本發(fā)明屬于細(xì)菌微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種對(duì)金黃色葡萄球菌IV種AIPs信號(hào)分子同時(shí)進(jìn)行檢測的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法。

背景技術(shù)：

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜技術(shù)在食品安全檢測中發(fā)揮著越來越大的作用，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)具有傳統(tǒng)方法無法比擬的優(yōu)勢，既發(fā)揮了現(xiàn)代色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力，又應(yīng)用了質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度以及能夠準(zhǔn)確提供化合物的分子量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)。在食品研究領(lǐng)域，液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)不僅能夠靈敏的檢測出食物中藥物的殘留和添加劑由于加工過程發(fā)生化學(xué)變化所產(chǎn)生的有害物質(zhì)，還可以用來檢測微生物自身分泌的生物毒素等。有研究報(bào)道，馮峰等利用液相色譜串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜技術(shù)在葡萄酒中檢測出了14種違規(guī)的食品添加劑，他所建立的方法檢測限在0.01～1.0μg/mL，回收率達(dá)到93.8％～106％。

近年來人們發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌在增殖過程中能產(chǎn)生某些可以作為化學(xué)信號(hào)在細(xì)菌細(xì)胞間傳遞信息的物質(zhì)，當(dāng)這種信號(hào)分子的濃度達(dá)到一定的閾值濃度時(shí)，它能夠激活或抑制一些目的基因的表達(dá)，從而對(duì)細(xì)菌的生理學(xué)功能進(jìn)行調(diào)控。這種細(xì)菌之間通過信號(hào)分子交流來共同完成一些重要的生理功能的現(xiàn)象稱為群體感應(yīng)效應(yīng)(quorum sensing,Qs)(Miller)，AIPs信號(hào)分子是金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)在群體感應(yīng)系統(tǒng)中起到傳遞信息的一類物質(zhì)，是一種自誘導(dǎo)肽，根據(jù)編碼的不同包括四種結(jié)構(gòu)形式，分別為AIP-I、AIP-II、AIP-III、AIP-IV，如圖1所示；Hiyas等的研究是利用UHPLC技術(shù)對(duì)S.aureus所產(chǎn)生的AIP-I信號(hào)分子進(jìn)行檢測，檢測限達(dá)到0.25μM，然而，Hiyas所用的菌株并非是來源于中國的食物中毒菌株，且其僅研究了AIP-I號(hào)分子的檢測方法，是不足以滿足對(duì)金黃色葡萄球菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究，并且，本申請(qǐng)的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)同一株金黃色葡萄球菌在整個(gè)生長過程中只能產(chǎn)生一種AIP信號(hào)分子，要研究不同菌株的群體感應(yīng)必須建立一種可以同時(shí)檢測四種AIPs分子的方法；此外，S.aureus所產(chǎn)生的AIPs信號(hào)分子，在群體感應(yīng)中起著調(diào)控菌體之間互相感知并產(chǎn)生生理功能和生物毒素的作用，在一定程度上調(diào)控著金黃色葡萄球菌腸毒素和生物膜的產(chǎn)生，而腸毒素和生物膜是給食品微生物安全帶來隱患的主要原因，因此建立一種快速及時(shí)并能對(duì)IV種AIPs分子同時(shí)進(jìn)行檢測的方法，來實(shí)現(xiàn)早期對(duì)毒素和生物膜的產(chǎn)生進(jìn)行檢測是十分必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述背景技術(shù)中所述的現(xiàn)有的對(duì)S.aureus所產(chǎn)生的AIPs信號(hào)分子進(jìn)行檢測的缺陷，實(shí)現(xiàn)早期對(duì)毒素和生物膜的產(chǎn)生進(jìn)行檢測，保證食品微生物安全，本發(fā)明提出了一種對(duì)金黃色葡萄球菌IV種AIPs信號(hào)分子同時(shí)進(jìn)行檢測的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法。

本發(fā)明的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法的具體技術(shù)方案在于：

本發(fā)明要求保護(hù)一種金黃色葡萄球菌IV種AIPs信號(hào)分子同時(shí)進(jìn)行檢測的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法，其特征在于，

包括以下步驟：

(1)標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

a.按照1：1～1：1.5的體積比將乙腈溶液和含0.1～0.15％甲酸的水溶液均勻混合，作為溶劑用；

b.分別準(zhǔn)確稱取一定量的IV種AIPs分子標(biāo)準(zhǔn)品，放入同一容量瓶中并使用上述溶劑進(jìn)行定容，使得溶液中各單質(zhì)的質(zhì)量濃度為10mg/mL，4℃避光貯存?zhèn)溆茫辉趯?shí)驗(yàn)前按照梯度稀釋的方法，用所述溶劑作為稀釋液對(duì)存儲(chǔ)液進(jìn)行稀釋，得到濃度分別為4.0mg/mL、2.0mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)工作液；

(2)液質(zhì)聯(lián)用檢測方法的建立

使用步驟(1)所配置的標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用檢測方法的建立，根據(jù)得到的AIPs分子的色譜峰圖，確定液相色譜和質(zhì)譜條件如下：

a.液相色譜條件：水相為含體積比0.1～0.2％甲酸的水溶液；有機(jī)相為含體積比0.1％～0.2％甲酸的乙腈溶液；色譜柱型號(hào)：SHIM-PACK XR-ODS 3.0mm×75mm,2.2μm；進(jìn)樣量：10～30μL；柱溫：30℃；流速：0.3mL/min；采用梯度洗脫的方式，在10～13min內(nèi)，水相從80％變化到30％；

b.質(zhì)譜條件：在電噴霧電離正離子檢測模式下(ESI+)，采用多反應(yīng)監(jiān)測的質(zhì)譜掃描模式(MRM)；離子源溫度為500℃；電噴霧電壓為4400V；氣簾氣壓力為10psi；霧化氣壓力為50psi；同時(shí)監(jiān)測了IV種目標(biāo)物，其中IV種AIPs信號(hào)分子的保留時(shí)間均在4.60min～6.60min之間；去簇電壓在130～150V之間；射入電壓在8～11V之間；碰撞電壓在40～45V之間；碰撞室電壓在18～20V之間。

本發(fā)明液質(zhì)聯(lián)用檢測方法的優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述步驟(2)中的液相色譜條件中：水相為含體積比0.1％甲酸的水溶液；有機(jī)相為含體積比0.1％甲酸的乙腈溶液。

本發(fā)明液質(zhì)聯(lián)用檢測方法的進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述步驟(2)建立的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法對(duì)金黃色葡萄球菌IV種AIPs分子同時(shí)進(jìn)行檢測可達(dá)到的最低檢測限范圍是0.001mg/L～0.006mg/L。

另外，本發(fā)明還提供了一種對(duì)其金黃色葡萄球菌IV種AIPs信號(hào)分子同時(shí)進(jìn)行檢測的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法的應(yīng)用，其用于對(duì)細(xì)菌發(fā)酵液中的AIPs分子的檢測。

優(yōu)選地，其中，細(xì)菌發(fā)酵液中AIPs分子的提取采用下述8種抽提方法任一方法進(jìn)行提取，該所述的抽提方法具體為a1～a8所述：

a1：向發(fā)酵液中加入適量甲酸，使混合液的pH值為2.5，混合均勻后靜置10min，而后低速離心4000rpm/min離心5min，去掉菌體取上清液進(jìn)行過濾，濾液裝入2mL的進(jìn)樣瓶中等待測定；

a2：向發(fā)酵液中加入0.1％的吐溫80，同樣靜置10min后離心過濾待測；

a3：發(fā)酵液裝入玻璃管中超聲提取10s后無需等待即可低速離心去菌體后過濾待測；

a4：用甲酸將發(fā)酵液的pH調(diào)到2.5后，加入0.1％的吐溫80，混合均勻靜置10min后離心過濾；

a5：用甲酸將發(fā)酵液的pH調(diào)到2.5以后，超聲波處理10s后離心過濾；

a6：向發(fā)酵液中加入0.1％的吐溫80并混合均勻后進(jìn)行10s的超聲波處理，后離心過濾；

a7：向發(fā)酵液中加入0.1％的吐溫80并用甲酸溶液將pH調(diào)到2.5后，超聲處理10s再進(jìn)行離心過濾；

a8：發(fā)酵液不經(jīng)過任何處理，直接用低速離心機(jī)去菌體后取上清過濾。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述AIPs分子的8種抽提方法中優(yōu)選采用a8方法，即發(fā)酵液不經(jīng)過任何處理，直接用低速離心機(jī)去菌體后取上清過濾。

更進(jìn)一步優(yōu)選地，其中細(xì)菌發(fā)酵液中AIPs分子的提取時(shí)間為：在轉(zhuǎn)速為180～200rpm/min的培養(yǎng)條件下，第12～20h進(jìn)行提取。

最進(jìn)一步優(yōu)選地，上述的提取時(shí)間為第12h。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明建立了金黃色葡萄球菌IV種AIPs信號(hào)分子同時(shí)進(jìn)行檢測的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法。本發(fā)明方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確且樣品的前處理方法簡便易操作，避免了二次污染，提高了檢測的準(zhǔn)確度，使用該方法可以在10min內(nèi)完成對(duì)金黃色葡萄球菌IV種AIPs信號(hào)分子的分離與檢測。本發(fā)明的方法的IV種AIPs信號(hào)分子在0.1～4.0mg/L范圍內(nèi)均具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.996。在0.2mg/L、1.0mg/L和2.0mg/L的添加水平下，實(shí)際樣品中IV種AIPs信號(hào)分子的回收率在65.7％～122.3％之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n＝6)在1.2％～13.7％之間，方法的最低檢測限達(dá)到0.001mg/L，可以滿足對(duì)金黃色葡萄球菌IV種AIPs信號(hào)分子的定性與定量分析，為食品安全監(jiān)測提供一種可靠的檢測方法。

附圖說明

圖1為金黃色葡萄球菌AIPs信號(hào)分子的四種不同結(jié)構(gòu)形式；

圖2為四種AIPs分子標(biāo)準(zhǔn)品在正離子模式下的色譜圖；

圖3為四種AIPs分子樣品在正離子模式下的色譜圖；

圖4為不同抽提方法下提取的AIPs分子的產(chǎn)量；

圖5為不同提取時(shí)間下提取的AIPs分子的產(chǎn)量。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好的理解本發(fā)明。

1.材料

方法學(xué)研究實(shí)驗(yàn)的樣本來自于本實(shí)驗(yàn)室前期調(diào)查的金黃色葡萄球菌樣本。

(1)儀器：本實(shí)施例所用儀器詳見表1。

表1儀器設(shè)備表

(2)試劑耗材：乙腈(色譜純)、甲酸、吐溫80購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白大豆瓊脂(TSA)和胰蛋白大豆肉湯(TSB)購自北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司；氯化鈉、葡萄糖、蔗糖、氫氧化鈉均購自西安化學(xué)試劑廠。液相色譜進(jìn)樣瓶(2mL)和注射器(3mL)購自陜西楊凌小白試劑公司；醋酸纖維素一次性針頭濾器(0.2μm，賽多利斯)購自西安熱默爾生物公司。

(3)標(biāo)準(zhǔn)品：本實(shí)施例中四種金黃色葡萄球菌群體感應(yīng)信號(hào)分子(AIPs)標(biāo)準(zhǔn)品均由上?？齐纳锛夹g(shù)有限公司合成，純度≥90％。

2.方法

本發(fā)明提出的對(duì)IV種金黃色葡萄球菌AIPs信號(hào)分子的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法如下：

(1)標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

a.按照1：1的體積比將乙腈溶液和含0.1％甲酸的水溶液均勻混合，作為溶劑用；

b.分別準(zhǔn)確稱取一定量的IV種AIPs分子標(biāo)準(zhǔn)品，放入同一容量瓶中并使用上述溶劑進(jìn)行定容，使得溶液中各單質(zhì)的質(zhì)量濃度為10mg/mL，4℃避光貯存?zhèn)溆茫辉趯?shí)驗(yàn)前按照梯度稀釋的方法，用所述溶劑作為稀釋液對(duì)存儲(chǔ)液進(jìn)行稀釋，得到濃度分別為4.0mg/mL、2.0mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)工作液；

(2)液質(zhì)聯(lián)用檢測方法的建立

使用步驟(1)所配置的標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用檢測方法的建立，根據(jù)得到的AIPs分子的色譜峰圖，確定液相色譜和質(zhì)譜條件如下：

a.液相色譜條件：水相為含體積比0.1％甲酸的水溶液；有機(jī)相為含體積比0.1％甲酸的乙腈溶液；色譜柱型號(hào)：SHIM-PACK XR-ODS 3.0mm×75mm,2.2μm；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30℃；流速：0.3mL/min；采用梯度洗脫的方式；梯度洗脫程序詳見表2。

表2流動(dòng)相及梯度洗脫條件

為了增加峰的強(qiáng)度，優(yōu)選使用含0.1％甲酸的乙腈溶液作為有機(jī)相；含0.1％甲酸的水溶液作為水相，而后確定了0.1％甲酸乙腈溶液和0.1％甲酸水溶液流動(dòng)相體系的最佳洗脫比，在這一洗脫程序下，IV種信號(hào)分子均可獲得較好的分離和峰形；

b.質(zhì)譜條件：在電噴霧電離正離子檢測模式下(ESI+)，采用多反應(yīng)監(jiān)測的質(zhì)譜掃描模式(MRM)；離子源溫度為500℃；電噴霧電壓為4400V；氣簾氣壓力為10psi；霧化氣壓力為50psi；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式優(yōu)化各種質(zhì)譜參數(shù)，其中優(yōu)化得到色譜、質(zhì)譜條件見表3。

表3不同樣品的最優(yōu)化MS/MS參數(shù)

注：DP：去簇電壓；EP：射入電壓；CE：碰撞電壓；CXP：碰撞室射出電壓；

多反應(yīng)監(jiān)測模式下四種AIPs信號(hào)分子所測得的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的峰圖如圖2和圖3所示，其中，A表示AIP-II號(hào)分子，分子量是879.7；B表示AIP-I號(hào)分子，分子量是961.5；C表示AIP-III號(hào)分子，分子量是819.6；D表示AIP-IV號(hào)分子，分子量是1009.7。

進(jìn)一步，對(duì)上述建立的金黃色葡萄球菌IV種AIPs信號(hào)分子同時(shí)進(jìn)行檢測的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法進(jìn)行應(yīng)用，使其用于對(duì)細(xì)菌發(fā)酵液中的AIPs分子的檢測。

在此，本申請(qǐng)的發(fā)明人針對(duì)不同的提取方法還選用了三株不同的菌株來進(jìn)行測驗(yàn)，每個(gè)抽提方法做三個(gè)實(shí)驗(yàn)平行，來分析不同的抽提方法對(duì)AIPs分子的回收率的影響(結(jié)果如圖4所示)，其試驗(yàn)表明，不同的抽提條件對(duì)AIPs分子的回收率影響并不顯著，因此，本研究的后續(xù)優(yōu)選將采用第八種(即a8)方法，即直接對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心過濾回收，以提高效率；細(xì)菌發(fā)酵液中AIPs分子的提取采用下述8種抽提方法任一方法進(jìn)行提?。?/p>

a1：向發(fā)酵液中加入適量甲酸，使混合液的pH值為2.5，混合均勻后靜置10min，而后低速離心4000rpm/min離心5min，去掉菌體取上清液進(jìn)行過濾，濾液裝入2mL的進(jìn)樣瓶中等待測定；

a2：向發(fā)酵液中加入0.1％的吐溫80，同樣靜置10min后離心過濾待測；

a3：發(fā)酵液裝入玻璃管中超聲提取10s后無需等待即可低速離心去菌體后過濾待測；

a4：用甲酸將發(fā)酵液的pH調(diào)到2.5后，加入0.1％的吐溫80，混合均勻靜置10min后離心過濾；

a5：用甲酸將發(fā)酵液的pH調(diào)到2.5以后，超聲波處理10s后離心過濾；

a6：向發(fā)酵液中加入0.1％的吐溫80并混合均勻后進(jìn)行10s的超聲波處理，后離心過濾；

a7：向發(fā)酵液中加入0.1％的吐溫80并用甲酸溶液將pH調(diào)到2.5后，超聲處理10s再進(jìn)行離心過濾；

a8：發(fā)酵液不經(jīng)過任何處理，直接用低速離心機(jī)去菌體后取上清過濾；

對(duì)于提取時(shí)間的選擇，在轉(zhuǎn)速為180～200rpm/min的培養(yǎng)條件下，選擇第12h、16h和20h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行抽樣測定；在此本申請(qǐng)的發(fā)明人針對(duì)該不同的提取時(shí)間選取了15株菌株進(jìn)行測試(結(jié)果如圖5所示)，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)所試的15株菌株均是在第12h時(shí)抽提出的AIPs分子量最多，并且根據(jù)時(shí)間的增加呈下降趨勢，到第20h時(shí)量最少，為此，本發(fā)明優(yōu)選在培養(yǎng)至第12h時(shí)進(jìn)行抽提。

3.方法驗(yàn)證

(1)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖

IV種AIPs信號(hào)分子的標(biāo)準(zhǔn)品和金黃色葡萄球菌發(fā)酵樣品的峰形比較對(duì)稱，除了樣品中AIP-IV號(hào)分子無法良好檢測之外，其他峰形較好，無雜峰干擾，說明在此條件下能夠得到良好的檢測，圖2為IV種AIPs信號(hào)分子標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，圖3為樣品中IV種AIPs信號(hào)分子的色譜圖，可以發(fā)現(xiàn)LC-MS/MS的檢測足以滿足定量要求。

(2)校準(zhǔn)曲線

將配置好的標(biāo)準(zhǔn)工作液在上述方法下進(jìn)行檢測；其中，每組溶液分別進(jìn)樣10μL，以目標(biāo)分析物的質(zhì)譜信號(hào)峰面積(y)對(duì)質(zhì)量濃度(x)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到四種AIPs信號(hào)分子的線性方程和線性相關(guān)系數(shù)；并且得到檢測限和定量限。IV種AIPs信號(hào)分子在各自濃度范圍內(nèi)的線性擬合方程，線性良好，相關(guān)系數(shù)在0.996以上，檢測限在0.001mg/L～0.006mg/L之間，滿足定量要求，見表4。

表4線性關(guān)系、檢測限和定量限

(3)精密度與回收率試驗(yàn)

最后，為了對(duì)本發(fā)明所建立的對(duì)IV種AIPs分子同時(shí)進(jìn)行檢測的方法進(jìn)行驗(yàn)證，本申請(qǐng)的發(fā)明人以126號(hào)S.aureus菌株為試驗(yàn)菌株進(jìn)行精密度和回收率實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證該方法的可行性，經(jīng)過測定得知此菌株可以產(chǎn)生AIP-I號(hào)分子，目標(biāo)分析物的加標(biāo)水平分別為0.2mg/L、1.0mg/L和2.0mg/L，每一組濃度重復(fù)6次，每一種AIPs信號(hào)分子所測得的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和回收率各不相同，其中AIP-I號(hào)分子的RSD為2.7％～7.4％，回收率為65.7％～81.9％；AIP-II號(hào)分子的RSD為2.2％～7.3％，回收率為89.1％～105.4％；AIP-III號(hào)分子的RSD為1.2％～5.0％，回收率為86.3％～114.8％；AIP-IV號(hào)分子的RSD為3.0％～13.7％，回收率為117.8％～122.3％，詳見表5。

表5相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和加標(biāo)回收率

本發(fā)明通過對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)菌培養(yǎng)液中AIPs分子的提取研究，建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法定量分析了IV種AIPs分子的快速檢測方法，樣品的前處理方法簡便易操作，避免了二次污染，提高了檢測的準(zhǔn)確度，本發(fā)明的方法的最低檢測限達(dá)到0.001mg/L，回收率最高可達(dá)到122.3％，并且精密度和線性范圍均達(dá)到檢測的要求，可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要，為食品安全監(jiān)測建立了基礎(chǔ)。

另外，還需要說明的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體地實(shí)施方式或優(yōu)選的實(shí)施方式，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是本領(lǐng)域技術(shù)人員利用本申請(qǐng)文件的記載所作的等效結(jié)構(gòu)或等效變化，或直接或間接應(yīng)用在其它相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，其均同理包括在本發(fā)明專利申請(qǐng)的保護(hù)范圍內(nèi)。