述β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑的成分包被在載體上；所述反應(yīng)墊用于檢測β-葡萄糖醛酸苷酶。使用該反應(yīng)墊進(jìn)行樣品檢測時(shí)，樣品的稀釋液為生理鹽水。

該反應(yīng)墊的制備方法包括以下步驟：

1)備料：按以上重量份準(zhǔn)備聚乙烯吡咯烷酮-K90、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷鹽和新生牛血清；

2)配制磷酸鹽緩沖液(PBS)：配制pH為6.8～7.5的磷酸鹽緩沖液待用；

所述磷酸鹽緩沖液為NaH₂PO₄和Na₂HPO₄的水溶液；

3)制備浸泡液A：將聚乙烯吡咯烷酮和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷鈉溶于磷酸鹽緩沖液中，得到浸泡液A；

4)制備浸泡液B：將新生牛血清充分溶于磷酸鹽緩沖液中，得到浸泡液B；

5)浸泡液A處理：將濾紙置于浸泡液A中充分浸泡10～20s后取出，然后在溫度為20～70℃，時(shí)間為30～40min的條件下進(jìn)行干燥，得到浸泡液A濾紙；

6)浸泡液B處理：將浸泡液A濾紙置于浸泡液B中充分浸泡10～20s后取出，然后在溫度為20～70℃，時(shí)間為30～40min的條件下進(jìn)行干燥，得到反應(yīng)墊。

更具體地，所述濾紙可以是Whatman玻璃纖維濾紙、GF/A Whatman的纖維濾紙Grade3或普通定量濾紙。

應(yīng)用反應(yīng)墊制備試劑盒：將反應(yīng)墊置于試劑盒的反應(yīng)孔中，然后將反應(yīng)孔密封，得到試劑盒；試劑盒置于2～8℃中保存；該試劑盒用于檢測β-葡萄糖醛酸苷酶。

實(shí)施例1～3

實(shí)施例1～3公開了β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑，按表1分別準(zhǔn)備三組原料成分，按表2準(zhǔn)備濃度和pH不同的磷酸鈉緩沖液；A組用于實(shí)施例1，B組用于實(shí)施例2，C組用于實(shí)施例3。

將聚乙烯吡咯烷酮、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷鈉和新生牛血清依次溶于100mL磷酸鈉緩沖液中，得到β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑。

表1檢測試劑的成分及含量

表2磷酸鈉緩沖液的配制參數(shù)

對實(shí)施例1～3中得到的檢測試劑進(jìn)行檢測：分別制備酶活性濃度不同的β-葡萄糖醛酸苷酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，β-葡萄糖醛酸苷酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液以生理鹽水作為溶劑，檢測實(shí)施例1～3的靈敏度。

分別取實(shí)施例1～3的β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑各1mL，然后分別滴加標(biāo)準(zhǔn)品溶液35uL，在溫度為37±2℃的條件下水浴8～10min，然后觀察溶液中的顏色變化，溶液顯色為淡藍(lán)色、藍(lán)色或藍(lán)紫色表示陽性，無顯色表示陰性；結(jié)果如表3所示：

表3實(shí)施例1～3的檢測結(jié)果

+表示陽性，-表示陰性。

實(shí)施例1～3均可檢測β-葡萄糖醛酸苷酶，且當(dāng)β-葡萄糖醛酸苷酶活性較低時(shí)仍然能夠檢測到β-葡萄糖醛酸苷酶；其中在酶活性濃度為3.75U/mL時(shí)，實(shí)施例1仍可檢測得到少量的β-葡萄糖醛酸苷酶，實(shí)施例1檢測試劑的靈敏度最高。

實(shí)施例4～6

實(shí)施例4～6公開了一種反應(yīng)墊及其制備方法：

1)按表1進(jìn)行備料，按表2配制磷酸鈉緩沖液；A組用于實(shí)施例4，B組用于實(shí)施例5，C組用于實(shí)施例6；

2)制備浸泡液A：將聚乙烯吡咯烷酮和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷鈉溶于100mL磷酸鈉緩沖液中，得到浸泡液A；

3)制備浸泡液B：將新生牛血清充分溶于100mL磷酸鈉緩沖液中，得到浸泡液B；

4)浸泡液A處理：將濾紙置于浸泡液A中充分浸泡10～20s后取出，然后在溫度為40℃，時(shí)間為30～40min的條件下進(jìn)行干燥，得到浸泡液A濾紙；

5)浸泡液B處理：將浸泡液A濾紙置于浸泡液B中充分浸泡10～20s后取出，然后在溫度為40℃，時(shí)間為30～40min的條件下進(jìn)行干燥，得到反應(yīng)墊。

對實(shí)施例4～6中得到的反應(yīng)墊進(jìn)行檢測：分別制備酶活性濃度不同的β-葡萄糖醛酸苷酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，β-葡萄糖醛酸苷酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液以生理鹽水作為溶劑，檢測實(shí)施例4～6的靈敏度；在實(shí)施例4～6的反應(yīng)墊中分別滴加標(biāo)準(zhǔn)品溶液35uL，在溫度為37±2℃的條件下水浴8～10min，然后觀察反應(yīng)墊中的顏色變化，反應(yīng)墊顯色為淡藍(lán)色、藍(lán)色或藍(lán)紫色表示陽性，無顯色表示陰性；結(jié)果如表5所示：

表4實(shí)施例4～6的檢測結(jié)果

+表示陽性，-表示陰性。

實(shí)施例4～6的反應(yīng)墊均可檢測β-葡萄糖醛酸苷酶，且當(dāng)β-葡萄糖醛酸苷酶活性較低時(shí)仍然能夠檢測到β-葡萄糖醛酸苷酶；其中在酶活性濃度為3.75U/mL時(shí)，實(shí)施例4仍可檢測得到少量的β-葡萄糖醛酸苷酶，實(shí)施例4的反應(yīng)墊靈敏度最高。

實(shí)施例7

在實(shí)施例4中，浸泡液A和浸泡液B均采用與磷酸鈉緩沖液摩爾濃度相同的Tris-Hcl緩沖液、無水甲醇或生理鹽水替代磷酸鈉緩沖液，并采用與實(shí)施例4～6相同的β-葡萄糖醛酸苷酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如表6所示：

表5采用不同溶劑替代磷酸鈉緩沖液所得到的反應(yīng)墊的檢測結(jié)果

結(jié)果顯示：采用磷酸鹽緩沖液的靈敏度最高，在酶活性濃度為3.75U/mL時(shí)仍然能夠檢測得到。

實(shí)施例8

本實(shí)施例將實(shí)施例4得到的反應(yīng)墊置于不同的保存條件，檢測其穩(wěn)定性，處理后采用與實(shí)施例4～6相同的檢測方法進(jìn)行檢測，反應(yīng)墊的顯色結(jié)果如圖1所示，圖示中的空白對照為生理鹽水，結(jié)果如表6所示：

表6不同條件下處理的反應(yīng)墊靈敏度檢測結(jié)果

檢測結(jié)果顯示，添加了新生牛血清的反應(yīng)墊無論在37℃放置或低溫條件下處理，均表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性，且靈敏度仍然比未添加新生牛血清的反應(yīng)墊高，表明新生牛血清在本發(fā)明當(dāng)中提高了反應(yīng)墊的穩(wěn)定性。

對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應(yīng)的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。