本發(fā)明屬于微生物鑒定領域，特別涉及利用功能材料親和質(zhì)譜快速鑒定微生物的方法。

背景技術：

微生物鑒定對于臨床診斷和食品安全有著重要的意義。以血液細菌感染為例，在血液細菌感染(菌血癥)的細菌鑒定工作中，由于患者的臨床表現(xiàn)不典型，給感染的診斷帶來困難。目前，臨床上菌血癥診斷的金標準是血液細菌培養(yǎng)法，但血液培養(yǎng)的陽性率極低從而導致延誤治療[P.Phoompoung,M.Chayakulkeeree,Mycopathologia,2016,181(5-6),1-7；V.Kroumova,E.Gobbato,E.Basso,L.Mucedola,T.Giani,G.Fortina,Rapid Communications in Mass Spectrometry,2011,25(15),2247–2249.]。

傳統(tǒng)的微生物鑒定方法還包括分子生物學方法和免疫學方法，其中分子生物學方法主要有PCR技術、DNA探針技術和核糖體基因序列分析[I.M.Mackay,K.E.Arden,A.Nitsche，Nucleic Acids Research,2002，30(6),1292-1305；T.J.M.V.Steenbergen,M.F.Timmerman,F.H.M.Mikx,G.D.Quincey,G.A.V.D.Weijden,U.V.D.Velden,J.D.Graaff,Journal of Clinical Periodontology,1996,23(10),955-959.]，免疫學方法主要有酶聯(lián)免疫法、免疫磁珠技術和免疫熒光技術[D.Bryniok,W.Applied Microbiology&Biotechnology,1989，32(32),235-242；J.G.Bruno,H.Yu,J.P.Kilian,A.A.Moore,Journal of Molecular Recognition,1996,9(5-6),474-479.]。這些方法有的操作流程比較復雜，有的還欠缺靈敏度和選擇性。

相比之下，質(zhì)譜譜圖法準確度高、穩(wěn)定性好、操作簡單，易于臨床推廣。從1990年代起，基質(zhì)輔助激光解析電離源飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)被用于細菌鑒定[R.D.Holland,J.G.Wilkes,F.Rafii,J.B.Sutherland,C.C.K.J.Voorhees,J.O.Lay,Rapid Communications in Mass Spectrometry 1996,10(10),1227-1232；M.A.Claydon,S.N.Davey,V.Edwards-Jones,D.B.Gordon,Nature Biotechnology 1996,14(11),1584-1586.]。通過分析不同的細菌，科學家發(fā)現(xiàn)從完整的細菌細胞中可以得到具有指紋特征性的質(zhì)譜圖。通過記錄多種單一純細菌的指紋質(zhì)譜圖可以構建細菌鑒定所需的生物特征數(shù)據(jù)庫。之后通過比對臨床樣本中采集的細菌的MALDI-TOF-MS指紋質(zhì)譜圖，可以實現(xiàn)細菌種類的精準鑒定[A.Croxatto,G.Prod'hom,G.Greub,Fems Microbiology Reviews 2012,36(2),380-407；T.R.Sandrin,J.E.Goldstein,S.Schumaker,Mass Spectrometry Reviews 2013,32(3),188-217；N.Singhal,M.Kumar,P.K.Kanaujia,J.S.Virdi,Frontiers in Microbiology,2015,6,791]。

然而，受限于靈敏度，當前的質(zhì)譜法仍然無法直接用于臨床樣本中的細菌鑒定。通常情況下，需要首先對樣本中的細菌進行培養(yǎng)得到單菌落，之后對菌落中的細菌進行質(zhì)譜鑒定[A.Bizzini,C.Durussel,J.Bille,G.Greub,G.Prod'Hom,Journal of Clinical Microbiology 2010,48(5),1549-1554.]。因此，該方法仍然受限于細菌培養(yǎng)陽性率低的問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術的至少一個不足，提供一種鑒定樣品中微生物的方法，以實現(xiàn)便于快速、選擇性高、靈敏度高而且樣品用量少的目的。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

一種快速準確鑒定樣品中微生物的方法，所述方法包括以下步驟：

建立純微生物參考指紋質(zhì)譜圖庫，作為標準譜圖；

利用功能化材料從含有復雜背景基質(zhì)的樣品中選擇性捕獲目標微生物；

使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜分析功能化材料捕獲到的微生物，得到微生物譜圖；

將得到的微生物譜圖與標準譜圖進行比對，實現(xiàn)微生物鑒定。

進一步，作為本發(fā)明的一種實施方式，于本發(fā)明一個實施例中，所述微生物為細菌、真菌和病毒中的一種或多種。

進一步，作為本發(fā)明的一種實施方式，于本發(fā)明一個實施例中，所述純微生物參考指紋質(zhì)譜圖庫的制作方法：

將培養(yǎng)完的微生物細胞與培養(yǎng)基分離，懸浮在水中，形成不同濃度的水溶液；在基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜的靶板樣品點上重復點樣1μL，并用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢測。

進一步，所述功能性材料為利用抗體、功能化蛋白、凝集素、抗生素中的一種或多種修飾的納米或微米材料。

所述功能性材料為磁性材料或非磁性材料；進一步，作為本發(fā)明的一種實施方式，于本發(fā)明一個實施例中，所述功能性材料為磁性材料。

進一步，作為本發(fā)明的一種實施方式，于本發(fā)明一個實施例中，所述功能性材料為表面修飾重組有Protein A/G的磁珠。

進一步，所述含有復雜背景基質(zhì)的樣品包括臨床體液樣本或食品樣本。

其中臨床體液樣本包括血液、唾液、腦積液、胸腔積液等臨床體液樣本。

食品樣本包括牛奶、海鮮、肉湯等食品樣本。

進一步，作為本發(fā)明的一種實施方式，于本發(fā)明一個實施例中，利用功能化材料捕獲微生物后，對功能性材料使用封閉試劑。使用封閉試劑可以避免非特異性吸附作用。

進一步，所述封閉試劑為牛血清白蛋白(BSA)或吐溫。

進一步，于本發(fā)明一個實施例中，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜所用基質(zhì)為2,5-二羥基苯甲酸(DHB)。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

本發(fā)明提供了一種基于功能化材料的微生物提取富集方法，并用質(zhì)譜對富集的微生物進行鑒定，具有多種優(yōu)點：

本方法通過功能性材料從含有復雜背景基質(zhì)的樣品中選擇性捕獲微生物，對于樣品中的目標微生物有提取和富集的作用，通過富集作用，極大的降低了質(zhì)譜儀的最低檢測限、提高檢測靈敏度。該方法最低能檢測到的微生物濃度為每毫升全血中8000個細胞，或者每毫升血清中500個細胞，或者每毫升純水中40個細胞。

從而本方法鑒定微生物快速、選擇性高、靈敏度高而且樣品用量少，僅需要1mL。

鑒定的目標微生物如大腸桿菌是一種主要寄居在人或其他溫血動物的腸道中的細菌，在自然環(huán)境中會對水體造成污染；如副溶血性弧菌多見于海灣、魚類、貝類及海產(chǎn)品中，會引起食物中毒。因此，該方法對于環(huán)境保護、食品和飲水衛(wèi)生等方面都具有重要的意義。

鑒定人體血液中少量的致病微生物，可通過該方法捕捉富集致使人體患病的微生物，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)進行檢測。通過分析譜圖，鎖定致病的微生物種類、查明病原體，對癥治療。因此，該方法對于醫(yī)療健康具有重要的意義。

為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，并配合附圖，作詳細說明如下。

附圖說明

圖1是本發(fā)明快速準確鑒定樣品中微生物的方法的流程示意圖。

圖2是實施例1中利用大腸桿菌抗體修飾磁粒子捕獲血液中大腸桿菌DH5alpha用于質(zhì)譜分析的結果。

圖3是實施例2中利用人血清免疫球蛋白G修飾磁粒子捕獲大腸桿菌ATCC43889用于質(zhì)譜分析的結果。

圖4是實施例3中利用人血清免疫球蛋白G修飾磁粒子捕獲副溶血性弧菌用于質(zhì)譜分析的結果。

具體實施方式

圖1是本發(fā)明快速準確鑒定樣品中微生物的方法的流程示意圖。如圖1所示，本發(fā)明快速準確鑒定樣品中微生物的方法的流程包括：

事先準備工作：建立純微生物參考指紋質(zhì)譜圖庫，作為標準譜圖。

制作功能性材料：向表面修飾重組有Protein A/G的磁珠中加入目標微生物的抗體或人血清免疫球蛋白G，混勻反應，得到功能性材料；

接著向功能性材料中加入樣品，功能性材料會選擇性的捕獲目標微生物—細菌。

然后通過磁力分離，將捕獲目標微生物后的功能性材料分離出來，接著洗滌，使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜分析功能化材料捕獲到的微生物，得到微生物譜圖；

將得到的微生物譜圖與標準譜圖進行比對，實現(xiàn)微生物鑒定。

下面結合附圖和實例對本發(fā)明進一步闡述。

下述實施例中均先將槍頭、50mL離心管和液體培養(yǎng)基在滅菌鍋中滅菌2小時，設定溫度為126℃。超凈臺紫外滅菌30min，用75％乙醇擦拭消毒移液槍和手套。將滅好菌的槍頭、50mL離心管和液體培養(yǎng)基移入超凈臺，關閉紫外燈。均先獲取目標純菌指紋庫，作為標準譜圖進行比對參照。

實施例1

利用目標微生物抗體修飾的磁珠選擇性捕獲目標微生物。

取50μg磁珠，該磁珠的直徑約為1微米，表面修飾有重組的Protein A/G(～50,00Da)，每組Protein A/G包含了4個Protein A的Fc結合位點和2個Protein G的Fc結合位點。用PBST緩沖溶液(137mM NaCl，10mM Na₂HPO₄·12H₂O，2mM NaH₂PO₄·2H₂O，0.05％Tween 20)清洗兩次(每次20μL)后將磁珠分散于50μL PBST緩沖溶液中。在上述緩沖溶液和磁珠的混合物中加入2μL腸致病性大腸桿菌抗體，室溫下在恒溫混勻儀上反應30min。將反應后的磁珠用封閉液PBST+1％BSA洗滌三次(每次20μL)，用磁鐵將磁珠分離，并分散于50μL PBST緩沖溶液中。

含有大腸桿菌DH5alpha(10⁸CFU/mL)的0.1mL全血樣品用去離子水稀釋6倍，140g轉(zhuǎn)速下離心10min，沉淀去除血細胞，上清與2mL去離子水混合去除裂解殘留紅細胞，2000g轉(zhuǎn)速下離心5min獲得微生物，用1mL去離子水清洗一次，并懸浮在300μL PBST混和溶液中。將50μg接有抗體的磁珠中加入上述處理后的樣本。在恒溫混勻儀上反應30min，設定溫度為37℃。用磁鐵收集磁珠，并依次用PBST+1％BSA溶液洗滌兩次(每次1mL)，去離子水洗滌一次(每次1mL)。去掉上清液，得到捕獲了大腸桿菌的磁珠。

取上述得到的捕獲有大腸桿菌的磁珠1μL，點到MALDI靶板上，待干后取1μL DHB(2,5-二羥基苯甲酸)基質(zhì)(50％H₂O，50％CH₃CN，0.1％TFA，10mg/mL DHB)疊加在樣品點上。用MALDI-TOF MS測定大腸桿菌譜圖，與標準譜圖進行比對實現(xiàn)鑒定。結果如圖2所示。

實施例2

利用人血清免疫球蛋白G實現(xiàn)廣譜性的病原微生物提取富集。

取-80℃保存的大腸桿菌ATCC43889菌液100μL于50mL離心管中，加入9mL液體胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基，混勻。將離心管蓋子稍微擰松于搖床中培養(yǎng)，設定溫度為37℃，設定轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)時間12h。此時細菌進入對數(shù)期末期，活性最好，菌濃度最大。

取50μg與實施例1中相同的磁珠，每次用20μL PBST緩沖溶液，清洗兩次后將磁珠分散于50μL PBST緩沖溶液中。在上述緩沖溶液和磁珠的混合物中加入2μL人血清免疫球蛋白G，室溫下在恒溫混勻儀上反應30min。將反應后的磁珠用封閉液PBST+1％BSA洗滌三次(每次20μL)，用磁鐵將磁珠分離，并分散于50μL PBST緩沖溶液中。

取培養(yǎng)的大腸桿菌(10⁸CFU/mL)1mL，設定離心機轉(zhuǎn)速為2000g，離心5min，去掉上清液，用去離子水清洗兩次(每次1mL)，將清洗過的大腸桿菌分散于300μL PBST緩沖溶液中。

將50μL經(jīng)過人血清免疫球蛋白G處理并分散于PBST緩沖溶液的磁珠加入處理后的大腸桿菌中，在恒溫混勻儀上反應30min，設定溫度為37℃。用磁鐵收集磁珠，并依次用PBST+1％BSA溶液洗滌兩次(1mL)，去離子水洗滌一次(1mL)。去掉上清液，得到捕獲了大腸桿菌的磁珠。

取上述得到的捕獲有大腸桿菌的磁珠1μL，點到MALDI靶板上，待干后取1μL DHB基質(zhì)疊加在樣品點上。用MALDI-TOF MS測定大腸桿菌的譜圖，與標準譜圖進行比對實現(xiàn)鑒定。鑒定結果如圖3所示。

實施例3

利用人血清免疫球蛋白G實現(xiàn)廣譜性的病原微生物提取富集。

取-80℃保存的副溶血性弧菌菌液100μL于50mL離心管中，加入9mL液體胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基，混勻。將離心管蓋子稍微擰松于搖床中培養(yǎng)，設定溫度為37℃，設定轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)時間12h。此時細菌進入對數(shù)期末期，活性最好，菌濃度最大。

取50μg與實施例1中相同的磁珠，每次用20μL PBST緩沖溶液，清洗兩次后將磁珠分散于50μL PBST緩沖溶液中。在上述緩沖溶液和磁珠的混合物中加入2μL人血清免疫球蛋白G，室溫下在恒溫混勻儀上反應30min。將反應后的磁珠用封閉液PBST+1％BSA洗滌三次(每次20μL)，用磁鐵將磁珠分離，并分散于50μL PBST緩沖溶液中。

取培養(yǎng)的副溶血性弧菌(10⁸CFU/mL)1mL，設定離心機轉(zhuǎn)速為2000g，離心5min，去掉上清液，用去離子水清洗兩次(每次1mL)，將清洗過的副溶血性弧菌分散于300μL PBST緩沖溶液中。

將50μL經(jīng)過人血清免疫球蛋白G處理并分散于PBST緩沖溶液的磁珠加入處理后的副溶血性弧菌中，在恒溫混勻儀上反應30min，設定溫度為37℃。用磁鐵收集磁珠，并依次用PBST+1％BSA溶液洗滌兩次(1mL)，去離子水洗滌一次(1mL)。去掉上清液，得到捕獲了副溶血性弧菌的磁珠。

取上述得到的捕獲有副溶血性弧菌的磁珠1μL，點到MALDI靶板上，待干后取1μL DHB基質(zhì)疊加在樣品點上。用MALDI-TOF MS測定副溶血性弧菌的譜圖，與標準譜圖進行比對實現(xiàn)鑒定。鑒定結果如圖4所示。

雖然本發(fā)明已由較佳實施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟知此技藝者，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，可作些許的更動與潤飾，因此本發(fā)明的保護范圍當視權利要求書所要求保護的范圍為準。