本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種痔瘡藥物指標(biāo)成分含量的檢測方法。

背景技術(shù)：

痔瘡是一種位于肛門部位的常見疾病，隨著年齡增長，發(fā)病率逐漸增高。用于治療痔瘡的痔瘡藥按類別可以分為三大類：西藥、中藥和中西藥復(fù)方制劑，中藥有痔炎消顆粒、痔康片和痔瘡止血丸等，中西藥復(fù)方制劑有化痔栓等，相比西藥，中藥和中西藥復(fù)方制劑的成分相對復(fù)雜。

《中國藥典》2015年版一部公開了化痔栓的處方為：次沒食子酸鉍200g、苦參370g、黃柏92.5g、洋金花55.5g、冰片30g?；趟ǖ闹品椋嚎鄥?、黃柏、洋金花加水煎煮二次，第一次4h，第二次2h；合并煎液，過濾并靜置12h，將上清液濃縮至相對密度為1.12(60～65℃)的清膏，干燥后粉碎成最細(xì)粉；將2.6g的羥苯乙酯用適量乙醇溶解；另取基質(zhì)適量，加熱熔化，加入次沒食子酸鉍、上述最細(xì)粉、冰片以及16.8g聚山梨酯80、羥苯乙酯乙醇液，混勻、灌注，即制成1000粒。本品清熱燥濕，收澀止血，用于大腸濕熱所致的內(nèi)外痔、混合痔瘡。目前，《中國藥典》僅收載了次沒食子酸鉍及冰片中龍腦的含量測定方法。化痔栓作為中西藥復(fù)方制劑，不是若干成分簡單地加合，而是多個活性成分整體發(fā)揮療效作用。現(xiàn)有技術(shù)僅對次沒食子酸鉍、冰片中的龍腦和苦參中的苦參堿進(jìn)行檢測，仍有多個指標(biāo)成分未得到檢測，缺乏全面性而不能反映藥品整體質(zhì)量。

此外，相關(guān)文獻(xiàn)有公布過：檢測含苦參、黃柏或洋金花藥材的中藥相關(guān)成分的含量，但這些方法仍舊比較片面，難以適用于化痔栓乃至痔瘡藥物的質(zhì)量檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供一種更全面、可靠的痔瘡藥物指標(biāo)成分含量的檢測方法，本發(fā)明將鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、苦參堿和氫溴酸東莨菪堿作為化痔栓乃至痔瘡藥的指標(biāo)成分，采用高效液相色譜法同時快速地定量測定，避免僅靠檢測單一成分而誤判藥物的質(zhì)量。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種痔瘡藥物指標(biāo)成分含量的檢測方法，所述指標(biāo)成分包括苦參堿、鹽酸黃柏堿、鹽酸小檗堿和氫溴酸東莨菪堿，所述檢測方法包括以下步驟：

1)痔瘡藥物供試品溶液的配制：將痔瘡藥物粉末置于醇溶液中提取，過濾，濃縮濾液；

對照品溶液的配制：配制苦參堿、鹽酸黃柏堿、鹽酸小檗堿和氫溴酸東莨菪堿的對照品溶液；

2)分別精密吸取痔瘡藥物供試品溶液和對照品溶液，注入高效液相色譜儀，測定；其中色譜條件選擇為：采用梯度洗脫，流動相A為乙腈，流動相B為含有十二烷基磺酸鈉的酸溶液，檢測波長為210～230nm，柱溫為20～30℃。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述檢測波長為220nm，柱溫為20℃，此時各指標(biāo)成分(苦參堿、鹽酸黃柏堿、鹽酸小檗堿和氫溴酸東莨菪堿)之間分離效果較佳。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述痔瘡藥物供試品溶液的配制具體為：將痔瘡藥物粉末置于醇溶液中，相對于每克痔瘡藥物，所述醇溶液的體積為20～30mL；超聲處理30～60min，冷卻后添加醇溶液，補(bǔ)足減小的重量；冷凍30～60min后進(jìn)行過濾，將濾液濃縮至原體積的2/25～1/8。

更優(yōu)選地，相對于每克痔瘡藥物，所述醇溶液的體積為25mL，濃縮液的體積為原體積的1/10，此時醇溶液提取的指標(biāo)成分含量更佳，不需要過度濃縮，且適合高效液相色譜的測定。

更優(yōu)選地，所述痔瘡藥物溶液配制的超聲處理時間為45min，冷凍時間為45min。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述對照品溶液的配制具體為：稱取苦參堿對照品、鹽酸黃柏堿對照品、鹽酸小檗堿對照品和氫溴酸東莨菪堿的對照品，加入所述醇溶液配制成苦參堿濃度為241.3～3860.0μg/mL、鹽酸黃柏堿濃度為27.4～438.4μg/mL、鹽酸小檗堿濃度為25.9～414.0μg/mL、氫溴酸東莨菪堿濃度為10.1～161.8μg/mL的混合溶液。對照品混合液濃度在上述范圍內(nèi)時，得出的線性關(guān)系更優(yōu)，檢測的指標(biāo)成分含量更準(zhǔn)確。

作為對上述技術(shù)方案的更進(jìn)一步改進(jìn)，所述醇溶液為50％～100％甲醇溶液或50％～100％乙醇溶液。50％～100％甲醇或乙醇提取的四種指標(biāo)成分效果更好，含量檢測的結(jié)果比較客觀。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述醇溶液為60％甲醇溶液。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述流動相B中的酸為冰醋酸、磷酸或甲酸，所述酸在流動相B中的體積百分?jǐn)?shù)為0.05％～0.3％，所述十二烷基磺酸鈉在流動相B中的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.1％～0.3％。

作為對上述技術(shù)方案的更進(jìn)一步改進(jìn)，所述酸在流動相B中的體積百分?jǐn)?shù)為0.1％，所述十二烷基磺酸鈉在流動相B中的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.2％。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述梯度洗脫的程序?yàn)椋?/p>

0～9min，流動相A為33％→35％，流動相B為67％→65％；

9～18min，流動相A為35％→40％，流動相B為65％→60％；

18～30min，流動相A為40％→50％，流動相B為60％→50％；

30～50min，流動相A為50％→60％，流動相B為50％→40％；

以上涉及的百分比均為體積百分比。

該梯度洗脫的程序能在保證分離四種指標(biāo)成分的前提下，縮短各組分的保留時間，提高檢測效率，同時確保色譜基線比較平穩(wěn)。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，測定時使用的色譜柱是以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的C₁₈柱。

作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述痔瘡藥物為化痔栓。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明將鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、苦參堿和氫溴酸東莨菪堿作為化痔栓乃至痔瘡藥物的指標(biāo)成分，規(guī)避了僅測定單一成分或兩種成分含量的問題；但是，中藥和中西藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，易影響分離、測定，本發(fā)明為此采用高效液相色譜法，從供試藥物溶液、對照品溶液的制備以及色譜條件和流動相系統(tǒng)選擇上通過大量創(chuàng)造性的勞動成功地實(shí)現(xiàn)了同時且快速測定四個指標(biāo)成分含量。該檢測方法同時還具有準(zhǔn)確度、精密度高，穩(wěn)定性、重復(fù)性及專屬性好的特點(diǎn)。

附圖說明

圖1是鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、苦參堿和氫溴酸東莨菪堿混合對照品溶液的HPLC色譜圖；

圖2是化痔栓供試藥物溶液的HPLC色譜圖；

圖3是陰性樣品溶液的HPLC色譜圖，其中陰性樣品不包括鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、苦參堿和氫溴酸東莨菪堿。

具體實(shí)施方式

為更好地說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例及附表對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

1)供試品溶液的配制：取化痔栓粉末約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中；向錐形瓶中精密加入60％甲醇25mL，密塞，稱定重量，超聲處理45min；放冷，再稱定重量，用60％甲醇補(bǔ)足減失的重量；搖勻，冷凍45min；過濾，精密移取續(xù)濾液20mL，濃縮至2mL，即得。

對照品溶液的配制：取鹽酸小檗堿對照品、鹽酸黃柏堿對照品、苦參堿對照品和氫溴酸東莨菪堿對照品適量，精密稱定，加60％甲醇制成苦參堿濃度為1930.0μg/mL、鹽酸黃柏堿濃度為109.6μg/mL、鹽酸小檗堿濃度為103.5μg/mL、氫溴酸東莨菪堿濃度為20.2μg/mL的混合對照品溶液。

2)高效液相色譜的測定條件：色譜柱是以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的C₁₈柱；流動相A為乙腈，流動相B為含0.2％十二烷基磺酸鈉的0.1％磷酸溶液；檢測波長為220nm，柱溫為20℃，進(jìn)樣量為10μL，梯度洗脫的程序見表1(其中，涉及的百分比為體積百分比)。供試品溶液的指標(biāo)成分含量(濃度)＝(對照品溶液濃度×供試品溶液峰面積)/對照品峰面積，下同。

表1為梯度洗脫程序

實(shí)施例2

檢測步驟參照實(shí)施例1，不同的是：供試藥物溶液和對照品溶液的配制過程中，以50％甲醇作為提取溶劑；供試品溶液配制過程中，超聲處理和冷凍時間為30min；混合對照品溶液中苦參堿濃度為241.3μg/mL、鹽酸黃柏堿濃度為27.4μg/mL、鹽酸小檗堿濃度為25.9μg/mL、氫溴酸東莨菪堿濃度為10.1μg/mL；高效液相色譜測定時，流動相B為含0.3％十二烷基磺酸鈉的0.05％磷酸溶液，檢測波長為210nm，柱溫為25℃。

實(shí)施例3

檢測步驟參照實(shí)施例1，不同的是：供試藥物溶液和對照品溶液的配制過程中，以甲醇作為為提取溶劑；供試品溶液配制過程中，超聲處理和冷凍時間為60min；混合對照品溶液中苦參堿濃度為3860.0μg/mL、鹽酸黃柏堿濃度為438.4μg/mL、鹽酸小檗堿濃度為414.0μg/mL、氫溴酸東莨菪堿濃度為161.8μg/mL；高效液相色譜測定時，流動相B為含0.1％十二烷基磺酸鈉的0.3％磷酸溶液，檢測波長為230nm，柱溫為30℃。

實(shí)施例4

檢測步驟參照實(shí)施例1，不同的是：供試品溶液和對照品溶液的配制過程中，以50％乙醇作為提取溶劑。

實(shí)施例5

檢測步驟參照實(shí)施例1，不同的是：供試品溶液和對照品溶液的配制過程中，以70％乙醇作為提取溶劑。

實(shí)施例6

檢測步驟參照實(shí)施例1，不同的是：供試品溶液和對照品溶液的配制過程中，以乙醇作為提取溶劑。

實(shí)施例7

檢測步驟參照實(shí)施例1，不同的是：高效液相色譜測定時，流動相B為含0.2％十二烷基磺酸鈉的0.1％冰醋酸溶液。

實(shí)施例8

檢測步驟參照實(shí)施例1，不同的是：高效液相色譜測定時，流動相B為含0.1％十二烷基磺酸鈉的0.05％冰醋酸溶液。

實(shí)施例9

檢測步驟參照實(shí)施例1，不同的是：高效液相色譜測定時，流動相B為含0.3％十二烷基磺酸鈉的0.3％冰醋酸溶液。

實(shí)施例10

檢測步驟參照實(shí)施例1，不同的是：高效液相色譜測定時，流動相B為含0.2％十二烷基磺酸鈉的0.1％甲酸溶液。

實(shí)施例11

檢測步驟參照實(shí)施例1，不同的是：高效液相色譜測定時，流動相B為含0.1％十二烷基磺酸鈉的0.05％甲酸溶液。

實(shí)施例12

檢測步驟參照實(shí)施例1，不同的是：高效液相色譜測定時，流動相B為含0.3％十二烷基磺酸鈉的0.3％甲酸溶液。

實(shí)施例13

指標(biāo)成分含量測定的驗(yàn)證

1 試驗(yàn)材料

本發(fā)明檢測方法中所用試劑均為市售，其中用于含量測定的乙腈為色譜純(LABSCIENCE公司生產(chǎn))，水為超純水，其它試劑為分析純?；趟ㄓ蓮V州白云山敬修堂藥業(yè)股份有限公司提供；苦參堿對照品由中國食品藥品檢定研究院提供，批號805-9001，含量為100％；鹽酸黃柏堿對照品由中國食品藥品檢定研究院提供，批號為111895-201303，含量為95.8％；鹽酸小檗堿對照品由中國食品藥品檢定研究院提供，批號為110713-201212，含量為86.7％；氫溴酸東莨菪堿對照品由中國食品藥品檢定研究院提供，批號100049-200308，含量為100％。

2 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，光電二極管陣列檢測器(DAD)，色譜柱為Agilent Eclipse Plus C₁₈柱(250mm×4.6mm，5μm)，Agilent ZORBAX SB-C₁₈柱(250mm×4.6mm，5μm)，Phenomenex Synergi 4μFusion-RP 80A柱(250mm×4.6mm，4μm)。KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，Precisa 404A、ME204T/02型電子分析天平。

3 痔瘡藥物供試品溶液的配制

取化痔栓粉末約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中；精密加入60％甲醇25mL；密塞錐形瓶，稱定重量，超聲處理45min；放冷，再稱定重量，用60％甲醇補(bǔ)足減失的重量；搖勻，冷凍45min；過濾，精密移取續(xù)濾液20mL，濃縮至2mL，即得。

4 對照品溶液的配制

取鹽酸小檗堿對照品、鹽酸黃柏堿對照品、苦參堿對照品和氫溴酸東莨菪堿對照品適量，精密稱定，加60％甲醇制成苦參堿濃度為1930.0μg/mL、鹽酸黃柏堿濃度為109.6μg/mL、鹽酸小檗堿濃度為103.5μg/mL、氫溴酸東莨菪堿濃度為20.2μg/mL的混合對照品溶液，即得。

5 高效液相色譜的測定條件

色譜柱為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的C₁₈柱；以乙腈為流動相A，以含0.2％十二烷基磺酸鈉的0.1％磷酸溶液為流動相B；檢測波長為220nm；柱溫為20℃，進(jìn)樣量為10μL；見表1梯度洗脫的程序。

6 線性關(guān)系考察

精密稱取對照品鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、苦參堿和氫溴酸東莨菪堿適量，加60％甲醇制成鹽酸小檗堿濃度為414.0μg/mL，鹽酸黃柏堿濃度為438.4μg/mL，苦參堿濃度為3860.0μg/mL，氫溴酸東莨菪堿濃度為161.8μg/mL的混合對照品溶液。通過稀釋即得混合對照品溶液中的鹽酸小檗堿濃度分別為25.9、51.8、103.5、207.0、414.0μg/mL，對應(yīng)的鹽酸黃柏堿濃度分別為27.4、54.8、109.6、219.2、438.4μg/mL，對應(yīng)的苦參堿濃度分別為241.3、482.5、965.0、1930.0、3860.0μg/mL,對應(yīng)的氫溴酸東莨菪堿濃度分別為10.1、20.2、40.4、80.9、161.8μg/mL。分別精密吸取上述對照品混合溶液各10μL，注入液相色譜儀，按含量測定方法測定。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對照品濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程見表2。從表2中，可以得出苦參堿濃度為241.3～3860.0μg/mL、鹽酸黃柏堿濃度為27.4～438.4μg/mL、鹽酸小檗堿濃度為25.9～414.0μg/mL、氫溴酸東莨菪堿濃度為10.1～161.8μg/mL的混合溶液中，四個指標(biāo)成分均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。在日常檢測中，只要樣品濃度在標(biāo)曲濃度范圍內(nèi)，則無需每次繪制標(biāo)曲，可采用外標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行檢測。

表2為線性關(guān)系考察結(jié)果

7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份化痔栓藥物，制備后，按含量測定方法，分別在0、2、4、8、16、24、32h進(jìn)樣測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)化痔栓溶液自制備后32h內(nèi)測定基本穩(wěn)定，見表3。

表3為穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批化痔栓6份，參照“供試藥物溶液的制備”，采用高效液相色譜進(jìn)行鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、苦參堿和氫溴酸東莨菪堿含量的測定，結(jié)果見表4。

表4為重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

9 不同色譜柱的比較

取同一批化痔栓2份，按含量測定方法，分別用A柱(Agilent Eclipse Plus C₁₈柱，規(guī)格250mm×4.6mm，5μm)、B柱(Agilent ZORBAX SB-C₁₈柱，規(guī)格250mm×4.6mm，5μm)、C柱(Phenomenex Synergi 4μFusion-RP 80A柱，規(guī)格250mm×4.6mm，4μm)三種型號的色譜柱測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用三種型號的色譜柱進(jìn)行測定，化痔栓的含量無明顯差別，結(jié)果見表5。

表5為不同色譜柱的測定結(jié)果

10 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批已知含量的化痔栓6份，每份取約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中；分別精密加入1mL鹽酸小檗堿對照品溶液(0.1235mg/mL)、1mL鹽酸黃柏堿對照品溶液(0.1226mg/mL)、1mL苦參堿對照品溶液(2.821mg/mL)和1mL氫溴酸東莨菪堿(0.02674mg/mL)，余下按“供試品溶液的制備”進(jìn)行處理并測定，結(jié)果見表6～表9。

表6鹽酸小檗堿的回收率

表7為鹽酸黃柏堿的回收率

表8為苦參堿的回收率

表9為氫溴酸東莨菪堿的回收率

11 專屬性試驗(yàn)

按化痔栓處方稱取除黃柏、苦參和洋金花以外的藥材，按制備工藝制成陰性樣品。再按供試藥物溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。精密吸取對照品溶液、化痔栓溶液和陰性樣品溶液各10μL，分別注入液相色譜儀，按含量測定方法進(jìn)行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在與鹽酸小檗堿對照品、鹽酸黃柏堿對照品、苦參堿對照品和氫溴酸東莨菪堿對照品色譜相應(yīng)的位置上，陰性樣品溶液無干擾，說明該測定方法具有較好的專屬性，見附圖1～3。

綜合上述，以上試驗(yàn)結(jié)果表明：該檢測方法操作簡便、可操作性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確、專屬性及重現(xiàn)性好，適合作為質(zhì)量控制方法，且在同一個HPLC方法條件下能同時測定鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、苦參堿和氫溴酸東莨菪堿四個指標(biāo)成分的含量。

最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)。