本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種肺癌篩查試劑盒。
背景技術(shù)：
肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，目前發(fā)病率居世界首位，嚴(yán)重威脅著人類健康和生命。
肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。近50年來許多國家都報道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的第一位，女性發(fā)病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明確，大量資料表明，長期大量吸煙與肺癌的發(fā)生有非常密切的關(guān)系。已有的研究證明：長期大量吸煙者患肺癌的概率是不吸煙者的10～20倍，開始吸煙的年齡越小，患肺癌的幾率越高。此外，吸煙不僅直接影響本人的身體健康，還對周圍人群的健康產(chǎn)生不良影響，導(dǎo)致被動吸煙者肺癌患病率明顯增加。城市居民肺癌的發(fā)病率比農(nóng)村高，這可能與城市大氣污染和煙塵中含有致癌物質(zhì)有關(guān)。
肺癌的病因復(fù)雜，一般認(rèn)為影響因素包括：①吸煙；②環(huán)境污染：如霧霾、室內(nèi)裝修；③不良生活方式：如飲食習(xí)慣差、生活壓力大；④慢性肺部疾?。喝绶谓Y(jié)核、塵肺，矽肺、慢性支氣管炎；⑤人體內(nèi)在因素：如家族遺傳、免疫機能降低、內(nèi)分泌功能失調(diào)等。
同時，肺癌是一種善于隱匿的疾病，經(jīng)常在疾病發(fā)展到晚期才表現(xiàn)出臨床癥狀，70～80％的肺癌患者在診斷出患有肺癌癥狀時已是中、晚期，癌細(xì)胞已經(jīng)擴散，錯過了最佳治愈時機，五年生存率低。對于早期的肺癌患者，經(jīng)過及時治療可大大提高患者的5年及以上生存率和生存質(zhì)量。因此肺癌的早期診斷和進行有效的篩查至關(guān)重要。
肺癌的篩查，是指對那些沒有肺癌相關(guān)癥狀的人群進行常規(guī)體檢，在出現(xiàn)癥狀前及時發(fā)現(xiàn)肺癌。如果可以找到肺癌分子標(biāo)志物，用于提示臨床醫(yī)生早期對患者采取相關(guān)的治療措施或者決策具有重要的意義。
申請?zhí)枮镃N201110328294.7，名稱為一種有關(guān)肺癌診斷試劑盒用于肺癌的檢測方法的發(fā)明專利，公開了一種有關(guān)肺癌診斷試劑盒用于肺癌的檢測方法，通過基因重組技術(shù)純化生產(chǎn)S100A2蛋白，純化的S100A2蛋白，注射于動物體內(nèi)以誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性結(jié)合S100A2蛋白的多克隆抗體，另一方面方面，提供了一種肺癌的診斷試劑盒，該試劑盒含有容器，容器中含有S100A2蛋白；以及標(biāo)簽，所述標(biāo)簽說明所述試劑盒用于診斷肺癌。還含有抗S100A2蛋白的特異性抗體。試劑盒中或含有免疫組化相關(guān)試劑：PBS緩沖液，或0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液，或3%H2O2溶液，或辣根酶檢測試劑，本發(fā)明深入地研究和大規(guī)模驗證S100A2與肺癌的相關(guān)性，研究出可供臨床應(yīng)用的檢測試劑，對肺癌進行診斷及為患者提供個體化輔助治療方法。
申請?zhí)枮镃N201510069543.3，名稱為一種用于肺癌診斷的SALL4免疫組織化學(xué)檢測試劑盒的發(fā)明專利，公開了一種用于肺癌診斷的SALL4免疫組織化學(xué)檢測試劑盒、使用方法及應(yīng)用，屬于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)檢測領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒包括如下組分：陽性對照、陰性對照、一抗、二抗、固定劑、脫脂和透明劑、復(fù)水劑、脫水劑、緩沖液A、緩沖液B、抗原修復(fù)劑、通透劑、過氧化物酶失活劑、非特異性蛋白阻斷劑、顯色液和染色劑。本發(fā)明的試劑盒，具有特異性高、敏感性高、差異性表達的特點，不僅可以有效地區(qū)分肺癌組織和正常組織，還可為肺癌個體化治療提供新的診斷和分類依據(jù)，可最大程度地將肺癌的檢出時間提前，解決了現(xiàn)有檢測手段靈敏度都相對較低、難以實現(xiàn)肺癌的早期監(jiān)測的問題，具有較高的臨床應(yīng)用價值和社會效益。
目前，暫未見有包括有用于檢測肺組織中磷酸化MUSK表達水平的試劑的試劑盒，以及檢測肺組織中磷酸化MUSK表達水平的試劑在制備肺癌診斷用試劑中的用途的相關(guān)報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提出了一種肺癌篩查試劑盒，實現(xiàn)了預(yù)測待檢人群患肺癌的風(fēng)險的目的。
本發(fā)明的肺癌篩查試劑盒，它包括任選的用于檢測磷酸化MUSK表達水平的試劑。
進一步的，所述試劑是用于檢測肺組織中磷酸化MUSK表達水平的試劑。
進一步的，所述檢測磷酸化MUSK表達水平的試劑為免疫組化檢測方法用試劑。
進一步的，所述檢測磷酸化MUSK表達水平的試劑為Western Blot或ELISA檢測方法用試劑。
本發(fā)明還提供了檢測磷酸化MUSK表達水平的試劑在制備肺癌篩查用試劑中的用途。
進一步的，所述試劑是用于檢測肺組織中磷酸化MUSK表達水平的試劑。
進一步的，所述檢測磷酸化MUSK表達水平的試劑為免疫組化檢測方法用試劑。
進一步的，所述檢測磷酸化MUSK表達水平的試劑為Western Blot或ELISA檢測方法用試劑。
本發(fā)明帶來的有益效果有：
本發(fā)明試劑盒通過檢測磷酸化MUSK的表達水平，可以判斷肺癌組織與正常肺組織的磷酸化MUSK表達水平差異，進而判斷待檢人群患肺癌的風(fēng)險：若磷酸化MUSK的表達水平高，則患肺癌的風(fēng)險高，若磷酸化MUSK的表達水平低，則患肺癌的風(fēng)險低，可用于臨床肺癌的輔助診斷，臨床應(yīng)用前景良好。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實施方式
實施例1 肺癌篩查試劑盒
一種肺癌篩查試劑盒，它包括任選的用于檢測磷酸化MUSK表達水平的試劑。
本發(fā)明所述試劑是用于檢測肺組織中磷酸化MUSK表達水平的試劑。
本發(fā)明所述檢測磷酸化MUSK表達水平的試劑為免疫組化檢測方法用試劑。
本發(fā)明所述試劑盒內(nèi)的試劑包括：磷酸化MUSK抗體、抗體稀釋液、抗原修復(fù)液、洗滌液、二抗、DAB顯色劑和免疫組化筆。
本發(fā)明所述檢測磷酸化MUSK表達水平的試劑為Western Blot或ELISA檢測方法用試劑。
實施例2檢測磷酸化MUSK表達水平的試劑在制備肺癌篩查用試劑中的用途
檢測磷酸化MUSK表達水平的試劑在制備肺癌篩查用試劑中的用途。所述試劑是用于檢測肺組織中磷酸化MUSK表達水平的試劑。所述檢測磷酸化MUSK 表達水平的試劑為免疫組化檢測方法用試劑。所述檢測磷酸化MUSK表達水平的試劑為Western Blot或ELISA檢測方法用試劑。
實施例3 磷酸化MUSK表達水平與肺癌的關(guān)系
1、選取肺癌患者石蠟切片20例，遠端組織對照20例，基本信息見表1。
表1 臨床基本信息
*注：其他包括大細(xì)胞癌、腺鱗癌、小細(xì)胞癌。
2、磷酸化MUSK表達水平的檢測
MUSK（muscle associated receptor tyrosine kinase，肌肉特異性酪氨酸激酶），MUSK免疫原經(jīng)過磷酸化，用其制備的抗體就稱之為磷酸化MUSK。
本發(fā)明對肺癌患者石蠟切片、遠端組織對照石蠟切片，進行免疫組化（IHC)。
本發(fā)明采用的磷酸化MUSK抗體：兔多克隆抗體（購自abcam公司，貨號：ab192583）。
本發(fā)明采用的二抗、抗體稀釋液、DAB顯色劑、抗原修復(fù)液、Wash Buffer、免疫組化筆均購自丹麥Dako公司。
本發(fā)明中的洗滌液采用蒸餾水。
本發(fā)明按照如下方法檢測磷酸化MUSK的表達水平：
（1）封閉過氧化物酶：取石蠟切片進行脫蠟，脫蠟至水化后，用3% H2O2溶液于暗處封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育15 min。
（2）蒸餾水漂洗：切片置于蒸餾水中，搖床上洗5 min/次，共三次。
（3）抗原修復(fù)：加入pH 8.0的Tris-EDTA或pH 6.0的檸檬酸鈉溶液，在95℃水浴鍋中水浴50 min，進行抗原修復(fù)。
（4）蒸餾水漂洗：取出切片，自然冷卻至室溫后，用蒸餾水沖洗三遍，再用Wash Buffer潤洗一次。
（5）孵育一抗：用免疫組化筆將組織圈住，在圈內(nèi)滴加磷酸化MUSK抗體液，4 ℃孵育過夜。
（6）蒸餾水漂洗：用蒸餾水洗三遍，Wash Buffer潤洗一次。
（7）滴加二抗：滴加Dako HRP標(biāo)記的二抗工作液，室溫孵育60 min。
（8）蒸餾水漂洗：流水沖洗3-5 min，雙蒸水漂洗3次；Wash Buffer潤洗一次。
（9）DAB顯色：滴加DAB顯色劑，在顯微鏡下觀察顯色情況，于蒸餾水中終止反應(yīng)。
（10）蘇木素復(fù)染：將切片放入蘇木素染液中染色2 min，1%鹽酸酒精分化后，流水沖洗10 min。
（11）脫水透明：經(jīng)80%、95%、100%梯度酒精脫水、二甲苯透明，于通風(fēng)廚中干燥。
（12）封片：用中性快干膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察，DP Controller圖像采集系統(tǒng)采圖。采圖后，根據(jù)肺癌患者和遠端組織的腫瘤細(xì)胞染色強度及陽性面積給予免疫組化評分。
3、免疫組化評分標(biāo)準(zhǔn)
腫瘤細(xì)胞染色強度*腫瘤細(xì)胞陽性面積=0-9分，
結(jié)果統(tǒng)計：陰性：0分；低度陽性：1-3分；高度陽性>3分。
其中，腫瘤細(xì)胞染色強度、陽性面積的評分如下：
@注：由兩名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)生獨立對腫瘤細(xì)胞染色強度結(jié)果進行評分
4、結(jié)果分析
采用SPSS17.0對肺癌組織組和遠端組織對照組進行統(tǒng)計學(xué)分析。
5、實驗結(jié)果
肺癌組織與遠端組織對照中磷酸化MUSK的表達水平檢測結(jié)果見表2。
表2 磷酸化MUSK的表達水平
由表2可見，遠端正常組織中磷酸化MUSK的陽性表達率為15%，肺癌組織中的磷酸化MUSK陽性表達率為80%，磷酸化MUSK在肺癌組織中顯著升高，與遠端正常組織相比，磷酸化MUSK表達水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。
由以上結(jié)果可以看出，與癌旁正常肺組織相比，肺癌組織的磷酸化MUSK表達水平顯著升高（P<0.01），說明肺癌與磷酸化MUSK表達水平呈正相關(guān)，磷酸化MUSK的高表達會顯著提高患肺癌的可能性。由于癌旁正常肺組織的磷酸化MUSK水平可反應(yīng)正常人肺組織的磷酸化MUSK水平，因此，可以通過檢測待檢人群的磷酸化MUSK 的表達水平，將肺癌的易感人群篩查出來。
實施例4 本發(fā)明檢測肺組織磷酸化MUSK表達水平的試劑盒的組成及其使用方法
1、試劑盒的組成
檢測試劑盒（50人份）：
本表格按每張切片滴加各類實驗試劑為100μl/張，具體用量可根據(jù)組織大小適當(dāng)增減。
2、試劑盒的使用方法
將待檢樣本肺組織，制備石蠟切片，作為檢測標(biāo)本，按照如下方法檢測磷酸化MUSK的表達水平。
（1）封閉過氧化物酶：取檢測標(biāo)本進行脫蠟，脫蠟至水化后（脫蠟過程如下：二甲苯Ⅰ 10min→二甲苯Ⅱ 10min→無水乙醇 5min→95%乙醇5min→85%乙醇 5min→75%乙醇 5min），用3% H2O2溶液于暗處封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育15 min。
（2）蒸餾水漂洗：切片置于蒸餾水中，搖床上洗5 min/次，共三次。
（3）抗原修復(fù)：加入pH 8.0的Tris-EDTA或pH 6.0的檸檬酸鈉溶液，在95℃水浴鍋中水浴50 min，進行抗原修復(fù)。
（4）蒸餾水漂洗：取出切片，自然冷卻至室溫后，用蒸餾水沖洗三遍，再用Wash Buffer潤洗一次。
（5）孵育一抗：用免疫組化筆將組織圈住，在圈內(nèi)滴加磷酸化MUSK抗體液，（磷酸化MUSK抗體液為磷酸化MUSK抗體與抗體稀釋液混合配制，二者比例為磷酸化MUSK/抗體稀釋液=1/100），4 ℃孵育過夜。
（6）蒸餾水漂洗：用蒸餾水洗三遍，Wash Buffer潤洗一次。
（7）滴加二抗：滴加Dako HRP標(biāo)記的二抗工作液，室溫孵育60 min。
（8）蒸餾水漂洗：蒸餾水中洗5 min/次，共三次。
（9）DAB顯色：滴加顯色底物DAB，在顯微鏡下觀察顯色情況，于蒸餾水中終止反應(yīng)。
（10）蘇木素復(fù)染：將切片放入蘇木素染液中染色2 min，1%鹽酸酒精分化后，流水沖洗10 min。
（11）脫水透明：具體步驟為：80%乙醇1 min→90%乙醇1 min→95%乙醇1 min→無水乙醇Ⅰ 1 min→無水乙醇Ⅱ 1 min→二甲苯Ⅰ 1 min→二甲苯Ⅱ 1 min，于通風(fēng)廚中干燥。
（12）封片：用中性快干膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察，DP Controller圖像采集系統(tǒng)采圖。采圖后，對檢測標(biāo)本進行免疫組化評分。
綜上，磷酸化MUSK在肺組織中的表達水平與肺癌呈正相關(guān)。本發(fā)明試劑盒通過檢測磷酸化MUSK的表達水平，可以判斷肺癌組織與正常肺組織的磷酸化MUSK表達水平差異，進而篩查待檢人群患肺癌的風(fēng)險：若磷酸化MUSK的表達水平高，則患肺癌的風(fēng)險高，若磷酸化MUSK的表達水平低，則患肺癌的風(fēng)險低，可用于臨床肺癌的輔助診斷，為患者采取相關(guān)的治療措施或者決策提供有效的依據(jù)，臨床應(yīng)用前景良好。