本發(fā)明涉及甘蔗梢腐病檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是一種甘蔗葉片中赤霉素含量的HPLC檢測方法。
背景技術(shù)：
：甘蔗（Saccharumofficinarum)是我國最重要糖料作物，蔗糖占我國食糖總產(chǎn)92%。由于梢腐病逐漸表現(xiàn)出無區(qū)域性和無規(guī)律性等特點(diǎn)，導(dǎo)致該病對甘蔗產(chǎn)業(yè)的危害日趨嚴(yán)重。在巴西、印度、伊朗、馬來西亞以及我國等蔗區(qū)各類梢腐病癥狀層出不窮，尤其在高溫高濕季節(jié)容易暴發(fā)此病。據(jù)2012-2014年廣西甘蔗品種區(qū)域試驗(yàn)以及2013-2014年國家甘蔗品種區(qū)域試驗(yàn)調(diào)查，參試品種發(fā)病率達(dá)到100%。此病害可導(dǎo)致甘蔗株高顯著降低，產(chǎn)量減少5%～20%，糖分降低達(dá)3%。甘蔗在受到梢腐病病原侵染時，會產(chǎn)生一系列的防御反應(yīng)來保護(hù)自己，與此同時，病原真菌也會通過改變自身毒性或產(chǎn)生變異，由此影響甘蔗正常生理生化進(jìn)程，從而感染甘蔗并導(dǎo)致發(fā)病。赤霉素作為一種重要的植物內(nèi)源激素，其參與甘蔗生理代謝過程一個突出特點(diǎn)是促使蔗莖的伸長和蔗株增高。而甘蔗是以蔗莖作為收獲產(chǎn)品的作物，因此在生產(chǎn)中增加蔗株高度對于提高甘蔗產(chǎn)量是相當(dāng)重要的。但至今尚無建立高效、精確的甘蔗梢腐病葉片赤霉素含量檢測方法，鑒于我國甘蔗梢腐病發(fā)生逐漸加重的趨勢，因此建立一套快速有效的甘蔗梢腐病葉片赤霉素含量檢測方法對研究其介導(dǎo)甘蔗梢腐病病原菌脅迫應(yīng)答的生化機(jī)制具有非常重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對我國甘蔗梢腐病葉片赤霉素含量檢測方法的空白，本發(fā)明的目的在于提供一種簡便、快速、準(zhǔn)確的甘蔗葉片中赤霉素含量的HPLC檢測方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方法如下：一種甘蔗葉片中赤霉素含量的HPLC檢測方法，包括以下步驟：S1.待測的甘蔗葉片加入液氮磨碎，加入預(yù)冷至2~5℃的體積分?jǐn)?shù)為70~90%甲醇水溶液，2~5℃浸提10~20h，離心，取上清液，殘?jiān)偌尤腩A(yù)冷至2~5℃的體積分?jǐn)?shù)為70~90%甲醇水溶液浸提1~3h，離心后取出上清液，重復(fù)殘?jiān)岷碗x心操作0~3次，合并上清液，30~40℃下減壓蒸發(fā)至不含甲醇，加入石油醚萃取脫色2~5次，棄去上層有機(jī)相，下層水相在30~40℃下減壓蒸干，加入HPLC檢測所用流動相溶解，定容，過濾，作為樣品溶液備用；S2.采用HPLC檢測樣品溶液中赤霉素的含量。進(jìn)一步的，所述步驟S2中，HPLC色譜條件為：流動相由甲醇、超純水和乙酸按體積比200:300:3混合制成，柱溫為32~38℃，流速0.8~1.2ml/min，紫外檢測波長306nm。更進(jìn)一步的，HPLC色譜條件為：柱溫為35℃，流速1ml/min，進(jìn)樣量10μL。進(jìn)一步的，所述步驟S1中，所述待測的甘蔗葉片在冰盒下剪下。進(jìn)一步的，所述步驟S1中，待測的甘蔗葉片和殘?jiān)岵捎玫氖求w積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇水溶液。進(jìn)一步的，所述步驟S1中，待測的甘蔗葉片和殘?jiān)岬臏囟葹?℃。進(jìn)一步的，所述步驟S1中，待測甘蔗葉片采用甲醇水溶液進(jìn)行浸提，液固比為0.2~0.5g/mL。進(jìn)一步的，所述步驟S5中，加入流動相溶解后，采用0.45μm微孔濾膜進(jìn)行過濾。進(jìn)一步的，所述步驟S1中，待測的甘蔗葉片和殘?jiān)岵捎玫募状妓芤簽榧状?超純水溶液。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了以上所述的檢測方法在判斷甘蔗品種對梢腐病感性和抗性差異方面的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是：1）樣品前處理方法采用甲醇-超純水提取劑結(jié)合超聲波萃取法提取赤霉素；并通過石油醚脫色對樣品進(jìn)行提純；與其他方法相比，除雜效果好，提取時間短，待測樣品純凈度高。2）通過本發(fā)明HPLC色譜條件測量樣品溶液中赤霉素的含量，赤霉素能與其他有效成分較好地進(jìn)行分離，且樣品保留時間穩(wěn)定，具有更好的峰形，在具備高效液相色譜儀的實(shí)驗(yàn)室均能通過此法開展赤霉素含量檢測工作。3）本發(fā)明能檢測甘蔗處理前后葉片赤霉素含量變化，檢測結(jié)果表明：接種處理與正常生長的甘蔗葉片赤霉素含量存在顯著差異，且差異性趨勢增大；正常生長的甘蔗葉片中赤霉素含量會逐漸上升，接種處理的甘蔗葉片中赤霉素含量逐漸下降；該檢測結(jié)果為研究其介導(dǎo)甘蔗梢腐病病原菌脅迫應(yīng)答的生化機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。同時，該方法的推廣使用，對于篩選抗病品種和指導(dǎo)甘蔗抗病育種具有重要意義和現(xiàn)實(shí)作用。附圖說明圖1為赤霉素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。圖2a為標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測得到的色譜圖。圖2b為樣品溶液檢測得到的色譜圖。圖3為不同生長階段甘蔗接種樣品和甘蔗對照樣品中赤霉素含量的趨勢分析圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的闡述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不局限于實(shí)施例表示的范圍。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明的范圍。此外，在閱讀本發(fā)明的內(nèi)容后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種修改，這些等價變化同樣落于本發(fā)明所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1甘蔗葉片中赤霉素含量的HPLC檢測方法。S1.選取感染甘蔗梢腐病病原的甘蔗葉片作為待測樣品，取待測樣品2g加入液氮磨碎，加入10mL預(yù)冷至4℃的體積分?jǐn)?shù)80%甲醇水溶液，保鮮膜密封后于4℃浸提16h；然后于4℃條件下以8000r/min離心10min得上清液，殘?jiān)?mL預(yù)冷至4℃的體積分?jǐn)?shù)其80%甲醇水溶液浸提2h，離心10min后取出上清液，合并兩次上清液于40℃減壓蒸發(fā)至不含甲醇（約剩0.3mL水溶液），加入15mL石油醚萃取脫色3次，棄去上層有機(jī)相，下層水相40℃下減壓蒸干，加入0.5mLHPLC檢測所用流動相溶解，定容至2mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾于帶有內(nèi)襯管的樣品瓶內(nèi)，作為樣品溶液。S2.采用HPLC檢測樣品溶液中水楊酸的含量。S2-1.色譜條件：ARigolL3000高效液相色譜儀；色譜柱：KromasilC18反相色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：200mL甲醇和300mL超純水混合，加入3mL乙酸；柱溫：35℃；走樣時間為20min；流速：0.8mL/min；檢測波長：306nm；進(jìn)樣體積：10μL。S2-2.稱取赤霉素標(biāo)準(zhǔn)品1.25mg，加入10mL水溶解，配置成125μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液母液；然后用標(biāo)準(zhǔn)溶液母液再一次稀釋成濃度分別為25μg/mL、12.5μg/mL、1.25μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用S2-1的色譜條件檢測標(biāo)準(zhǔn)溶液母液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，其對應(yīng)峰面積分別為51.256、7.311、4.571、0.272；然后以峰面積為縱坐標(biāo)、以赤霉素濃度為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所述，由圖1可見，在所檢測范圍內(nèi)(1.25μg/mL～125μg/mL)，回歸方程式為y=0.4175x-1.2383，液相色譜峰面積與赤霉素濃度具有良好的線性關(guān)系(R2=0.9971)。S2-3.專屬性考察：分別取125μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液母液和樣品溶液注入液相色譜儀中，按照S2-1的色譜條件進(jìn)行檢測，赤霉素的保留時間為7.77min，標(biāo)準(zhǔn)溶液母液檢測結(jié)果見圖2a，樣品溶液檢測結(jié)果見圖2b。S2-4.加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)：分別向同一樣品溶液中添加1mL的濃度為10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、50μg/mL的赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照5.1的液相色譜條件檢測，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。表1赤霉素回收率測定結(jié)果S2-5.方法精密度試驗(yàn)：取濃度為1.25μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照S2-1的色譜條件檢測，連續(xù)進(jìn)樣5針觀察保留時間與峰面積，結(jié)果見表2。表2方法精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果編號保留時間（min）峰面積（μvsec）17.7681.35827.7521.34537.6431.32447.7181.29657.7351.320標(biāo)準(zhǔn)偏差0.0490.024相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.6291.801S2-6.S1獲得的樣品溶液分析。采用S2-1的色譜條件檢測，重復(fù)測定三次，得樣品的中赤霉素的含量為2.456μg/g。由本實(shí)施例可以看出，本方法的靈敏度、檢出限和精密度能夠滿足甘蔗葉片中水楊酸含量的測定；尤其適用于感染梢腐病的甘蔗葉片中水楊酸含量的測定，通過上述樣品的前處理方法和色譜條件，能排除梢腐病病原菌對檢測結(jié)果的干擾。實(shí)施例2判斷甘蔗品種感染梢腐病后的感性和抗性差異研究。（1）接種體的制備：將甘蔗梢腐病病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上活化3天，挑取PDA培養(yǎng)基邊緣菌絲接種在滅菌的馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3天，離心、用滅菌的脫脂棉過濾、收集所獲得的菌體，用無菌水與菌體配制成濃度為1×106CFU/ml甘蔗梢腐病病原菌孢子懸浮液。（2）接種材料的處理：選取甘蔗品種YT94-128、甘蔗品種GT37為接種材料，溫室條件下每個品種種植30桶，每桶4個芽，下種前用0.3%多菌靈浸種20min，出苗后正常管理，長出5～6片完全葉時進(jìn)行接種。（3）注射接種：取長勢相同的甘蔗品種YT94-128、甘蔗品種GT37的幼苗各30株，使用1ml醫(yī)用注射器分別將100μl甘蔗梢腐病病原菌孢子懸浮液到甘蔗+1葉位，作為甘蔗接種樣品；再另外取長勢相同的甘蔗品種YT94-128、甘蔗品種GT37的幼苗各30株，以注射無菌水為對照，作為甘蔗對照樣品；甘蔗接種結(jié)束后保持室內(nèi)溫度28-30℃，濕度80%。（4）樣品選取:選擇相同株齡+1葉位上相同位置有近似病癥的甘蔗葉片，在冰盒上將其剪成1cm×1cm的葉片進(jìn)行備樣。（5）檢測方法與結(jié)果S1.取各生長階段（2、4、8、16d）的甘蔗接種樣品YT94-128、GT37和甘蔗對照樣品YT94-128、GT37葉片2g分別加入液氮磨碎，加入10mL4℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)80%甲醇水溶液，保鮮膜密封后于4℃浸提16h；然后于4℃條件下以8000r/min離心10min得上清液，殘?jiān)?mL預(yù)冷至4℃的體積分?jǐn)?shù)其80%甲醇水溶液浸提2h，離心10min后取出上清液，合并兩次上清液于40℃減壓蒸發(fā)至不含甲醇（約剩0.3mL水溶液），加入15mL石油醚萃取脫色3次，棄去上層有機(jī)相，下層水相40℃下減壓蒸干，加入0.5mLHPLC檢測所用流動相溶解，定容至2mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾于帶有內(nèi)襯管的樣品瓶內(nèi)，作為研究樣品溶液備用；S2.采用HPLC檢測樣品溶液中赤霉素的含量。S2-1.色譜條件：ARigolL3000高效液相色譜儀；色譜柱：KromasilC18反相色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：200mL甲醇和300mL超純水混合，加入3mL乙酸；柱溫：35℃；走樣時間為20min；流速：0.8mL/min；檢測波長：306nm；進(jìn)樣體積：10μL。S2-2取不同生長階段（2、4、8、16d）的甘蔗接種樣品YT94-128、GT37和甘蔗對照樣品制成的研究樣品溶液，進(jìn)行赤霉素含量的測定，每個樣品重復(fù)測定3次，結(jié)果見表3。表3不同生長階段甘蔗接種樣品中赤霉素的含量S2-3實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。赤霉素（GA）作為一種重要的植物內(nèi)源激素，其參與甘蔗生理代謝過程一個突出特點(diǎn)是促使蔗莖的伸長和蔗株增高。經(jīng)鑒定，YT94-128對梢腐病表現(xiàn)出抗性，GT37對梢腐病表現(xiàn)出感性。由上述表3獲得的數(shù)據(jù)制得赤霉素含量的趨勢變化圖，如圖3所示，其中，A為對照樣品GT37的赤霉素含量變化趨勢，B為對照樣品YT94-128的赤霉素含量變化趨勢，C為接種樣品GT37的赤霉素含量變化趨勢，D為接種樣品YT94-128的赤霉素含量變化趨勢，結(jié)合圖3所示，對照樣品中的赤霉素含量隨甘蔗生長而逐漸上升，感病品種GT37的赤霉素含量變化趨勢高于抗病品種YT94-128；病原菌接種處理的甘蔗葉片中赤霉素含量隨甘蔗生長而不斷降低，感病品種GT37的赤霉素含量降低的趨勢要高于YT94-128；其中，接種后2至4天，蒸餾水接種和病原菌接種處理之間的赤霉素含量差異并不顯著，但接種后一周左右時間，接種處理與對照之間的差異達(dá)到極顯著。本試驗(yàn)說明，空白處理下，感病品種GT37葉片合成赤霉素的速率要高于抗病品種YT94-128；在接種病原菌后，感病品種GT37梢腐病病情指數(shù)不斷加重，其葉片合成赤霉素的能力受到顯著影響，同時蔗株在受到生物（病原菌）和非生物（針刺）脅迫后發(fā)生赤霉素次生合成反應(yīng)，但前者大于后者，從而導(dǎo)致GT37葉片中赤霉素含量呈顯著降低趨勢?？共∑贩NYT94-128在接種病原菌后，盡管其病情指數(shù)并不嚴(yán)重，但蔗株葉片合成赤霉素的能力也受到影響，有可能是YT94-128葉片本身合成赤霉素速率并不是很突出，到了接種后12至16天表現(xiàn)出與GT37葉片赤霉素含量的相似性變化。結(jié)論：由試驗(yàn)可看出，同一甘蔗品種，在感染梢腐病第7至10天后，正常生長的甘蔗葉片與感染梢腐病的甘蔗葉片之間赤霉素含量差異越小，該甘蔗品種對梢腐病表現(xiàn)出抗性的可能性越大，反之，該甘蔗品種對梢腐病表現(xiàn)出感性的可能性越大。這一試驗(yàn)結(jié)果為研究赤霉素抗逆性生理生化機(jī)制、篩選抗病品種和指導(dǎo)甘蔗抗病育種提供了重要的技術(shù)參考。本文中所描述的具體實(shí)施例僅僅是對本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可以對所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，但并不會偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3