本發(fā)明屬于食品中抗生素殘留檢測領(lǐng)域，通過紫外可見光測定氯化血紅素(Hemin)催化的反應(yīng)底物在450nm的吸光值以及顏色變化，可實現(xiàn)四環(huán)素的比色檢測。

背景技術(shù)：

四環(huán)素(TET)是從放線菌金色鏈叢菌(Streptomyces aureofaciens)的培養(yǎng)液等分離出來的抗菌物質(zhì)，具有良好的殺菌抑菌作用。作為一種廣譜抗生素，四環(huán)素對革蘭氏陽性菌、陰性菌、立克次體、濾過性病毒、螺旋體等都有良好的抑制作用。由于其低廉的價格，良好的廣譜抗菌作用，被廣泛的應(yīng)用于畜牧以及水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)。近年來，由于商業(yè)化利益驅(qū)使，四環(huán)素不合理使用甚至濫用的現(xiàn)象日益嚴(yán)重，導(dǎo)致動物源性產(chǎn)品中四環(huán)素殘留過量，嚴(yán)重威脅消費者身體健康。當(dāng)前，大部分國家都對動物源性食品中四環(huán)素在動物源性食品中的殘留進(jìn)行了嚴(yán)格監(jiān)控，對殘留量有著嚴(yán)格規(guī)定。中國“動物性食品中獸藥最高殘留限量”規(guī)定，肌肉組織中四環(huán)素類的最高殘留限量(MRL)為100μg/L。歐盟規(guī)定肌肉牛奶中四環(huán)素類化合物含量不能超過100ng/g，美國食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定牛奶中四環(huán)素最大殘留為900nM/L。

目前已報道的四環(huán)素類藥物殘留量的分析方法有微生物檢測法、放射免疫測定法、膠體金免疫層析實驗測定法、酶聯(lián)免疫法、薄層色譜法、分子印記技術(shù)、毛細(xì)管電泳法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。色譜方法準(zhǔn)確性好，分辨率和靈敏度較高，重現(xiàn)性好，樣品需要量少，能同時進(jìn)行多種物質(zhì)的分離，但是其儀器昂貴、要求樣品純度高、前處理復(fù)雜、導(dǎo)致檢測成本高、周期長，無法適應(yīng)快速大批量檢測需要。免疫學(xué)方法雖然能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測，靈敏性高，特異性強(qiáng)，能夠同時對多樣品進(jìn)行分析等優(yōu)點，然而抗體制備復(fù)雜，檢測重現(xiàn)性差，導(dǎo)致結(jié)果穩(wěn)定性差。毛細(xì)管電泳法、微生物學(xué)法等檢測方法方便快捷，但準(zhǔn)確性差，特異性不好，無法對樣品進(jìn)行精確分析。因此，需要建立一種快速準(zhǔn)確的四環(huán)素檢測新方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種簡單快速檢測四環(huán)素的方法，它具有特異性強(qiáng)、操作便捷，檢測快速等優(yōu)勢，可廣泛應(yīng)用于食品中四環(huán)素殘留的快速檢測。

本發(fā)明的基本原理是：本發(fā)明采用的試劑主要包括功能性ssDNA序列，氯化血紅素(Hemin)，雙氧水(H₂O₂)和3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)等。Hemin在磷酸二氫鈉緩沖溶液中具有辣根過氧化物酶活性，在H₂O₂存在下可催化一定量TMB失去1個電子，生成藍(lán)色產(chǎn)物在650nm左右展現(xiàn)出顯著特征吸收峰。當(dāng)Hemin與功能性ssDNA序列發(fā)生作用后，其辣根過氧化物酶活性顯著增強(qiáng)，可以使底物TMB失去2個電子，生成黃色產(chǎn)物在450nm處展現(xiàn)特征吸收峰。當(dāng)體系中存在四環(huán)素(TET)，則Hemin催化活性受到抑制，導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物在450nm處吸光值顯著降低。由于四環(huán)素濃度與產(chǎn)物吸光值下降的幅度(ΔA)成正比，所以通過測定產(chǎn)物吸光值變化或通過觀察顏色變化，可以判定四環(huán)素的含量。

在磷酸二氫鈉緩沖液體系下，于氯化血紅素催化反應(yīng)的四環(huán)素的便捷檢測方法，主要包含以下步驟：

步驟1：將功能性ssDNA序列與含有四環(huán)素的樣品混勻孵育，制備出待檢測樣液；

步驟2：將待檢測樣液與氯化血紅素混勻孵育，之后加入磷酸二氫鈉緩沖溶液混勻，然后加入H₂O₂和TMB，通過測定混合溶液在450nm處吸光值變化來判斷四環(huán)素的含量。

具體包括以下詳細(xì)步驟：

(1)制備已知四環(huán)素濃度的檢測體系：取15支1.5mL刻度離心管，分別加入5μL功能性ssDNA序列溶液和5μL不同濃度的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液，使得整個檢測體系中的四環(huán)素含量維持在10-200nM，充分混勻后置于30℃條件下孵育1h，之后加入5μL Hemin溶液繼續(xù)孵育30min。最后再加入磷酸二氫鈉緩沖溶液至500μL，充分混勻后留作以下測定用。

(2)另取1支按步驟(1)方法制備的檢測溶液，加入5μL三蒸水替代四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液，處理后作為空白對照體系溶液。

(3)分別向步驟(1)和步驟(2)制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對照液中加入10μL H₂O₂與10μL TMB溶液，混勻，然后分別取200μL標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對照液置于96孔酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀計進(jìn)行波長掃描，掃描范圍為300-800nm，獲得其吸收光譜，測定450nm波長處吸光值，獲得其吸收光譜。

(4)以不同濃度的四環(huán)素測定的ΔA(空白樣品的吸光值-待測樣品的吸光值)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(5)制備樣品檢測體系：取5μL實際樣液，按步驟(1)方法制備的檢測溶液，充分混勻后按步驟(3)方法測定其450nm處吸光值。

(6)根據(jù)樣品測得的吸光值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以求得不同樣品中四環(huán)素的含量。

本發(fā)明提供的檢測方法不需要依賴大型儀器設(shè)備，檢測特異性性好，且操作簡單快速，借助手持型比色計就可以實現(xiàn)四環(huán)素殘留現(xiàn)場檢測，因而可以廣泛應(yīng)用于食品中四環(huán)素殘留的快速檢測。

附圖說明

圖1展示了考查檢測四環(huán)素的可行性，圖中：1.Hemin+ssDNA；2.Hemin+ssDNA+50nM TET；3.Hemin+ssDNA+200nM TET；4.Hemin+H₂O；5.Hemin+TET；

圖2展示了不同濃度四環(huán)素與吸光值變化(ΔA)對應(yīng)關(guān)系；

圖3.展示了不同種類抗生素對四環(huán)素檢測的影響；

圖4展示了本發(fā)明應(yīng)用于乳制品中四環(huán)素的檢測示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實施例中如涉及數(shù)值或數(shù)值比例，如無注明均指質(zhì)量數(shù)值或質(zhì)量比例。

實施例1：

制備已知四環(huán)素濃度的檢測體系：取15支1.5mL刻度離心管，分別加入5μL濃度為100nM功能性ssDNA序列母液和5μL不同濃度的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液，使得整個檢測體系中的四環(huán)素含量維持在10-200nM。功能性ssDNA序列組成為：5’-ATCGGGTGTGGGTGGCGTA AAGGGAGCATCGGACA-3’。上述溶液充分混勻后置于30℃條件下孵育30min，之后加入5μL濃度為1mM的Hemin母液繼續(xù)孵育30min。最后再加入磷酸二氫鈉緩沖溶液至500μL，充分混勻后留作以下測定用。

(2)另取1支按步驟(1)方法制備的檢測溶液，加入5μL三蒸水替代四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液，處理后作為空白對照體系溶液。

(3)分別向步驟(1)和步驟(2)制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對照液中加入10μL 2MH₂O₂與10μL 5mM TMB溶液，混勻，然后分別取200μL標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對照液置于96孔酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀計進(jìn)行波長掃描，掃描范圍為300-800nm，獲得其吸收光譜，測定450nm波長處吸光值，獲得其吸收光譜，吸光值變化用表示。

(4)以不同濃度的四環(huán)素測定的ΔA(450nm)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示。得到線性范圍10～100nM，其對應(yīng)的回歸方程為y＝4×10^-3C+0.105，其中C指四環(huán)素濃度(nM)。

(5)制備樣品檢測體系：如圖5所示，取5μL隨機(jī)購買的不同乳制品(分別命名為牛奶-1和牛奶-2)樣本，按步驟(1)方法制備的檢測溶液，充分混勻后按步驟(3)方法測定其吸收峰值。

(6)根據(jù)樣品測得的吸光度值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以求得不同樣品中四環(huán)素的含量。

(7)實際樣本檢測效果驗證：用本發(fā)明方法測定2份隨機(jī)購買取得的牛奶-1和牛奶-2，分別往樣品中加入100nM和150nM的四環(huán)素，得到的回收率分別為98％和102％，證明本發(fā)明可靠性。

(8)本發(fā)明方法可以測定濃度范圍為10-200nM的四環(huán)素，其最低檢測限為5.69nM。

應(yīng)當(dāng)指出的是：對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些變形和改進(jìn)都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

SEQUENCE LISTING

序列表

<110> 貴州大學(xué)

<120> 一種基于氯化血紅素催化反應(yīng)的四環(huán)素比色檢測方法

<130> nm:

<160> 1

<170> PatentIn version

<210> 1

<211> 35

<212> ssDNA

<213> 人工序列

<400> 1

ATCGG GTGTG GGTGG CGTAA AGGGA GCATC GGACA 35