一種用于檢測乳鐵蛋白含量的適配體及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號：11107309閱讀：970來源：國知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>測量裝置的制造及其應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種使用熒光偏振法對乳鐵蛋白進行檢測的適配體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

熒光偏振技術(shù)作為一種簡單可靠的信號傳導(dǎo)手段，可以基于熒光基團的分子質(zhì)量的變化提供關(guān)于分子取向、遷移和作用過程的信息。熒光偏振分析法具有很多的優(yōu)勢：第一，它是一種均相分析方法且靈敏度高，無需分離等復(fù)雜操作，結(jié)果重現(xiàn)性好；第二，響應(yīng)時間快，可以實時監(jiān)測分子間相互作用；第三，可以與酶標(biāo)儀等儀器聯(lián)用，可以實現(xiàn)自動化高通量測定；第四，熒光偏振依賴于兩個垂直方向上的熒光強度的比值，與熒光絕對強度無關(guān)，熒光偏振值對熒光的波動及光漂白不敏感，從而成為在復(fù)雜生物樣品中均相測定目標(biāo)分子的理想分析方法。因此，熒光偏振技術(shù)在熒光傳感應(yīng)用中受到廣泛的研究關(guān)注。

乳鐵蛋白是一種極具廣闊市場前景的功能性蛋白，它主要存在于哺乳動物的乳汁中，其含量與動物的種屬息息相關(guān)，以人乳、牛乳為典型代表。研究表明，乳鐵蛋白具有多種生物學(xué)活性。它具有參與鐵代謝、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、阻斷氧自由基、免疫調(diào)節(jié)及抗炎癥、促進細胞增長、減少內(nèi)臟脂肪等多種功能。且由于乳鐵蛋白是一種可被嬰兒攝入的、安全極高的天然乳成分，其在日本被批準(zhǔn)為食品添加劑，在美國被納入一般認為安全物質(zhì)之中。加之，乳鐵蛋白廣泛的生物學(xué)功能深受國內(nèi)外食品相關(guān)企業(yè)的高度重視，在我國GB 14880—2012《食品營養(yǎng)強化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中，乳鐵蛋白也被列為一種新型營養(yǎng)強化劑并規(guī)定了其在相關(guān)乳制品中的含量標(biāo)準(zhǔn)。因而，能否建立快速準(zhǔn)確的乳鐵蛋白檢測技術(shù)對于食品安全來說至關(guān)重要。目前，適合不同類型生物樣品中乳鐵蛋白的檢測技術(shù)主要有分光光度法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效親和色譜法、高效毛細血管電泳法以及表面等離子共振技術(shù)等檢測技術(shù)，但這些方法依然存在前處理過程復(fù)雜、實際樣品回收率低、穩(wěn)定性差等特點，因此建立出一種能夠全面實現(xiàn)準(zhǔn)確、快速、無需對樣品進行前處理的全自動乳鐵蛋白檢測方法十分重要且緊迫。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于檢測乳鐵蛋白含量的適配體。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述適配體在檢測乳鐵蛋白中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種用于檢測乳鐵蛋白含量的適配體，所述適配體的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～65所示，所述的適配體優(yōu)選SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.35。

上述用于檢測乳鐵蛋白含量的適配體在檢測乳鐵蛋白中的應(yīng)用。

一種熒光偏振法測量陰性蛋白含量的方法，包括如下步驟：

(1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：向10μL、40nM～4000nM異硫氰酸熒光素標(biāo)記的適配體溶液中加入100μL不同濃度的陰性蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品，混勻，所述適配體的核苷酸序列為SEQ ID NO.1～61中的任一種，25℃～40℃下反應(yīng)5～120min，用酶標(biāo)儀檢測，激發(fā)波長為480nm，發(fā)射波長為528nm，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(2)樣品檢測：將異硫氰酸熒光素標(biāo)記的適配體與待測樣品混合，按照步驟(1)的條件檢測。

其中，所述異硫氰酸熒光素標(biāo)記的適配體的濃度為40nM～4000nM；

其中，所述待測樣品的濃度為0.78～50μg/mL。

其中，所述的陰性蛋白為乳鐵蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、BSA，優(yōu)選乳鐵蛋白。

有益效果：

本發(fā)明以FITC標(biāo)記的適配體為探針，通過乳鐵蛋白與探針的特異性結(jié)合使熒光偏振信號發(fā)生改變，且乳鐵蛋白濃度對數(shù)值與熒光偏振信號呈線性變化，從而實現(xiàn)對乳鐵蛋白的定量檢測。該種熒光偏振法靈敏度高，抗干擾性非常強，可以有效避免假陽性信號，實現(xiàn)對復(fù)雜樣品中目標(biāo)物的測量，如牛奶中乳鐵蛋白的測量，該方法檢測的線性范圍為0.78～50μg/mL。

附圖說明

圖1熒光偏振法反應(yīng)時間優(yōu)化圖。

圖2不同濃度乳鐵蛋白與熒光偏振信號關(guān)系圖。

圖3熒光偏振法對乳鐵蛋白特異性檢測圖。

圖4熒光偏振法對乳鐵蛋白檢測線性圖。

圖5其他適配體對乳鐵蛋白熒光偏振檢測線性圖。

具體實施方式

根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。

實施例1：乳鐵蛋白適配體篩選

乳鐵蛋白適配體篩選的具體步驟，包括芯片制備、正負篩過程、PCR擴增等詳細過程，具體如下所述，其中：

文庫：5′-TAMRA-GACAGGCAGGACACCGTAAC-N40-CTGCTACCTCCCTCCTCTTC-3′

TARMA修飾的前向引物：5′-TARMA-GACAGGCAGGACACCGTAAC-3′

生物素化的后向引物：5′Biotin-GAAGAGGAGGGAGGTAGCAG-3′

(1)芯片制備：利首先利光刻掩模與化學(xué)腐蝕相結(jié)合的技術(shù)制作微流控通道模板作為PDMS通道制做磨具；后稱取質(zhì)量比為10：1的PDMS前聚體與固化劑充分混合，抽真空后澆到微流控通道模板上經(jīng)固化后得到PDMS微流控通道；使用點樣儀在玻璃基片點制濃度為5mg/mL的乳鐵蛋白和陰性蛋白微陣列，并對PDMS和點樣后的玻璃基片同時等離子處理，之后緊密貼合共同作為篩選芯片，用于接下來的每輪篩選；篩選準(zhǔn)備：將步驟(1)得到的篩選芯片放入恒溫水浴箱中37℃下孵育蛋白2h；再通入20mg/mlBSA和0.01mM隨機序列短鏈ssDNA(20nt)在37℃條件下封閉1h；之后用150μL，1×PBST溶液清洗正負篩通道；

(2)第一輪篩選：將0.5nmol，125μL原始文庫在95℃加熱5min，并立即在冰上冷凍10s；再用注射泵以2.5μL/min流速將文庫輸進正篩通道，在常溫條件下反應(yīng)50min；之后以15μL/min流速通入150μL，1×PBS緩沖溶液以除去正篩通道中未結(jié)合的ssDNA序列；輕輕撕掉PDMS層，使用Luxscan～10K/A微陣列掃描儀掃描芯片；最后用DPEC水在95℃下加熱5min洗脫乳鐵蛋白結(jié)合的ssDNA序列，所得溶液在50℃條件下高純氮吹干至體積為69μL；

(3)PCR擴增過程：將步驟(2)所得溶液分為體積均為23μL的3份相同溶液，每份依次加入25μL，2×Taq聚合酶,1μL，20μM TAMRA標(biāo)記的前向引物和1μL，20μM生物素化的后向引物，混合均勻后進行PCR擴增；PCR的熱循環(huán)過程如下：94℃5min；循環(huán)94℃30s，60.5℃30s，72℃30s過程10輪，72℃5min終止反應(yīng)；該步驟獲得的產(chǎn)物稀釋10倍后作為模板進行再一次擴增：取5μL稀釋后PCR產(chǎn)物與25μL，2×SYBRPremix Ex Taq^TM酶,1μL，20μM TAMRA標(biāo)記的前向引物，1μL，20μM生物素化的后向引物以及18μL DPEC水充分混合均勻，PCR擴增每進行一輪便取10μL樣品至微孔板中用BioTek檢測其熒光信號，熒光信號最高者作為最佳輪數(shù)，剩余產(chǎn)物均擴增該輪數(shù)；

(4)分離純化：將步驟(4)得到的PCR產(chǎn)物與600μL Promega磁珠充分混勻，在搖床上快速搖動1h后除去上清液；再加入25μL，50mM NaOH渦旋5min將磁珠上連接的雙鏈解離；吸取上層清液并依次加入12.5μL 100mM HCl，25μL H₂O，62.5μL2×PBSM中和，所得的溶液作為下一輪篩選的次級文庫,其含量約為40pmol；

(5)第二輪篩選：用泵以2.5μL/min流速將文庫輸進負篩通道，在常溫條件下反應(yīng)50min；再用泵以2.5μL/min流速將文庫輸進正篩通道，在常溫條件下反應(yīng)50min；接著以15μL/min流速通入150μL 1×PBS緩沖溶液除去正篩通道中未反應(yīng)的鏈；輕輕撕掉PDMS層，使用Luxscan～10K/A微陣列掃描儀掃描芯片；最后用無核水在95℃下加熱5min洗脫蛋白結(jié)合的鏈，所得溶液在60℃吹干至體積為92μL，留作PCR擴增；

(6)重復(fù)步驟(4)、(5)、(6)至第八輪篩選；

(7)將篩選的第五、六、七輪PCR擴增產(chǎn)物送至上海生工測序，每輪隨機選取120條測序，再用IDT軟件對得到的鏈進行二級結(jié)構(gòu)分析，最終獲得最佳的適配體。

實施例2：熒光偏振法對乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品進行檢測：

(1)在10μL,250nM FITC(異硫氰酸熒光素)標(biāo)記的適配體N2(堿基序列：AGGCAGGACACCGTAACCGGTGCATCTATGGCTACTAGCTTTTCCTGCCT)溶液中加入100μL濃度為25μg/mL的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品，充分混勻。