本發(fā)明屬于實(shí)驗(yàn)設(shè)備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于透射電鏡的載網(wǎng)。

背景技術(shù)：

低溫電子斷層成像三維重構(gòu)(cryo-ET)技術(shù)是發(fā)展結(jié)構(gòu)生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的重要技術(shù)。該技術(shù)可以得到更真實(shí)和接近天然的細(xì)胞內(nèi)部高分辨率三維結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)大分子定位及相互作用的信息，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要的輔助手段。

通常使用的樣品制備方法---冷凍切片技術(shù)，但是該方法有很多不可避免的問題阻礙了這種技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。近年來一種新的冷凍含水切片樣品的制備方法-聚焦離子束法(focused ion beam-FIB)制備冷凍含水切片樣品，冷凍含水切片樣品制備和轉(zhuǎn)移過程中，冷凍含水切片樣品的方向和定位信息對后期的低溫透射電鏡數(shù)據(jù)收集和光電關(guān)聯(lián)實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。同時(shí)冷凍含水切片樣品需要多步的轉(zhuǎn)移，載網(wǎng)的機(jī)械強(qiáng)度對實(shí)驗(yàn)的成功與否也有非常重要的影響。

現(xiàn)有的冷凍細(xì)胞的方法是將細(xì)胞樣品通過快速投擲冷凍到乙烷中，采用的載網(wǎng)是一般為圓形的銅網(wǎng)或者鎳網(wǎng)，并在在低溫透射電鏡下觀察得到的冷凍含水切片樣品。

但現(xiàn)有載網(wǎng)存在以下缺陷：1、現(xiàn)有載網(wǎng)為圓形，在培養(yǎng)、轉(zhuǎn)移和冷凍過程中載網(wǎng)無法保證冷凍含水切片樣品的同一方向性，而冷凍含水切片樣品的方向和定位信息對后期的低溫透射電鏡數(shù)據(jù)收集和光電關(guān)聯(lián)實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要；2、現(xiàn)有載網(wǎng)以銅和鎳作為主體材質(zhì)，造成載網(wǎng)較軟，剛性較差，在培養(yǎng)、轉(zhuǎn)移和冷凍過程中載網(wǎng)很容易變形和損壞，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種用于透射電鏡的載網(wǎng)，所述載網(wǎng)正投影的形狀為D形，相對傳統(tǒng)的圓形，所述載網(wǎng)能夠利用缺口作為定位的標(biāo)記，從而在培養(yǎng)、轉(zhuǎn)移和冷凍過程中載網(wǎng)保證冷凍含水切片樣品的同一方向性。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種用于透射電鏡的載網(wǎng)，所述載網(wǎng)正投影的形狀為D形，所述載網(wǎng)采用鉬制成。

所述載網(wǎng)相較傳統(tǒng)的圓形，利用缺口在多步轉(zhuǎn)移過程中保持同一方向性，同時(shí)，所述載網(wǎng)采用鉬制成，相較銅和鎳制成的載網(wǎng)，具有更好的機(jī)械強(qiáng)度和熱穩(wěn)定性，冷凍含水切片樣品在載網(wǎng)表面更加穩(wěn)定，冷凍后能夠在電鏡和光鏡等設(shè)備之間多次轉(zhuǎn)移。另外，相比銅網(wǎng)和鎳網(wǎng)，鉬網(wǎng)在低溫時(shí)，體積隨溫度變化的形變的程度更小，保證了冷凍后冰層不會因?yàn)闇囟茸兓a(chǎn)生破損。

所述載網(wǎng)正投影的形狀為缺少一弓形區(qū)域的圓，所述弓形區(qū)域的面積占所述圓面積的四分之一，所述圓的直徑為3mm。

傳統(tǒng)圓形載網(wǎng)去掉四分之一的面積，即得到所述載網(wǎng)，故本發(fā)明提供的載網(wǎng)盡管和傳統(tǒng)載網(wǎng)的形狀不同，但依然能夠和傳統(tǒng)載網(wǎng)通用。

所述載網(wǎng)上開設(shè)有200-300目的孔。

載網(wǎng)在使用時(shí)，起到承載細(xì)胞樣品的往往是靠近中心的區(qū)域，優(yōu)選地，所述載網(wǎng)的中部開設(shè)200-300目的孔，所述載網(wǎng)的邊緣不設(shè)孔，在增強(qiáng)了載網(wǎng)強(qiáng)度的同時(shí)，也不影響載網(wǎng)的正常使用。

為進(jìn)一步對所述載網(wǎng)上的細(xì)胞樣品進(jìn)行定位，優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述載網(wǎng)上還設(shè)有區(qū)域標(biāo)簽，所述區(qū)域標(biāo)簽和所述載網(wǎng)一體成型。

所述標(biāo)簽可以為字母或數(shù)字標(biāo)簽，也可以為其他其標(biāo)識作用的標(biāo)記符號標(biāo)簽，通過設(shè)置區(qū)域標(biāo)簽，可以將所述載網(wǎng)分為多個(gè)區(qū)域，能夠在起到更精準(zhǔn)的定位細(xì)胞樣品。

本發(fā)明的有益效果為：

1、本發(fā)明提供了一種用于透射電鏡的載網(wǎng)，所述載網(wǎng)正投影的形狀為D形，相對傳統(tǒng)的圓形，所述載網(wǎng)能夠利用缺口作為定位的標(biāo)記，從而在培養(yǎng)、轉(zhuǎn)移和冷凍過程中載網(wǎng)保證冷凍含水切片樣品的同一方向性。同時(shí)，所述載網(wǎng)采用鉬制成，相較銅和鎳制成的載網(wǎng)，具有更好的機(jī)械強(qiáng)度和熱穩(wěn)定性，冷凍含水切片樣品在載網(wǎng)表面更加穩(wěn)定，冷凍后能夠在電鏡和光鏡等設(shè)備之間多次轉(zhuǎn)移。

2、所述載網(wǎng)的中部開孔，增強(qiáng)了載網(wǎng)強(qiáng)度的同時(shí)，也不影響載網(wǎng)的正常使用；另外相比銅網(wǎng)和鎳網(wǎng)，鉬網(wǎng)在低溫時(shí)，體積隨溫度變化的形變的程度更小，保證了冷凍后冰層不會因?yàn)闇囟茸兓a(chǎn)生破損。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為實(shí)施例2中低倍下所述載網(wǎng)上制備完成的冷凍含水切片樣品的電鏡圖像。

圖中：1、載網(wǎng)；2、區(qū)域標(biāo)簽。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

如圖1所示，本發(fā)明提供了一種用于透射電鏡的載網(wǎng)，所述載網(wǎng)1正投影的形狀為D形，所述載網(wǎng)1采用鉬制成。確切的說，所述載網(wǎng)1正投影的形狀為缺少一弓形區(qū)域的圓，所述弓形區(qū)域的面積占所述圓面積的四分之一，所述圓的直徑為3mm。

載網(wǎng)1在使用時(shí)，起到承載細(xì)胞樣品的往往是靠近中心的區(qū)域，所述載網(wǎng)1的中部開設(shè)200-300目的孔，所述載網(wǎng)1的邊緣不設(shè)孔，在增強(qiáng)了載網(wǎng)1強(qiáng)度的同時(shí)，也不影響載網(wǎng)1的正常使用。

為進(jìn)一步對所述載網(wǎng)上1的細(xì)胞樣品進(jìn)行定位，所述載網(wǎng)1上還設(shè)有區(qū)域標(biāo)簽2，所述區(qū)域標(biāo)簽2和所述載網(wǎng)1一體成型。

通過設(shè)置區(qū)域標(biāo)簽2，可以將所述載網(wǎng)1分為多個(gè)區(qū)域，能夠在起到更精準(zhǔn)的定位細(xì)胞樣品。

實(shí)施例2

本實(shí)施例是使用實(shí)施例1中所述載網(wǎng)進(jìn)行的聚焦離子束法制備冷凍含水切片。實(shí)驗(yàn)設(shè)備為FEI公司生產(chǎn)的Helios Nanolab 600i雙束掃描電鏡，配備Quorum公司生產(chǎn)的PP3000T冷凍制備系統(tǒng)。

一、制備樣品

使用投擲冷凍技術(shù)將細(xì)胞樣品快速冷凍到200目的鉬載網(wǎng)上，采用在載網(wǎng)上正面滴加樣品從背面吸干的方法制備，以保證樣品冰層較薄。使用的細(xì)胞樣品包括大腸桿菌、蛔蟲精細(xì)胞和SF9細(xì)胞等。

二、載網(wǎng)轉(zhuǎn)移

將制冷凍制備好的表面帶有細(xì)胞樣品的所述載網(wǎng)通過樣品轉(zhuǎn)移裝置轉(zhuǎn)移到雙束掃描電鏡中進(jìn)行聚焦離子束切割。

三、透射電鏡成像

在所述載網(wǎng)上的細(xì)胞樣品經(jīng)過聚焦離子束減薄厚，剩下厚度300-400nm的冷凍含水切片。將載網(wǎng)轉(zhuǎn)移到透射電鏡樣品hold中進(jìn)行透射電鏡觀察。

在雙束掃描電鏡中制備樣品并轉(zhuǎn)移到透射電鏡中進(jìn)行觀察。在掃描電鏡中觀察制備的冷凍含水切片的位置和數(shù)量，并在垂直切片的方向觀察切片的厚度。在雙束掃描電鏡中制備的冷凍含水切片樣品經(jīng)過轉(zhuǎn)移到透射電鏡中進(jìn)行觀察，如圖2所示，可以看到切片保存完好。

最后所應(yīng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式而已，并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。