技術(shù)特征：

1.基于多元技術(shù)的貝類血淋巴細(xì)胞分類方法，所述方法包括以下步驟：

步驟S1：血淋巴采集和總血球計(jì)數(shù)的步驟；采用注射器從貝類閉殼肌處抽取血淋巴，將收集的血淋巴液儲(chǔ)存于冰中以減少細(xì)胞自發(fā)性凝集，然后使用MultisizerTM3庫(kù)爾特顆粒計(jì)數(shù)儀進(jìn)行測(cè)定，以確定血淋巴中細(xì)胞的濃度和大小分布頻率；

步驟S2：細(xì)胞光學(xué)顯微鏡分析的步驟；將步驟S1種抽取的血淋巴進(jìn)行染色處理，經(jīng)玻片用中性樹膠封片劑封片，然后置于光學(xué)顯微鏡下觀察；

步驟S3：流式細(xì)胞術(shù)分析的步驟；從血淋巴液中新鮮采集的血淋巴細(xì)胞通過(guò)BD FACSCALIBUR流式細(xì)胞分析儀分析；

步驟S4：透射電鏡技術(shù)分析的步驟；將血淋巴細(xì)胞進(jìn)行處理配制成顆粒物，并把顆粒物處理配制成切片，經(jīng)透射電子顯微鏡檢查切片；

步驟S5：掃描電鏡技術(shù)分析的步驟；將血淋巴液滴加在載玻片上讓細(xì)胞粘附，并把粘附的細(xì)胞進(jìn)行沖洗、固定、脫水、干燥處理；

步驟S6：統(tǒng)計(jì)分析的步驟；進(jìn)行數(shù)據(jù)分析之前，所有數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0進(jìn)行Shapiro-Wilk's檢驗(yàn)檢查正態(tài)分布性，用Levene's檢驗(yàn)檢查方差齊性，百分比數(shù)據(jù)在分析前進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S1中血淋巴液的采集使用配有22G針頭的1mL注射器從貝類閉殼肌處抽取血淋巴，每個(gè)貽貝收集1mL血淋巴，為了減少個(gè)體差異，每次取6只貝的血淋巴液混合進(jìn)行分析，檢測(cè)時(shí)，將0.5mL血淋巴液加入到9.5mLII溶液中，每次檢測(cè)1000μL的混合溶液并計(jì)算其中的細(xì)胞個(gè)數(shù)，使用MultisizerTM3軟件分析數(shù)據(jù)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S2中染色處理的步驟為：貝類抽取血淋巴后，將50μL血淋巴液滴在Super Frost Plus載玻片上，血細(xì)胞在潮濕的環(huán)境中黏著在玻片上靜置20min后，將其浸泡于戊二醛溶液中固定20min，然后用曙紅亞甲基藍(lán)II染液，進(jìn)行染色6min，接著，將玻片轉(zhuǎn)移到Giemsa染液中浸泡染色30min，再用磷酸鹽緩沖液洗滌，直至流下的液體變透明為止，后于空氣中自然風(fēng)干。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S3中流式細(xì)胞分析儀裝備一個(gè)可以激發(fā)448nm激光的空氣制冷的氬激光器，檢測(cè)之前，首先對(duì)FSC閾值進(jìn)行設(shè)定，以消除細(xì)胞碎片和其他雜質(zhì)的干擾，為了減小偶然誤差，每個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)重復(fù)6次，取其平均值，細(xì)胞分布圖以細(xì)胞相對(duì)大小和粒度表示，并且熒光通道對(duì)應(yīng)于相應(yīng)的標(biāo)記，對(duì)于每個(gè)血細(xì)胞樣本，共獲得20000個(gè)項(xiàng)目，并且調(diào)整流量以保證總項(xiàng)目數(shù)低于300s-1，前向散射檢測(cè)器設(shè)定為E00，側(cè)向散射檢測(cè)器設(shè)定為380-420V，隨后得到血細(xì)胞群的熒光頻率分布柱狀圖，數(shù)據(jù)采用BD CellQuestTM Pro軟件分析。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S4具體為：取5ml貽貝的血淋巴細(xì)胞，4℃下在含4％多聚甲醛，2.5％戊二醛和0.3M(mol/L)蔗糖的0.1M二甲砷酸鹽緩沖液中固定10分鐘，吸出上清液，在室溫下以400g離心10分鐘，把顆粒物再懸浮然后嵌入進(jìn)3％瓊脂液中，把嵌入式細(xì)胞切成小塊，在4℃下浸入新鮮的隔夜固定液中，把細(xì)胞用二甲砷酸鹽緩沖液沖洗，在4℃下用含1％四氧化鋨的0.1M二甲砷酸鹽緩沖液固定一個(gè)小時(shí)，Osmicated樣本用相同的緩沖液和蒸餾水漂洗，在不同濃度的乙醇溶液中進(jìn)行脫水處理，轉(zhuǎn)移到丙酮溶液并在嵌入前在Spurr’s樹脂中逐漸滲透，用Leica Ultracut UCT超薄切片機(jī)制作超薄切片，置于火棉膠涂層，100目銅網(wǎng)上，切片用2％含水醋酸雙氧鈾染色15分鐘然后用雷諾檸檬酸鉛染色10分鐘，在80kV下用透射電子顯微鏡檢查切片。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S5具體為：把SuperFrost Plus顯微鏡載玻片切成小塊，取500ul含有1×106cells ml-1的血淋巴液滴加在載玻片上，并置于保濕室內(nèi)在室溫條件下靜置25min讓細(xì)胞粘附，粘附的細(xì)胞置入含4％多聚甲醛，2.5％戊二醛以及0.3M(mol/L)蔗糖的0.1M的二甲砷酸鹽緩沖液中2小時(shí)，隨后用0.1M的二甲砷酸鹽緩沖液進(jìn)行沖洗，再用含1％四氧化鋨的0.1M的二甲砷酸鹽緩沖液進(jìn)行固定，在不同濃度的乙醇溶液中進(jìn)行脫水處理，最后浸泡在丙酮中，脫水后的樣品在CO2環(huán)境中進(jìn)行干燥，置于鋁座上用BALTEC SCD 005Sputter Coater噴涂金-鈀層，用FEI/Philips XL30 Esem-FEG掃描電子顯微鏡調(diào)節(jié)于10kV觀察。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟S6使用student t檢驗(yàn)和單因素方差分析進(jìn)行分析檢驗(yàn)。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟S2中使用到的戊二醛溶液為2％濃度，無(wú)菌海水配制而成；步驟S2中使用到的曙紅亞甲基藍(lán)II染液為0.2mL曙紅溶液和2g亞甲基藍(lán)定容和100mL 95％酒精溶液配制而成；步驟S2的Giemsa染液的制作方法為：吉姆薩粉l.0g，甘油66mL，甲醇66mL，將Giemsa粉放入研缽中，先加入少量甘油，研磨至無(wú)顆粒為止，然后再將全部甘油倒入，放56℃溫箱中2h后，加入甲醇，將配制好的染液密封保存棕色瓶?jī)?nèi)，于0-4℃保存；步驟S2磷酸鹽緩沖液為136mmol/L NaCl,2.68mmol/L KCl,10.14mmol/L Na2HPO4,1.76mmol/L KH2PO4,pH 7.5。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟S4乙醇溶液不同濃度具體為30％,50％,70％,80％,95％和100％。

10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟S5乙醇溶液不同濃度具體為30％，50％，70％,，80％，95％和100％。