本發(fā)明涉及一種用于癌細(xì)胞內(nèi)銅離子檢測(cè)的新型熒光探針及其應(yīng)用，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

銅元素在生物體系內(nèi)的含量?jī)H次于鋅和鐵，是生物體系必需的一種微量重金屬元素和營(yíng)養(yǎng)素，對(duì)多種有機(jī)體的基本生理過(guò)程起著至關(guān)重要的作用。作為生命體系的重要金屬元素，銅離子常以細(xì)胞色素氧化酶、過(guò)氧化氫歧化酶、絡(luò)氨酸酶、多巴胺β-強(qiáng)化酶等金屬酶的催化輔助因子形式，廣泛參與生命體系中的電子傳遞、氧化還原等一系列生理過(guò)程，在生物體內(nèi)的酶反應(yīng)、酶轉(zhuǎn)錄等過(guò)程發(fā)揮著重要的作用。生物體系內(nèi)的銅離子濃度異常時(shí)，將導(dǎo)致面克斯綜合征、威爾森式綜合征、家族性肌萎縮癥和阿爾茲海默癥等疾病的發(fā)生。因此，尋求一種快速靈敏的銅離子檢測(cè)方法在生命體系研究和醫(yī)學(xué)診斷中具有重要的作用。

近期研究報(bào)道，相對(duì)正常細(xì)胞，銅離子能夠在腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生明顯富集，具有更高的濃度。臨床研究發(fā)現(xiàn)，癌癥患者血漿中的銅離子濃度與腫瘤惡化程度以及藥物治療反應(yīng)密切相關(guān)。通過(guò)銅離子螯合劑四硫鉬酸鹽（TM）降低體內(nèi)銅離子含量，可以顯著減緩腫瘤組織中的血管生成，進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)。因此，對(duì)癌細(xì)胞內(nèi)的銅離子進(jìn)行實(shí)時(shí)快速檢測(cè)對(duì)腫瘤的預(yù)防和診斷具有重要意義。

傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要有原子吸收光譜法、電感耦合等離子體-質(zhì)譜法、電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜法、分光光度測(cè)定方法和循環(huán)伏安法等檢測(cè)銅離子的方法，但這些檢測(cè)方法需要昂貴復(fù)雜的檢測(cè)設(shè)備，且檢測(cè)過(guò)程中較為繁瑣，不適合大批量檢測(cè)和實(shí)時(shí)檢測(cè)。相比熒光成像分析法具有靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)迅速、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，而且對(duì)細(xì)胞基本沒(méi)有損傷，已經(jīng)廣泛用于各種生物小分子的檢測(cè)。目前，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)銅離子的熒光探針也得到了迅速發(fā)展。但是，目前報(bào)道的銅離子熒光探針大都不具備癌細(xì)胞靶向，不能區(qū)分癌細(xì)胞和正常細(xì)胞，一般對(duì)所有細(xì)胞都有相應(yīng)。因此開發(fā)新的具有高選擇性、高靈敏度、光穩(wěn)定性及透膜性好，且具有癌細(xì)胞靶向的銅離子熒光探針具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種新型檢測(cè)癌細(xì)胞內(nèi)銅離子的新型熒光探針及其應(yīng)用。

本發(fā)明所述的新型檢測(cè)癌細(xì)胞內(nèi)銅離子的熒光探針為含有生物素基團(tuán)的羅丹明衍生物，其特征在于：所述熒光探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如式（）所示，其中生物素部分具有癌細(xì)胞靶向性，酰肼基團(tuán)為銅離子響應(yīng)位點(diǎn)：

式（）

本發(fā)明所述檢測(cè)生物體系內(nèi)銅離子的熒光探針的制備方法為：將式（Ⅱ）所示的化合物a (1 mmol)、水合肼（2 mmol）和乙醇 (5 mL)加入到50 mL單口燒瓶中，80 ℃下加熱5小時(shí)。冷卻至室溫，加入到水中，過(guò)濾，烘干。將所得固體進(jìn)行柱層析純化，得到白色產(chǎn)物即為本發(fā)明所述檢測(cè)癌細(xì)胞內(nèi)銅離子的熒光探針。

式（Ⅱ）

本發(fā)明所述的熒光探針在檢測(cè)癌細(xì)胞內(nèi)銅離子的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的熒光探針可應(yīng)用于癌細(xì)胞內(nèi)銅離子的檢測(cè)評(píng)價(jià)。其中生物素部分使得該探針具有癌細(xì)胞靶向性。該探針作為癌細(xì)胞銅離子的特異性探針，在銅離子存在的環(huán)境下，可以將酰肼催化水解為羧基，生成具有高熒光發(fā)射能力的熒光物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)不同的熒光強(qiáng)度來(lái)測(cè)定癌細(xì)胞內(nèi)的銅離子。

具體測(cè)定方法為：室溫條件下，配制5 μM熒光探針緩沖溶液（含5% 乙腈），加入到具有不同濃度的銅離子溶液系中，測(cè)定溶液熒光強(qiáng)度作為銅離子濃度的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

本發(fā)明所述的熒光探針在硫化氫存在的條件下，羅丹明熒光團(tuán)的酰肼部分將被催化水解為羧基，此時(shí)熒光探針可以發(fā)射羅丹明熒光團(tuán)的紅色熒光（峰值約為580 nm）。同時(shí)，由于生物素具有癌細(xì)胞靶向性，可以將癌細(xì)胞和正常細(xì)胞區(qū)分，因此該熒光探針可以用于檢測(cè)癌細(xì)胞內(nèi)的銅離子?？刹捎脽晒鈾z測(cè)器實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的快速靈敏檢測(cè)；檢測(cè)條件為：激發(fā)波長(zhǎng)為530 nm，在550~700 nm之間進(jìn)行熒光發(fā)射光譜的檢測(cè)。

熒光探針在生物成像應(yīng)用研究主要內(nèi)容有探針對(duì)活細(xì)胞的毒性、染色能力、活細(xì)胞和活組織熒光成像。采用MTT比色法，通過(guò)分析細(xì)胞在加入熒光探針之后的存活率，討論熒光探針對(duì)細(xì)胞的毒性。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用本發(fā)明所述的熒光探針對(duì)活癌細(xì)胞內(nèi)的銅離子進(jìn)行快速檢測(cè)。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明所述的檢測(cè)癌細(xì)胞內(nèi)銅離子的熒光探針可經(jīng)化學(xué)合成獲得，合成工藝簡(jiǎn)單易行，原料廉價(jià)易得，制備成本低，易于推廣。

本發(fā)明所述的檢測(cè)癌細(xì)胞內(nèi)銅離子的熒光探針具有高特異性，在進(jìn)行相應(yīng)銅離子檢測(cè)過(guò)程中不受其他組分的干擾，可用于活癌細(xì)胞內(nèi)銅離子的實(shí)時(shí)測(cè)定，具有廣闊的應(yīng)用前景。

本發(fā)明所述的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)銅離子的熒光探針靈敏度高，具有良好的熒光發(fā)射光譜特性（550~700 nm），可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞中的銅離子快速準(zhǔn)確檢測(cè)的目的。

附圖說(shuō)明

圖1是熒光探針的¹H NMR圖譜。

圖2是熒光探針在不同濃度銅離子條件下的熒光光譜。

圖3是熒光探針與銅離子濃度的線性關(guān)系數(shù)據(jù)。

圖4是熒光探針與不同物質(zhì)反應(yīng)后的熒光光譜。

圖5是熒光探針在活細(xì)胞中的成像應(yīng)用。

A圖：只加10 μM探針的細(xì)胞明場(chǎng)照片；B圖：只加10 μM探針的細(xì)胞紅色通道熒光照片；C圖：A圖和B圖的疊加照片；D圖：加入10 μM探針和50 μM銅離子的細(xì)胞明場(chǎng)照片；E圖：加入10 μM探針和50 μM銅離子的細(xì)胞紅色通道熒光照片；F圖：D圖和E圖的疊加照片。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明保護(hù)內(nèi)容不僅限于此。

實(shí)施例1

所述檢測(cè)癌細(xì)胞內(nèi)銅離子的熒光探針的制備

將式（Ⅱ）所示的化合物a （1 mmol）、水合肼（2 mmol）和乙醇 （5 mL）加入到50 mL單口燒瓶中，80 ℃下加熱5小時(shí)。冷卻至室溫，加入到水中，過(guò)濾，烘干。將所得固體進(jìn)行柱層析(二氯甲烷:甲醇 = 10:1 ) 純化，得到黃色產(chǎn)物，即為本發(fā)明所述檢測(cè)癌細(xì)胞內(nèi)銅離子的熒光探針，產(chǎn)率73%。

上述檢測(cè)癌細(xì)胞內(nèi)銅離子的熒光探針的¹H NMR圖譜見圖1。

實(shí)施例2

所述熒光探針在不同銅離子濃度下的熒光光譜

本發(fā)明采用硫酸在水溶液中供應(yīng)銅離子。預(yù)先準(zhǔn)備10份5mL的 5 μM探針緩沖溶液，含5% 乙腈，所加入的銅離子濃度為0到125 μM。然后進(jìn)行熒光檢測(cè)（λ_Ex= 530 nm）；計(jì)算各體系中熒光強(qiáng)度；通過(guò)分析581 nm處的熒光強(qiáng)度與銅離子濃度的關(guān)系，評(píng)估該探針對(duì)銅離子的響應(yīng)性能（見圖2和圖3）。圖2表明，隨著銅離子濃度的增大，溶液的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。圖3表明，當(dāng)銅離子濃度在0 ~ 40 μM范圍內(nèi)，溶液的熒光強(qiáng)度和銅離子的濃度呈較好的線性關(guān)系，可采用公式Y(jié) = 19.95 * X + 23.27表示，其中Y為581nm處的熒光強(qiáng)度，X為銅離子的濃度。

實(shí)施例3

熒光探針與不同物質(zhì)反應(yīng)后的熒光光譜

預(yù)先準(zhǔn)備10份5mL的 5 μM探針緩沖溶液(含5 % 乙腈，pH = 7.4)，然后分別向該體系中依次加入50 μL濃度為200 μM的Hcys、Na₂S、Na₂SO₃、Cys、GSH、VC、Zn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、Mg²⁺、Co²⁺等相關(guān)分析物的緩沖溶液。然后進(jìn)行熒光檢測(cè)（λ_Ex= 530 nm）；計(jì)算各體系中熒光強(qiáng)度；評(píng)估該不同物質(zhì)對(duì)熒光探針溶液的干擾性（見圖4）。從圖中看出，當(dāng)然探針溶液中加入Hcys、Na₂S、Na₂SO₃、Cys、GSH、VC、Zn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、Mg²⁺、Co²⁺等相關(guān)分析物時(shí)，只有銅離子可以導(dǎo)致溶液產(chǎn)生顯著的熒光，而加入其他小分子時(shí)溶液的熒光基本沒(méi)有變化，這表示該探針只對(duì)銅離子有響應(yīng)，而不受其他小分子的干擾。

實(shí)施例4

熒光探針在活細(xì)胞中的成像應(yīng)用

將小鼠乳腺癌細(xì)胞（4T1細(xì)胞）放在培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)液和10%胎牛血清)中，放置于條件為37℃、5% CO₂和20% O₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 -48h。用微量進(jìn)樣器吸取本發(fā)明所述熒光探針(10 μM)注入含有4T1細(xì)胞的培養(yǎng)基中，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。加入100 μM銅離子溶液，繼續(xù)培養(yǎng)30 min。之后用PBS (磷酸鹽緩沖溶液)沖洗培養(yǎng)細(xì)胞3次，進(jìn)行熒光成像。

結(jié)果見圖5。從A、B和C圖中看出，只加入探針時(shí)，細(xì)胞基本沒(méi)有熒光；從D、E和F圖中看出，加入10 μM探針和50μM硫化鈉之后，細(xì)胞產(chǎn)生明顯的熒光，這表示該探針可用于檢測(cè)癌細(xì)胞中的銅離子。