本申請(qǐng)屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及檢測(cè)炎癥性肌病NXP2自身抗體的非放射標(biāo)記免疫沉淀方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

特發(fā)性炎癥性肌病(idiopathic inflammatory myopathies，IIM)是一組以侵害骨骼肌為主的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，自身免疫的異常是IIM的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。根據(jù)最近的診斷分類標(biāo)準(zhǔn)，IIM可分為多發(fā)性肌炎(polymyositis，PM)、皮肌炎(dermatomyositis，DM)、免疫介導(dǎo)的壞死性肌炎(immune-mediated necrotizing myopathy，IMNM)、非特異性肌炎(nonspecific myositis，NSM)和包涵體肌炎(inclusion body myositis，sIBM)。IIM臨床特點(diǎn)表現(xiàn)為四肢近端肌無(wú)力、特征性皮疹、系統(tǒng)性損害以及血清中存在多種自身抗體，這些自身抗體與臨床表型密切相關(guān)(Mei Zong&Ingrid E.Lundberg.Pathogenesis,classification and treatment of inflammatory myopathies.Nature Review sRheumatology,2011,7,297-306.)。

IIM患者的自身抗體主要分為肌炎特異性自身抗體(myositis specific autoantibodies,MSAs)和肌炎相關(guān)性自身抗體(myositis associated autoantibodies,MAAs)。傳統(tǒng)的MSAs包括抗氨基酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase,ARS)抗體、抗Mi-2抗體和抗信號(hào)識(shí)別顆粒(signal recognition particle，SRP)抗體，近些年也發(fā)現(xiàn)多種新的MSAs，如抗黑色素瘤分化相關(guān)基因(melanoma differentiation associated gene 5，NXP2)抗體、抗核基質(zhì)蛋白2(nuclear matrix protein 2，NXP2)抗體、抗轉(zhuǎn)錄中介因子1(transcriptional intermediary factor 1，TIF1)抗體等，MSAs一般僅見(jiàn)于IIM患者，對(duì)于疾病的臨床-血清學(xué)分類有重要的指導(dǎo)意義(Sarah L Tansley,Zoe E,Betteridge,Neil J,McHugh.The diagnostic utility of autoantibodies in adult and juvenile myositis.Current Opinion in Rheumatology,2013,25(6):772-777.)。

NXP-2蛋白(又名MORC3)定位于細(xì)胞核的PML(早幼粒細(xì)胞性白血病)核體，在RNA代謝及維持細(xì)胞核結(jié)構(gòu)方面起到了重要的作用，還能募集和激活p53通路，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄(Kimura Y,Sakai F,Nakano O,Kisaki O,Sugimoto H,Sawamura T,Sadano H,Osumi T.The newly identified human nuclear protein NXP-2possesses three distinct domains,the nuclear matrix-binding,RNA-binding,and coiled-coil domains.J Biol Chem.2002；277:20611–20617)。Oddis等發(fā)現(xiàn)18％兒童皮肌炎(juvenile dermatomyositis,JDM)患者的血清中存在一種針對(duì)分子質(zhì)量為140KD蛋白質(zhì)的自身抗體，稱為MJ(myositis iuvenile)/P140抗體(Oddis CV,Fertig N,Goel A,Espada G,Confalone Gregorian M,Maldonado Cocco JA,et al.Clinical and serological characterization of the anti-MJ antibody in childhood myositis.Arthritis Rheum.1997；40:S139.)。隨后Targoff IN等通過(guò)免疫沉淀法確認(rèn)了該抗體的靶抗原是NXP-2(Targoff IN,Trieu EP,Levy-Neto M,Fertig N,Oddis CV.Sera with autoantibodies to the MJ antigen react with NXP2.Arthritis Rheum.2007；56:S787)。Gunawardena等回顧英國(guó)及愛(ài)爾蘭JDM的研究中發(fā)現(xiàn)，23％的JDM患者該抗體陽(yáng)性，抗體陽(yáng)性的患者更容易發(fā)生鈣質(zhì)沉著(Gunawardena H1,Wedderburn LR,Chinoy H,Betteridge ZE,North J,Ollier WE,Cooper RG,Oddis CV,Ramanan AV,Davidson JE,McHugh NJ；Juvenile Dermatomyositis Research Group,UK and Ireland.Autoantibodies to a 140-kd protein in juvenile dermatomyositis are associated with calcinosis.Arthritis Rheum.2009Jun；60(6):1807-14.)。Cefibelli等研究了58例意大利成年P(guān)M/DM患者，發(fā)現(xiàn)30％的DM和8％的PM患者血清中抗NXP-2抗體陽(yáng)性?？筃XP-2抗體陽(yáng)性的患者發(fā)病年齡較輕，向陽(yáng)疹及皮下鈣質(zhì)沉著較明顯，而少有內(nèi)臟損傷和腫瘤的發(fā)生，對(duì)治療反應(yīng)更好(Angela Ceribelli,Micaela Fredi,Mara Taraborelli,Ilaria Cavazzana,Franco Franceschini,Marzia Quinzanini,Angela Tincani,Steven.J.Ross,Jason YF Chan,Brad A Pauley,Edward KL Chan,Minoru Satoh.Anti-MJ/NXP-2autoantibody specificity in a cohort of adult Italian patients with polymyositis/dermatomyositis.Arthritis Res Ther.2012；14(2):R97.)。Ichimura等研究了507例成年日本IIM患者，發(fā)現(xiàn)該抗體的陽(yáng)性率在PM和DM患者中的陽(yáng)性率均為1.6％。所有抗體陽(yáng)性的患者均有明顯的肌無(wú)力，血清肌酸激酶顯著升高，但與DM的皮疹無(wú)明顯相關(guān)性。另外37.5％的抗體陽(yáng)性DM患者合并腫瘤(Ichimura Y,Matsushita T,Hamaguchi Y,Kaji K,Hasegawa M,Tanino Y,Inokoshi Y,Kawai K,Kanekura T,Habuchi M,Igarashi A,Sogame R,Hashimoto T,Koga T,Nishino A,Ishiguro N,Sugimoto N,Aoki R,Ando N,Abe T,Kanda T,Kuwana M,Takehara K,Fujimoto M.Anti-NXP2autoantibodies in adult patients with idiopathic inflammatory myopathies:possible association with malignancy.Ann Rheum Dis.2012May；71(5):710-3.)。盧昕等檢測(cè)我國(guó)IIM患者NXP-2抗體水平，發(fā)現(xiàn)抗體陽(yáng)性率為5.1％，陽(yáng)性患者發(fā)病年齡較低，而皮下鈣質(zhì)沉積的發(fā)生率較高(盧昕,袁凱,楊闞波,彭清林,王艷,張學(xué)智,王國(guó)春.抗核基質(zhì)蛋白2抗體在特發(fā)性炎性肌病中的分布及臨床意義.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2014,18(4))。不同人群抗體陽(yáng)性率及與臨床相關(guān)性的差異可能與不同種族、地域、檢測(cè)方法以及樣本量大小有關(guān)，因此抗NXP2自身抗體在特發(fā)性炎癥性肌病患者中的檢測(cè)具有重要的臨床意義。

檢測(cè)自身免疫性疾病自身抗體的主要方法有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、放射標(biāo)記的免疫沉淀方法、免疫印跡法，但是目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有商業(yè)化的檢測(cè)NXP2抗體的ELISA試劑盒以及免疫印跡膜條，大部分實(shí)驗(yàn)室對(duì)于NXP2抗體的檢測(cè)包括：(1)購(gòu)買純化的NXP2蛋白包被酶標(biāo)反應(yīng)板，加入待測(cè)血清后孵育，使用酶標(biāo)的抗人免疫球蛋白抗體可以檢測(cè)出與抗原結(jié)合的抗體，隨后用合適的酶底物進(jìn)行顯色；(2)購(gòu)買純化的NXP2蛋白與待測(cè)血清進(jìn)行免疫沉淀，采用western Blot檢測(cè)沉淀后的產(chǎn)物；(3)采用S35標(biāo)記Hela細(xì)胞，然后用待測(cè)血清進(jìn)行免疫沉淀，SDS-PAGE電泳分離沉淀物、放射自顯影，這是檢測(cè)MSA的金標(biāo)準(zhǔn)。以上方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，酶聯(lián)免疫吸附法為自身抗體的檢測(cè)提供了敏感性高且較迅速的方法，但是目前尚無(wú)商業(yè)化的檢測(cè)NXP2抗體的ELISA試劑盒，這種方法需要高度純化的抗原，而且抗原包被的條件需要最優(yōu)化，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果，需要批量操作，對(duì)于發(fā)病率不是那么高的炎癥性肌病，導(dǎo)致成本的增加；作為金標(biāo)準(zhǔn)的放射標(biāo)記免疫沉淀法有很高的特異性和敏感性，而且這種方法沉淀的是以天然構(gòu)象存在的抗原以及與靶抗原相互作用的蛋白分子，但是放射同位素只能用于裝備良好的實(shí)驗(yàn)室，并要求嚴(yán)格控制，不適合推廣使用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供檢測(cè)炎癥性肌病NXP2自身抗體的非放射標(biāo)記免疫沉淀方法與應(yīng)用，解決目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有商業(yè)化檢測(cè)NXP2抗體的ELISA試劑盒以及免疫印跡膜條的缺陷，以及自行包被NXP2抗原的ELISA試劑盒的高成本、高假陽(yáng)性率和放射標(biāo)記免疫沉淀法的安全性等問(wèn)題。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

檢測(cè)炎癥性肌病NXP2自身抗體的非放射標(biāo)記免疫沉淀方法，包括以下步驟：

1)利用引物對(duì)NXP2-F/NXP-R2和引物對(duì)NXP2-F2/NXP2-R從pCMV-myc-NXP2全長(zhǎng)質(zhì)粒中分別PCR擴(kuò)增人NXP2的N端(Genbank:NM_015358.2,80-1576bp)或C端(Genbank:NM_015358.2，1274-2896bp)；

2)用膠回收試劑盒(Omega,D2500-01)回收純化NXP2的N端或C端，然后克隆至pCMV-myc載體，構(gòu)建含NXP2N端或NXP2C端并且?guī)в蠱yc標(biāo)簽的pCMV-myc-NXP2N或pCMV-myc-NXP2C質(zhì)粒，通過(guò)酶切鑒定確定所述pCMV-myc-NXP2N或pCMV-myc-NXP2C質(zhì)粒的插入子；

3)測(cè)序證實(shí)所述pCMV-myc-NXP2N或pCMV-myc-NXP2C質(zhì)粒中的NXP2N端或NXP2C端序列和讀碼框的準(zhǔn)確性；

4)將所述pCMV-myc-NXP2N或pCMV-myc-NXP2C質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胚腎(HEK)293細(xì)胞48小時(shí)，通過(guò)Western Blot法使用c-myc抗體或NXP2抗體檢測(cè)所述pCMV-myc-NXP2N或pCMV-myc-NXP2C質(zhì)粒的NXP2N端或NXP2C端在HEK293細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)；

5)用Protein G magnetic beads分別與20ul NXP2抗體陽(yáng)性的炎癥性肌病患者血清或健康對(duì)照血清進(jìn)行結(jié)合，繼而與過(guò)表達(dá)的NXP2N端或NXP2C端的細(xì)胞裂解液孵育進(jìn)行抗原吸附，洗脫后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，用c-myc抗體進(jìn)行檢測(cè)。

檢測(cè)炎癥性肌病NXP2自身抗體的非放射標(biāo)記免疫沉淀方法的應(yīng)用，用于檢特發(fā)性炎癥性肌病患者的抗NXP2自身抗體。

附圖說(shuō)明

此處所說(shuō)明的附圖用來(lái)提供對(duì)本申請(qǐng)的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分，本申請(qǐng)的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本申請(qǐng)，并不構(gòu)成對(duì)本申請(qǐng)的不當(dāng)限定。

圖1是本發(fā)明pCMV-myc-NXP2N或pCMV-myc-NXP2C質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果圖；

圖2是本發(fā)明含NXP2的N端或C端并且?guī)в蠱yc標(biāo)簽的pCMV-myc-NXP2N或pCMV-myc-NXP2C質(zhì)粒圖譜；

圖3是本發(fā)明測(cè)序證實(shí)pCMV-myc-NXP2N或pCMV-myc-NXP2C質(zhì)粒中NXP2的N端(a)或C端(b)序列和讀碼框的準(zhǔn)確性對(duì)照?qǐng)D；

圖4是本發(fā)明Western Blot法檢測(cè)pCMV-myc-NXP2或pCMV-myc-NXP2C質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞的過(guò)表達(dá)；其中，(a)為c-myc抗體檢測(cè)pCMV-myc-NXP2N或pCMV-myc-NXP2C質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞的過(guò)表達(dá)；(b)為NXP2抗體檢測(cè)pCMV-myc-NXP2N或pCMV-myc-NXP2C質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞的過(guò)表達(dá)；

圖5是本發(fā)明采用NXP2抗體陽(yáng)性的炎癥性肌病患者血清和健康對(duì)照血清與過(guò)表達(dá)NXP2N端或NXP2C端的HEK293細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫沉淀，western Blot檢測(cè)沉淀的NXP2蛋白，從而證實(shí)炎癥性肌病患者血清中NXP2抗體能夠識(shí)別HEK293細(xì)胞中的含Myc標(biāo)簽的NXP2N端或C端；

圖6是本發(fā)明采用非放射標(biāo)記免疫沉淀方法篩選炎癥性肌病患者血清中的NXP2抗體；其中(a)和(b)為分別選自不同炎癥性肌病患者血清檢測(cè)的NXP2抗體，HC為健康對(duì)照，IM為炎癥性肌病。

具體實(shí)施方式

以下將配合附圖及實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本申請(qǐng)的實(shí)施方式，借此對(duì)本申請(qǐng)如何應(yīng)用技術(shù)手段來(lái)解決技術(shù)問(wèn)題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過(guò)程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。

實(shí)施例1炎癥性肌病NXP2自身抗體的非放射標(biāo)記免疫沉淀檢測(cè)方法

炎癥性肌病NXP2自身抗體的非放射標(biāo)記免疫沉淀檢測(cè)方法，包括以下步驟：

(1)設(shè)計(jì)引物對(duì)NXP2-F(5’-CGGTCGACCGCGGCGCAGCCACC-3’)和NXP2-R2(5’-GCGGTACCTTAGCTTGGAGTTGAAAGAGC-3’)、引物對(duì)NXP2-F2(5’-CGGTCGACCGAAGATATACAGAAGCGTCC-3’)和NXP2-R(5’-GCGGTACCTTAAGTACTACTGATTTCACTCATT-3’)，然后從pCMV-myc-NXP2全長(zhǎng)質(zhì)粒中分別擴(kuò)增人NXP2的N端(Genbank:NM_015358.2,80-1576bp)或C端(Genbank:NM_015358.2，1274-2896bp)。

(2)用膠回收試劑盒(Omega,D2500-01)回收純化PCR片段，用SalⅠ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶分別進(jìn)行雙酶切，與SalⅠ和KpnⅠ已雙酶切的pCMV-myc載體連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化JM109細(xì)菌感受態(tài)，在含50ug/ml氨芐青霉素的平板上篩選陽(yáng)性克隆，小量提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒DNA，用SalⅠ和KpnⅠ酶切pCMV-myc-NXP2N或pCMV-myc-NXP2C質(zhì)粒DNA，結(jié)果顯示兩種質(zhì)粒各含1.5kb或1.6kb的插入子(如附圖1所示)。

(3)將該兩種質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)NXP2N端或C端序列和讀碼框的準(zhǔn)確性(如附圖3所示)，結(jié)果提示含NXP2N端(1-500aa)或NXP2C端(400-939aa)并且?guī)в蠱yc標(biāo)簽的質(zhì)粒pCMV-myc-NXP2N或pCMV-myc-NXP2C構(gòu)建成功(如附圖2所示)。

(4)將4ug pCMV-myc-NXP2N或pCMV-myc-NXP2C質(zhì)?；騪CMV-myc瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48小時(shí)，SDS裂解液裂解HEK293細(xì)胞，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜，一張膜采用c-myc抗體進(jìn)行孵育，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pCMV-myc-NXP2N質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞中有約為60Kd的特異性條帶，轉(zhuǎn)染pCMV-myc-NXP2C質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞中有兩條約為70Kd和100Kd的特異性條帶，而轉(zhuǎn)染pCMV-myc質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞中沒(méi)有特異性條帶(如附圖4(a)所示)；同時(shí)，另一張膜采用NXP2抗體進(jìn)行孵育，發(fā)現(xiàn)NXP2C端能被NXP2抗體識(shí)別而NXP2N端不能被NXP2抗體識(shí)別(如附圖4(b)所示)，以上結(jié)果提示pCMV-myc-NXP2N或pCMV-myc-NXP2C質(zhì)粒能在HEK293細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，表達(dá)的蛋白質(zhì)約為60Kd的帶有Myc標(biāo)簽的NXP2N端或70Kd和100Kd的帶有Myc標(biāo)簽的NXP2C端。

(5)取50ul Protein G Magnetic Bead懸液與20ul NXP2抗體陽(yáng)性的炎癥性肌病患者血清或健康對(duì)照血清室溫持續(xù)混勻1h以捕獲抗體；反應(yīng)后用500μL PBS(含0.1％20)洗滌磁珠3-5次，加入200ug過(guò)表達(dá)NXP2N端或NXP2C端的HEK293細(xì)胞裂解液，并用RIPA(含1％蛋白酶抑制劑)裂解液補(bǔ)足體積至500ul，2-8℃持續(xù)混勻過(guò)夜進(jìn)行抗原吸附。重復(fù)上述清洗磁珠步驟3-5次，向其中加入40μL1×SDS-PAGE Loading Buffer混合均勻，70-90℃加熱10min；立即收集上清液至新的EP管。然后將上述樣品于10％SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入C-myc抗體雜交，ECL化學(xué)發(fā)光，證實(shí)炎癥性肌病患者血清的NXP2抗體能夠特異性地將HEK293細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的帶Myc標(biāo)簽的NXP2N端或NXP2C端沉淀下來(lái)(如附圖5所示)。

實(shí)施例2檢測(cè)50例炎癥性肌病患者血清的NXP2抗體的陽(yáng)性率

(1)接種30％HEK293細(xì)胞于75cm²的細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)小于24小時(shí)；

(2)將20ug pCMV-myc-NXP2C質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48小時(shí)；

(3)采用1ml含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解HEK293細(xì)胞，蛋白進(jìn)行定量；

(4)采用c-myc抗體證實(shí)HEK293細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的NXP2C端。

取20ul炎性肌病患者待測(cè)血清、陽(yáng)性血清、陰性血清分別與過(guò)表達(dá)NXP2C端的細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后用c-myc抗體進(jìn)行檢測(cè)，確定NXP2抗體在炎癥性肌病患者中的陽(yáng)性率約為12.8％(如附圖6所示，(a)和(b)為分別選自不同炎癥性肌病患者血清檢測(cè)的NXP2抗體)。

上述說(shuō)明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過(guò)上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。