本發(fā)明涉及氨基酸檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種美洲大蠊溶液中總氨基酸含量的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
康復(fù)新液是一種外科常用藥，其原料為美洲大蠊。康復(fù)新液在臨床上被廣泛應(yīng)用于燒傷、燙傷、戰(zhàn)傷、創(chuàng)面感染及頑固性潰瘍、褥瘡等，使用簡(jiǎn)便易行，療效較好，該單品種產(chǎn)品市場(chǎng)銷量很好?？祻?fù)新液產(chǎn)品富含丙氨酸、亮氨酸和纈氨酸等18種氨基酸，因此總氨基酸含量是產(chǎn)品質(zhì)量的主要評(píng)估指標(biāo)之一?？祻?fù)新液的原料提取物即美洲大蠊乙醇提取物、半成品即康復(fù)新液待灌液和成品康復(fù)新液均需對(duì)總氨基酸含量進(jìn)行質(zhì)量控制，由于其中的丙氨酸含量比重最大，故以丙氨酸作為總氨基酸含量的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。
現(xiàn)有的康復(fù)新液中總氨基酸含量的檢測(cè)方法包括以下步驟：對(duì)照品溶液的制備：精密稱取在105℃干燥至恒重的丙氨酸對(duì)照品50mg，置于100mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻；精密量取5mL稀釋搖勻后的溶液，置于100mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：精密量取所述對(duì)照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于10mL具塞試管中，加水至1mL；然后依次加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液(pH5.0)1.0mL、1％抗壞血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚試液3.0mL，搖勻，置于沸水浴中加熱15分鐘，取出，放冷；再加入80％乙醇3.0mL，搖勻，采用紫外分光光度法試驗(yàn)，在570nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)品的測(cè)定：精密量取康復(fù)新液待測(cè)品2mL，置于100mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻；精密量取1mL稀釋搖勻后的溶液，置于10mL具塞試管中，然后依次加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液(pH5.0)1.0mL、1％抗壞血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚試液3.0mL，搖勻，置于沸水浴中加熱15分鐘，取出，放冷；再加入80％乙醇3.0mL，搖勻，在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定紫外吸收度，從所述標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出待測(cè)品溶液中氨基酸的含量，計(jì)算，即得。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：康復(fù)新液成品每1mL含總氨基酸以丙氨酸(C3H7NO2)計(jì)，不得少于0.72mg。
現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)曲線法可檢測(cè)出康復(fù)新液中總氨基酸的含量，但是檢測(cè)方法操作復(fù)雜，檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)(一般在2h以上)，影響生產(chǎn)周期。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N美洲大蠊溶液中總氨基酸含量的檢測(cè)方法，本申請(qǐng)?zhí)峁┑臋z測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)較短，生產(chǎn)周期較短。
本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N美洲大蠊溶液中總氨基酸含量的檢測(cè)方法，包括以下步驟：
提供濃度為0.014mg/mL～0.018mg/mL的丙氨酸對(duì)照品溶液；
將美洲大蠊溶液待測(cè)品用水稀釋，稀釋后的待測(cè)品與茚三酮溶液進(jìn)行反應(yīng)，得到預(yù)處理的待測(cè)品；同時(shí)將所述丙氨酸對(duì)照品溶液與所述茚三酮溶液同樣進(jìn)行反應(yīng)，得到預(yù)處理的對(duì)照品；
將所述預(yù)處理的待測(cè)品、預(yù)處理的對(duì)照品分別和乙醇溶液混合后，采用紫外分光光度法檢測(cè)，分別得到570nm波長(zhǎng)處的待測(cè)品吸收度和對(duì)照品吸收度；
按照式1所示公式計(jì)算，得到美洲大蠊溶液中總氨基酸含量；
美洲大蠊溶液待測(cè)品總氨基酸含量＝丙氨酸對(duì)照品溶液濃度/對(duì)照品吸收度*待測(cè)品吸收度*待測(cè)品稀釋倍數(shù)式1。
優(yōu)選的，所述美洲大蠊溶液選自康復(fù)新液或康復(fù)新液待灌液；
所述茚三酮溶液為茚三酮乙二醇甲醚試液。
優(yōu)選的，所述稀釋后的待測(cè)品與茚三酮溶液的反應(yīng)在緩沖液和抗壞血酸溶液存在的條件下進(jìn)行；
所述緩沖液不含與茚三酮反應(yīng)的基團(tuán)，且所述緩沖液的pH值為5～7。
優(yōu)選的，所述緩沖液選自磷酸鹽緩沖液、鄰苯二甲酸鹽緩沖液或枸櫞酸類緩沖液。
優(yōu)選的，所述待測(cè)品稀釋倍數(shù)為50倍，稀釋后的待測(cè)品的用量為1mL；
所述緩沖液的pH值為5，濃度為0.2mol/L，用量為1mL；
所述抗壞血酸溶液的質(zhì)量濃度為1％，用量為0.1mL；
所述茚三酮溶液的用量為3mL。
優(yōu)選的，所述乙醇溶液的質(zhì)量濃度為80％，用量為3mL。
優(yōu)選的，所述稀釋后的待測(cè)品與茚三酮溶液的反應(yīng)通過在沸水浴中加熱實(shí)現(xiàn)。
優(yōu)選的，所述加熱的時(shí)間為15min。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請(qǐng)?zhí)峁┑拿乐薮篌谷芤褐锌偘被岷康臋z測(cè)方法包括以下步驟：提供濃度為0.014mg/mL～0.018mg/mL的丙氨酸對(duì)照品溶液；將美洲大蠊溶液待測(cè)品用水稀釋，得到稀釋后的待測(cè)品；所述稀釋后的待測(cè)品與茚三酮溶液進(jìn)行反應(yīng)，得到預(yù)處理的待測(cè)品，再將其和乙醇溶液混合，按照紫外分光光度法檢測(cè)，在570nm波長(zhǎng)處測(cè)得待測(cè)品吸收度；將所述丙氨酸對(duì)照品溶液與稀釋后的待測(cè)品同時(shí)同法操作，測(cè)得對(duì)照品吸收度；按照式1所示公式計(jì)算，即得。本申請(qǐng)利用美洲大蠊溶液中總氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)，以及氨基酸濃度與570nm波長(zhǎng)的紫外吸收度具有良好的線性關(guān)系，采用單點(diǎn)對(duì)照品比較法檢測(cè)得到美洲大蠊溶液中總氨基酸含量，耗時(shí)在30min以內(nèi)。因此，本申請(qǐng)?zhí)峁┑臋z測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，能大大減少檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)其精密度和重復(fù)性等都符合生產(chǎn)對(duì)總氨基酸含量檢測(cè)的要求。
附圖說明
為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)提供的附圖獲得其他的附圖。
圖1為本申請(qǐng)實(shí)施例提供的檢測(cè)方法的精密度試驗(yàn)折線圖。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本申請(qǐng)實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本申請(qǐng)中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本申請(qǐng)保護(hù)的范圍。
本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N美洲大蠊溶液中總氨基酸含量的檢測(cè)方法，包括以下步驟：
提供濃度為0.014mg/mL～0.018mg/mL的丙氨酸對(duì)照品溶液；
將美洲大蠊溶液待測(cè)品用水稀釋，稀釋后的待測(cè)品與茚三酮溶液進(jìn)行反應(yīng)，得到預(yù)處理的待測(cè)品；同時(shí)將所述丙氨酸對(duì)照品溶液與所述茚三酮溶液同樣進(jìn)行反應(yīng)，得到預(yù)處理的對(duì)照品；
將所述預(yù)處理的待測(cè)品、預(yù)處理的對(duì)照品分別和乙醇溶液混合后，采用紫外分光光度法檢測(cè)，分別得到570nm波長(zhǎng)處的待測(cè)品吸收度和對(duì)照品吸收度；
按照式1所示公式計(jì)算，得到美洲大蠊溶液中總氨基酸含量；
美洲大蠊溶液待測(cè)品總氨基酸含量＝丙氨酸對(duì)照品溶液濃度/對(duì)照品吸收度*待測(cè)品吸收度*待測(cè)品稀釋倍數(shù)式1。
本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N總氨基酸含量(康復(fù)新液和美洲大蠊提取液等)的快速檢測(cè)技術(shù)，效率高。
本申請(qǐng)實(shí)施例制備成濃度為0.014mg/mL～0.018mg/mL的丙氨酸對(duì)照品溶液，濃度在0.016mg/mL最佳。所述丙氨酸對(duì)照品的來源可為中國(guó)藥品生物制品鑒定所(140680-201002)，含量為100.0％。
本申請(qǐng)實(shí)施例精密量取美洲大蠊溶液待測(cè)品，置于量瓶中用水稀釋至刻度，搖勻，得到稀釋后的待測(cè)品。
在本申請(qǐng)中，所述美洲大蠊溶液包括美洲大蠊提取液如美洲大蠊乙醇提取液或稀釋溶解的美洲大蠊提取物、康復(fù)新液(成品)和康復(fù)新液待灌液(康復(fù)新液半成品，總氨基酸要求控制在0.77mg/mL以上)等。本申請(qǐng)實(shí)施例中所述美洲大蠊溶液選自康復(fù)新液或康復(fù)新液待灌液，優(yōu)選為康復(fù)新液待灌液。
在本申請(qǐng)中，所述待測(cè)品稀釋倍數(shù)優(yōu)選為50倍，如精密量取待測(cè)品2mL，置于100mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，得到稀釋后的待測(cè)品。本申請(qǐng)實(shí)施例精密量取稀釋后的待測(cè)品1mL，置于10mL具塞試管中。
得到稀釋后的待測(cè)品后，本申請(qǐng)實(shí)施例加入茚三酮溶液進(jìn)行反應(yīng)，得到預(yù)處理的待測(cè)品；同時(shí)將所述丙氨酸對(duì)照品溶液與所述茚三酮溶液同樣進(jìn)行反應(yīng)，得到預(yù)處理的對(duì)照品。
本申請(qǐng)加入茚三酮溶液，利用美洲大蠊溶液中總氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)進(jìn)行總氨基酸含量的檢測(cè)。在本申請(qǐng)的實(shí)施例中，所述茚三酮溶液為茚三酮乙二醇甲醚試液。本申請(qǐng)對(duì)所述茚三酮溶液的來源沒有特殊限制，具體的，所述茚三酮乙二醇甲醚試液的配制方法包括：取2.5g茚三酮，加入50mL乙二醇甲醚使溶解，另取濃度為0.01mol/L的氰化鉀溶液5mL，用乙二醇甲醚稀釋至250mL，將上述茚三酮乙二醇甲醚溶液和氰化鉀乙二醇甲醚溶液這兩種溶液混勻，放置24小時(shí)即得試液，所述試液在2℃～8℃于暗處保存，儲(chǔ)存一周待用；所述茚三酮乙二醇甲醚試液的用量可為3mL。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所述稀釋后的待測(cè)品與茚三酮溶液的反應(yīng)在緩沖液和抗壞血酸溶液存在的條件下進(jìn)行，得到預(yù)處理的待測(cè)品。其中，所述抗壞血酸溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為1％，用量?jī)?yōu)選為0.1mL。
所述緩沖液一般不含與茚三酮反應(yīng)的基團(tuán)如胺基等，且所述緩沖液的pH值優(yōu)選為5～7；所述緩沖液優(yōu)選自磷酸鹽緩沖液、鄰苯二甲酸鹽緩沖液或枸櫞酸類緩沖液如枸櫞酸緩沖液。在本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施例中，所述緩沖液的pH值為5，濃度可為0.2mol/L，用量可為1mL。
在本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施例中，所述緩沖液為磷酸二氫鉀-氫氧化鈉溶液，pH值為6.8，配制方法可為：把25mL 0.2mol/L的磷酸二氫鉀與23.6mL 0.1mol/L氫氧化鈉混合均勻，加水稀釋至100mL。在本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施例中，所述緩沖液為pH值為5的磷酸鹽緩沖液，配制方法可為：取0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液一定量，用氫氧化鈉試液調(diào)節(jié)pH值至5，即得。在本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施例中，所述緩沖液為pH值為5.6的鄰苯二甲酸鹽緩沖液，配制方法可為：取鄰苯二甲酸氫鉀10g，加水900mL，攪拌使溶解，用氫氧化鈉試液(必要時(shí)用稀鹽酸)調(diào)節(jié)pH值至5.6，加水稀釋至1000mL，混勻，即得。在本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施例中，所述緩沖液為pH值為5.8的磷酸鹽緩沖液，配制方法可為：取磷酸二氫鉀8.34g與磷酸氫二鉀0.87g，加水使溶解成1000mL，即得。在本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施例中，所述緩沖液為pH值為5的枸櫞酸緩沖液，濃度為0.2mol/L，用量為1mL。在本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施例中，所述緩沖液為pH值為6.2的枸櫞酸鹽緩沖液，配制方法可為：取枸櫞酸4.2g，加1mol/L的20％乙醇制氫氧化鈉溶液40mL使溶解，再用20％乙醇稀釋至100mL，即得；或者，取2.1％枸櫞酸水溶液，用50％氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.2，即得。在本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施例中，所述緩沖液為pH值為6.5的磷酸鹽緩沖液，配制方法可為：取磷酸二氫鉀0.68g，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液15.2mL，用水稀釋至100mL，即得。在本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施例中，所述緩沖液為pH值為6.6的磷酸鹽緩沖液，配制方法可為：取磷酸二氫鈉1.74g、磷酸氫二鈉2.7g與氯化鈉1.7g，加水使溶解成400mL，即得。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所述稀釋后的待測(cè)品與茚三酮溶液的反應(yīng)通過在沸水浴中加熱實(shí)現(xiàn)，加熱一定時(shí)間后取出反應(yīng)容器，放冷，得到預(yù)處理的待測(cè)品。所述沸水浴為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，溫度為98℃～100℃；所述加熱的時(shí)間優(yōu)選為15min。
本申請(qǐng)實(shí)施例精密量取所述丙氨酸對(duì)照品溶液，與稀釋后的待測(cè)品同時(shí)同法操作，如同時(shí)將所述丙氨酸對(duì)照品溶液與所述茚三酮溶液同樣進(jìn)行反應(yīng)，得到預(yù)處理的對(duì)照品。在此，對(duì)得到預(yù)處理的對(duì)照品的過程不作贅述。
得到預(yù)處理的待測(cè)品和預(yù)處理的對(duì)照品后，本申請(qǐng)實(shí)施例分別再加入乙醇溶液，搖勻，按照紫外分光光度法檢測(cè)，分別得到570nm波長(zhǎng)處的待測(cè)品吸收度和對(duì)照品吸收度；最后按照式1所示公式計(jì)算，即得美洲大蠊溶液中總氨基酸含量。
在本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施例中，所述乙醇溶液的質(zhì)量濃度為80％，用量可為3mL。紫外(可見光)分光光度法，是根據(jù)物質(zhì)分子對(duì)波長(zhǎng)為200nm～760nm這一范圍的電磁波的吸收特性所建立起來的一種定性、定量和結(jié)構(gòu)分析方法。本申請(qǐng)采用紫外分光光度法，利用氨基酸濃度與570nm波長(zhǎng)的紫外吸收度具有良好的線性關(guān)系，通過單點(diǎn)對(duì)照品比較法檢測(cè)美洲大蠊溶液中總氨基酸含量。本申請(qǐng)對(duì)所述紫外分光光度法檢測(cè)沒有特殊限制，在570nm波長(zhǎng)處同時(shí)同法測(cè)得待測(cè)品和對(duì)照品的吸收度即可。
得到待測(cè)品和對(duì)照品的吸收度，本申請(qǐng)按照式1所示公式計(jì)算，得到美洲大蠊溶液中總氨基酸含量；
美洲大蠊溶液待測(cè)品總氨基酸含量＝丙氨酸對(duì)照品溶液濃度/對(duì)照品吸收度*待測(cè)品吸收度*待測(cè)品稀釋倍數(shù)式1。式1中“*”代表乘號(hào)。
本申請(qǐng)?zhí)峁┑臋z測(cè)方法可適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)具體的總氨基酸含量，操作簡(jiǎn)便，能大大減少檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)其精密度和重復(fù)性等都符合生產(chǎn)對(duì)總氨基酸含量檢測(cè)的要求。
為了進(jìn)一步理解本申請(qǐng)，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本申請(qǐng)?zhí)峁┑拿乐薮篌谷芤褐锌偘被岷康臋z測(cè)方法進(jìn)行具體地描述。
以下實(shí)施例所用丙氨酸對(duì)照品的來源為中國(guó)藥品生物制品鑒定所(140680-201002)，含量為100.0％；康復(fù)新液及康復(fù)新液半成品均為湖南科倫制藥有限公司生產(chǎn)；紫外分光光度儀型號(hào)為TU-1950(北京普析公司)；所用的茚三酮乙二醇甲醚試液的配制方法包括：取2.5g茚三酮，加入50mL乙二醇甲醚使溶解，另取濃度為0.01mol/L的氰化鉀溶液5mL，用乙二醇甲醚稀釋至250mL，將上述茚三酮乙二醇甲醚溶液和氰化鉀乙二醇甲醚溶液這兩種溶液混勻，放置24小時(shí)即得試液，所述試液在2℃～8℃于暗處保存，儲(chǔ)存一周待用。
實(shí)施例1精密度試驗(yàn)
精密稱取丙氨酸對(duì)照品16mg，置于100mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻；再精密量取稀釋后的對(duì)照品5mL，置于100mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為16μg/mL的丙氨酸對(duì)照品溶液。
精密量取康復(fù)新液(M140941)待測(cè)品2mL，取10份(1份做1次試驗(yàn))，分別置于100mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻；分別精密量取稀釋后的待測(cè)品1mL，置于10mL具塞試管中，依次加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液(pH5.0)1.0mL、1％抗壞血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚試液3.0mL，搖勻，置于沸水浴中加熱15分鐘，取出，放冷；再加入80％乙醇3.0mL，搖勻，按照紫外分光光度法試驗(yàn)，在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。
精密量取所述丙氨酸對(duì)照品溶液1mL，置于10mL具塞試管中，與稀釋后的待測(cè)品同時(shí)同法操作，測(cè)定吸收度。
按照式1所示公式計(jì)算，得到所述康復(fù)新液中總氨基酸(以丙氨酸計(jì))含量，結(jié)果參見表1和圖1，表1為本申請(qǐng)實(shí)施例提供的檢測(cè)方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果，圖1為本申請(qǐng)實(shí)施例提供的檢測(cè)方法的精密度試驗(yàn)折線圖。
表1本申請(qǐng)實(shí)施例提供的檢測(cè)方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果
用格魯布斯法對(duì)表1和圖1中數(shù)據(jù)進(jìn)行取舍，十次測(cè)定平均值為0.81992mg/mL，極差為0.0171，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.00601，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.73％。
檢驗(yàn)最大值：T＝(0.8277-0.81992)/0.00601＝1.29；
檢驗(yàn)最小值：T＝(0.81992-0.8106)/0.00601＝1.55；
查表可知，T0.99,10＝3.25；
因最大值、最小值的T均符合T＜T0.99,10，故最大、最小值應(yīng)保留，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。計(jì)算結(jié)果包括：
本發(fā)明實(shí)施例提供的檢測(cè)方法的精密度為：RSD＝0.73％；
根據(jù)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果，查測(cè)定次數(shù)n＝10；
顯著性水平α＝0.01(置信度為99％)；
置信系數(shù)T＝3.17；
單次測(cè)量值的置信界限為：X±TS＝0.81992±0.01905；
根據(jù)單次測(cè)量值置信范圍，確定相對(duì)誤差標(biāo)準(zhǔn)為：
TS/X＝±0.01905/0.81992*100％＝±2.3％。
由此可知，本申請(qǐng)具有99％的把握，兩次平行測(cè)定的數(shù)據(jù)的相對(duì)誤差不超過2.3％。
實(shí)施例2回收率試驗(yàn)
精密量取康復(fù)新液(M140516)待測(cè)品2mL，置于100mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻；精密量取稀釋后的待測(cè)品1mL，置于10mL具塞試管中，依次加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液(pH5.0)1.0mL、1％抗壞血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚試液3.0mL，搖勻，置于沸水浴中加熱15分鐘，取出，放冷；再加入80％乙醇3.0mL，搖勻，按照紫外分光光度法試驗(yàn)，在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。
精密量取濃度為16μg/mL的丙氨酸對(duì)照品溶液1mL，置于10mL具塞試管中，與稀釋后的待測(cè)品同時(shí)同法操作，測(cè)定吸收度。按照式1所示公式計(jì)算，得到所述康復(fù)新液中總氨基酸(以丙氨酸計(jì))含量。
將測(cè)得總氨基酸含量的康復(fù)新液M140604(含量為0.80mg/mL)作溶劑，取9份(編號(hào)為1至9)，每份100mL，分別溶解、稀釋不同質(zhì)量的丙氨酸對(duì)照品，再采用上述紫外分光光度法測(cè)定并推算出對(duì)照品的實(shí)測(cè)質(zhì)量。結(jié)果參見表2，表2為本申請(qǐng)實(shí)施例提供的檢測(cè)方法的回收率試驗(yàn)結(jié)果。
表2本申請(qǐng)實(shí)施例提供的檢測(cè)方法的回收率試驗(yàn)結(jié)果
實(shí)測(cè)量指除去試樣測(cè)量值后的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)實(shí)測(cè)量，所述試樣測(cè)量值為0.80mg/mL。
對(duì)表2準(zhǔn)確度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析結(jié)果包括：平均回收率為100.58％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.94％，達(dá)到生產(chǎn)對(duì)檢驗(yàn)的精度要求；回收率在98.0％～102.0％之間。由此可知，本申請(qǐng)實(shí)施例提供的檢測(cè)方法準(zhǔn)確度良好。
實(shí)施例3
精密稱取丙氨酸對(duì)照品16mg，置于100mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻；再精密量取稀釋后的對(duì)照品5mL，置于100mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為16μg/mL的丙氨酸對(duì)照品溶液。
精密量取康復(fù)新液(M140516)待測(cè)品2mL，置于100mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻；精密量取稀釋后的待測(cè)品1mL，置于10mL具塞試管中，依次加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液(pH5.0)1.0mL、1％抗壞血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚試液3.0mL，搖勻，置于沸水浴中加熱15分鐘，取出，放冷；再加入80％乙醇3.0mL，搖勻，按照紫外分光光度法試驗(yàn)，在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。
精密量取所述丙氨酸對(duì)照品溶液1mL，置于10mL具塞試管中，與稀釋后的待測(cè)品同時(shí)同法操作，測(cè)定吸收度。按照式1所示公式計(jì)算，得到所述康復(fù)新液中總氨基酸(以丙氨酸計(jì))含量。
按照上述方法，由兩名檢驗(yàn)員分別檢驗(yàn)上述康復(fù)新液待測(cè)品，檢驗(yàn)10次，結(jié)果參見表3，表3為本發(fā)明實(shí)施例對(duì)康復(fù)新液M140516和M140627的檢測(cè)結(jié)果。
實(shí)施例4
按實(shí)施例3的檢測(cè)方法，由所述兩名檢驗(yàn)員分別檢驗(yàn)康復(fù)新液(M140627)待測(cè)品，檢驗(yàn)10次，結(jié)果參見表3。
表3本發(fā)明實(shí)施例對(duì)康復(fù)新液M140516和M140627的檢測(cè)結(jié)果
對(duì)表3檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析結(jié)果參見表4，表4為本發(fā)明實(shí)施例對(duì)康復(fù)新液M140516和M140627檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。
表4本發(fā)明實(shí)施例對(duì)康復(fù)新液M140516和M140627檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果
從上述數(shù)據(jù)看出：本申請(qǐng)實(shí)施例檢測(cè)數(shù)據(jù)均能符合≤2.3％的相對(duì)誤差要求，RSD均符合生產(chǎn)的精密度要求，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)平均每個(gè)樣品測(cè)定時(shí)間為25min。
實(shí)施例5
精密量取批號(hào)為M140604的康復(fù)新液半成品待測(cè)品2mL，置于100mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻；精密量取稀釋后的待測(cè)品1mL，置于10mL具塞試管中，依次加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液(pH5.0)1.0mL、1％抗壞血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚試液3.0mL，搖勻，置于沸水浴中加熱15分鐘，取出，放冷；再加入80％乙醇3.0mL，搖勻，按照紫外分光光度法試驗(yàn)，在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，其結(jié)果為0.4755。
精密量取濃度為0.016mg/mL的丙氨酸對(duì)照品溶液1mL，置于10mL具塞試管中，與稀釋后的待測(cè)品同時(shí)同法操作，測(cè)定吸收度，其結(jié)果為0.4730。
按照式1所示公式計(jì)算：
半成品待測(cè)品總氨基酸含量＝0.016/0.4730*0.4755*50＝0.80mg/mL；
所述康復(fù)新液半成品中總氨基酸(以丙氨酸計(jì))含量為0.80mg/mL，符合不少于0.77mg/mL的規(guī)定。所述半成品檢測(cè)含量合格，可灌裝成成品。
實(shí)施例6
精密量取批號(hào)為M140516的康復(fù)新液(已知濃度為0.81mg/mL)0.5mL、1mL、2mL、4mL、6mL，分別置于100mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，分別制成待測(cè)樣品溶液①～⑤；分別精密量取稀釋后的待測(cè)品1mL，置于10mL具塞試管中，依次加入0.2mol/L枸櫞酸緩沖液(pH5.0)1.0mL、1％抗壞血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚試液3.0mL，搖勻，置于沸水浴中加熱15分鐘，取出，放冷；再加入80％乙醇3.0mL，搖勻，按照紫外分光光度法試驗(yàn)，在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。
精密量取濃度為0.004mg/mL、0.008mg/mL、0.016mg/mL、0.032mg/mL、0.048mg/mL的丙氨酸對(duì)照品溶液1mL，置于10mL具塞試管中，與稀釋后的待測(cè)品同時(shí)同法操作，測(cè)定吸收度，并按照式1所示公式計(jì)算計(jì)算待測(cè)品含量，結(jié)果如表5：
表5本發(fā)明實(shí)施例采用不同濃度對(duì)照品溶液檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果
從上述數(shù)據(jù)看出：當(dāng)對(duì)照品濃度為0.016mg/mL時(shí)，檢測(cè)值與樣品已知濃度最為接近。
由以上實(shí)施例可知，本申請(qǐng)采用單點(diǎn)對(duì)照品比較法檢測(cè)得到美洲大蠊溶液(如康復(fù)新液成品和半成品)中總氨基酸含量，耗時(shí)在30min以內(nèi)。本申請(qǐng)?zhí)峁┑臋z測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，能大大減少檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)其精密度和重復(fù)性等都符合生產(chǎn)對(duì)總氨基酸含量檢測(cè)的要求。