本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于磁納米-抗體復(fù)合粒子的多參數(shù)扇形層析試條制備技術(shù)。

背景技術(shù)：

POCT(Point Of Care Testing)即時(shí)檢驗(yàn)是檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)發(fā)展的新領(lǐng)域，它的快速發(fā)展得益于當(dāng)今高新技術(shù)的發(fā)展和綜合應(yīng)用，也順應(yīng)了目前高效快節(jié)奏的工作方式，可使病人及時(shí)得到診斷和治療。POCT特點(diǎn)中最根本的是省去了標(biāo)本的復(fù)雜預(yù)處理過程，在采樣現(xiàn)場即刻進(jìn)行分析，快速得到檢驗(yàn)結(jié)果，所以它不僅快速而且是現(xiàn)場分析，這是其他檢驗(yàn)方法無法實(shí)現(xiàn)的。POCT的真正含義即：不僅是專業(yè)的醫(yī)護(hù)人員，經(jīng)過簡單培訓(xùn)的病人及其家屬也能獨(dú)立完成并能獲得有助于臨床診斷的信息的移動(dòng)檢驗(yàn)系統(tǒng)。

免疫層析檢測技術(shù)是POCT檢測技術(shù)中一個(gè)成功的應(yīng)用典范，其中膠體金免疫層析可以快速通過目測方式實(shí)現(xiàn)ng/ml量級的快速檢測。但是會(huì)受到肉眼觀察的主觀判斷限制，且靈敏度受到一定限制，對于ng～pg/ml等更高量級的檢測需求就會(huì)無法達(dá)到。上轉(zhuǎn)換發(fā)光粒子(鑭系元素)、量子點(diǎn)、熒光免疫層析技術(shù)是近期發(fā)展的一類光學(xué)免疫層析檢測方法，檢測靈敏度更高，需要激發(fā)光和檢測光，但也受限于僅能檢測到檢測條表面的光。

磁粒子免疫層析(Magnetic particles ImmunoChromatographic Test)是結(jié)合磁粒子和免疫層析的新型層析技術(shù)，它采用超順磁納米粒子(粒子核直徑≤20nm)代替膠體金納米顆粒，通過測量磁場強(qiáng)度來判斷待測樣品的含量。磁免疫層析相比光學(xué)免疫層析技術(shù)具有幾點(diǎn)優(yōu)勢：三維透射檢測靈敏度高、順磁粒子性能穩(wěn)定、檢測范圍寬、檢測儀器比較便宜、標(biāo)記純化方便、可定量和可定性。

該方法繼承了膠體金免析法操作便捷、可現(xiàn)場檢測的優(yōu)勢，同時(shí)利用持續(xù)穩(wěn)定的特性，較好地克服了膠體金免疫層析法測量時(shí)間長與結(jié)果不穩(wěn)定兩大缺點(diǎn)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、操作簡便以及可現(xiàn)場快速篩查特點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

(一)要解決的技術(shù)問題

本發(fā)明提供了一種雙參數(shù)扇形免疫磁層析試條，以解決目前檢測手段不夠便捷、檢測步驟多的局限性問題：目前檢測針對尿液樣品中微量白蛋白及其更低濃度的蛋白類物質(zhì)和細(xì)胞等時(shí)，需要多步操作，不適于快速的現(xiàn)場檢測、床邊檢測等。多步檢測反應(yīng)，需要專業(yè)檢驗(yàn)人員。因此，本發(fā)明結(jié)合磁納米粒子免疫和層析技術(shù)，制備多參數(shù)扇形試條，實(shí)現(xiàn)簡單快速的POCT多參數(shù)檢測。

(二)技術(shù)方案

本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種雙參數(shù)扇形免疫磁層析試條，包括兩個(gè)單參數(shù)免疫磁層析試條，所述單參數(shù)免疫磁層析試條包括樣品墊，其特征在于：還包括支撐夾具，

所述支撐夾具采用Y型結(jié)構(gòu)將所述兩個(gè)單參數(shù)免疫磁層析試條固定；

所述兩個(gè)單參數(shù)免疫磁層析試條共用一個(gè)樣品墊。

上述方案中，所述兩個(gè)單參數(shù)免疫磁層析試條分別固定mAlb捕獲單抗和Tr捕獲單抗。

上述方案中，所述支撐夾具上設(shè)有樣品加樣區(qū)。

上述方案中，所述共用的樣品墊固定在所述支撐夾具的樣品加樣區(qū)處。

上述方案中，所述支撐夾具選用塑料基材。

上述方案中，所述樣品墊采用高多孔材料。

上述方案中，所述單參數(shù)免疫磁層析試條還包括結(jié)合墊、檢測帶、質(zhì)控帶、吸水墊以及基板襯底。

本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種雙參數(shù)扇形免疫磁層析試條的制備方法，包括：

將兩個(gè)單參數(shù)免疫磁層析試條固定在一個(gè)支撐夾具上，所述支撐夾具采用Y型結(jié)構(gòu)，然后將兩個(gè)單參數(shù)免疫磁層析試條共同固定在一個(gè)樣品墊上。

上述方案中，所述支撐夾具選用塑料基材。

上述方案中，所述樣品墊采用高多孔材料。

(三)有益效果

本發(fā)明具有以下有益效果：

1、本發(fā)明采用基于磁粒子的雙參數(shù)磁免疫層析試條，有效提高了檢測靈敏度，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，可實(shí)現(xiàn)定性和定量的雙重檢測，可以進(jìn)行異地樣品的雙參數(shù)的快速測定。

2、本發(fā)明雙參數(shù)磁免疫層析試條，結(jié)合磁粒子技術(shù)、免疫技術(shù)、層析技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對樣品中低濃度蛋白質(zhì)大分子等物質(zhì)的快速定量現(xiàn)場檢測。

附圖說明

圖1是本發(fā)明設(shè)計(jì)的單參數(shù)磁免疫試條的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2雙參數(shù)扇形磁免疫試條示意圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，并參照附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

本發(fā)明采用基于磁納米粒子和層析技術(shù)的免疫磁層析多參數(shù)扇形試條。本發(fā)明提及的磁納米粒子不衰減、不降解、不變性、不能被中和，檢測方便迅速，僅要求10s，不需要前處理和激活。另外試紙條可以長期保存并能夠重新檢測而其信號不丟失?？衫么偶{米粒子在強(qiáng)磁場中產(chǎn)生的磁性用磁鐵吸附，無須離心和過濾。

使用本發(fā)明的免疫磁層析多參數(shù)扇形可檢測但不僅限于檢測樣品中的蛋白質(zhì)大分子以及激素、農(nóng)藥殘留等小分子物質(zhì)。檢測樣品可以是全血、血漿、血清、尿液、唾液、體液等。采用免疫檢測原理，適用于樣品中含量低的待檢物。在芯片上固定多種抗體，檢測儀可以實(shí)現(xiàn)一個(gè)芯片上一次檢測2個(gè)指標(biāo)。

高血壓病通過引起良性小動(dòng)脈腎硬化而導(dǎo)致高血壓慢性腎損害，在良性小動(dòng)脈腎硬化出現(xiàn)臨床癥狀以前，常規(guī)血液及尿液檢查都正常的情況下，通過應(yīng)用比較靈敏的檢查手段仍能發(fā)現(xiàn)一些異常，這些可視為高血壓病的早期腎損害。聯(lián)合多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行檢測，可以排除個(gè)別炎癥等導(dǎo)致的不準(zhǔn)確，可以更為精確的進(jìn)行損傷的判斷。

圖1示出了本發(fā)明設(shè)計(jì)的單參數(shù)磁免疫試條的結(jié)構(gòu)示意圖。如圖所示，本發(fā)明公開了一種磁免疫試條，其包括：樣品墊、結(jié)合墊、檢測帶、質(zhì)控帶、廢液吸水區(qū)、分析模和襯底。該磁免疫試條用于生物樣品中蛋白大分子等極低濃度物質(zhì)的快速檢測。所述分析模置于襯底之上，結(jié)合墊與吸水墊置于分析模兩側(cè)，檢測帶與質(zhì)控帶置于分析模之上，樣品墊置于結(jié)合墊之上。

樣品墊為樣品滴加區(qū)，其為高親水性材料，待測樣品滴加在該區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，樣品墊采用高多孔材料，待測樣品滴加在該區(qū)域可迅速被滲入樣品墊，并且能快速移動(dòng)，不在樣品墊儲(chǔ)留；樣品墊材料，可采用玻璃纖維紙、濾紙等；需要進(jìn)行材料預(yù)處理。預(yù)處理液包括：大分子親水材料、蛋白質(zhì)保護(hù)性材料、表面活性劑。

結(jié)合墊為磁粒子-標(biāo)記單克隆抗體儲(chǔ)存區(qū)域，待測樣品中的抗原與單抗1結(jié)合，形成“磁粒子-標(biāo)記單抗-抗原”復(fù)合物。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，所述磁粒子直徑在10nm-5μm范圍，磁粒子進(jìn)行羥基、羧基等功能基團(tuán)修飾。所述標(biāo)記單抗包括：尿微量白蛋白標(biāo)記單抗、尿轉(zhuǎn)鐵蛋白標(biāo)記單抗。結(jié)合區(qū)域可用玻璃纖維素紙、濾紙等材料制備，結(jié)合區(qū)材料先進(jìn)行預(yù)處理并干燥后，噴涂磁粒子-標(biāo)記單抗復(fù)合粒子，低溫干燥。

所述尿微量白蛋白(urinary microalbumin，英文縮寫：mAlb)、尿轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferring，Tr)的增高多見于糖尿病腎病、高血壓、妊娠子癇前期，是腎損傷的早期敏感指標(biāo)。如果在體檢后發(fā)現(xiàn)尿中的微量白蛋白在20mg/L-200mg/L范圍內(nèi)，就屬于微量白蛋白尿，如果患者能夠經(jīng)過規(guī)范的修復(fù)腎單位，逆轉(zhuǎn)纖維化治療，尚可徹底修復(fù)腎小球，消除蛋白尿。而當(dāng)尿中微量白蛋白超過200mg/L時(shí)，此時(shí)證明腎病患者已有大量白蛋白漏出，腎病發(fā)展離不可逆期只有一步之遙，如果不及時(shí)進(jìn)行醫(yī)治，就會(huì)進(jìn)入尿毒癥期。

轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferring，Tr)的等電點(diǎn)較高，帶有較多的負(fù)電荷，而腎小球?yàn)V過膜也帶有大量的負(fù)電荷，當(dāng)轉(zhuǎn)鐵蛋白通過濾過膜時(shí)，受到的電荷排斥力較小，容易漏出，因而能更敏感的反映腎小球電荷屏障的受損。在腎小球損傷早期，程度較輕時(shí)，尿中僅有白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白濾出，稱為選擇性蛋白尿。轉(zhuǎn)鐵蛋白的獨(dú)特性使其在除了常規(guī)腎功能檢測外還能更廣泛的應(yīng)用于更早期、更輕微損傷的檢測。

檢測帶(固定單抗2反應(yīng)區(qū))為配對的捕獲單克隆抗體的固定區(qū)域，復(fù)合物流動(dòng)到該區(qū)，抗原與捕獲單克隆抗體結(jié)合，形成“磁粒子-標(biāo)記單抗-抗原-捕獲單抗”復(fù)合物，復(fù)合物被捕獲固定在該區(qū)域；由于磁微粒子是棕褐色，可以根據(jù)顏色深淺進(jìn)行濃度的目測，也可以采用磁檢測儀進(jìn)行定量檢測。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，檢測帶區(qū)域采用硝酸纖維素薄膜材料制備，其為捕獲單克隆抗體的固定區(qū)域，單抗采用噴涂或者劃線方式固定在硝酸纖維素膜材料上，復(fù)合物流動(dòng)到該區(qū)，抗原與固定的捕獲單抗結(jié)合，形成“磁粒子-標(biāo)記單抗-抗原-捕獲單抗”復(fù)合物，復(fù)合物被捕獲固定在該區(qū)域。采用目測定性檢測或者磁檢測儀進(jìn)行定量檢測。

質(zhì)控帶為單抗2的固定區(qū)域，過量的磁粒子-標(biāo)記單抗流動(dòng)到質(zhì)控帶區(qū)域，與抗抗體結(jié)合，起到質(zhì)控的作用。

吸水墊為廢液吸水區(qū)，其由強(qiáng)親水材料制備，多余的樣品液體被吸收儲(chǔ)存在此處。

基板襯底為試條的支撐結(jié)構(gòu)，可選用透明塑料基材，利于光學(xué)定量檢測。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，所述基板可選用不透明支撐材料或者透明塑料基材，結(jié)合不同的光學(xué)測量儀器，利于光學(xué)定量檢測。

圖2示出了在單參數(shù)免疫試條基礎(chǔ)上制備的雙參數(shù)扇形磁免疫試條示意圖。雙參數(shù)磁免疫試條制備方法與單參數(shù)相似，只是引流樣品墊是采用一個(gè)樣品墊覆蓋在兩個(gè)相鄰的免疫試條1和免疫試條2上，最后用塑料夾具將兩個(gè)磁免疫試條固定，便于磁檢測和試條保護(hù)。

塑料支撐夾具上有樣品加樣區(qū)，用于加入樣品。樣品后加入后向兩個(gè)試條流動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)雙參數(shù)檢測。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，所述塑料支撐夾具為試條的支撐夾持結(jié)構(gòu)，可選用普通塑料基材，采用Y型結(jié)構(gòu)，加樣區(qū)位于Y型結(jié)構(gòu)的底端便于雙參數(shù)試條進(jìn)樣和取放，利于磁定量檢測。由于配合磁檢測儀的近距離檢測，不能采用常規(guī)的塑料外殼封條。

本發(fā)明實(shí)施例還提供一種雙參數(shù)扇形免疫磁層析試條的制備方法：

步驟1、在塑料襯底上，預(yù)粘一層親水性薄紙，粘上纖維素膜，纖維素膜上固定捕獲單克隆抗體做為檢測帶、固定抗抗體做為質(zhì)控帶，干燥；粘好吸水紙材料。試條1固定mAlb捕獲單抗，試條2固定Tr捕獲單抗，噴量為2～5μl/cm，室溫干燥。

步驟2、再固定磁粒子-標(biāo)記單抗結(jié)合區(qū)的玻璃纖維素紙做為結(jié)合墊，噴涂磁粒子-標(biāo)記單克隆抗體，干燥；試條1固定mAlb標(biāo)記單抗，試條2固定Tr標(biāo)記單抗，噴量為1～2μl/cm，干燥。粘貼上單抗結(jié)合墊。

步驟3、切條，由于磁檢測限制，條帶寬度為4mm。

步驟4、將兩種試條分別固定在塑料夾具上。然后固定玻璃纖維素紙作為雙參數(shù)試條的共同引流樣品墊。將夾具扣合。

步驟5、密封干燥保存。

上述實(shí)施例采用基于磁粒子的雙參數(shù)磁免疫層析試條，有效提高了檢測靈敏度，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，可實(shí)現(xiàn)定性和定量的雙重檢測，可以進(jìn)行異地樣品的雙參數(shù)的快速測定。并且，由于該實(shí)施例結(jié)合了磁粒子技術(shù)、免疫技術(shù)、層析技術(shù)，因此能實(shí)現(xiàn)對樣品中低濃度蛋白質(zhì)大分子等物質(zhì)的快速定量現(xiàn)場檢測。

以上所述的具體實(shí)施例，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。