本發(fā)明涉及一種中藥制劑指紋圖譜的構(gòu)建方法，尤其是骨疏康制劑高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，屬于天然產(chǎn)物分析
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：骨疏康顆粒、骨疏康膠囊是由多種天然中藥材經(jīng)精工制作而成的中醫(yī)復(fù)方制劑，具有補(bǔ)腎益氣，活血壯骨的功效，臨床用于腎虛，氣血不足所致的中老年骨質(zhì)疏松癥。自骨疏康制劑上市以來，因其治療效果好，見效快，價(jià)格便宜，受到了廣大患者的好評(píng)。其主要成分包括淫羊藿、熟地黃、骨碎補(bǔ)、黃芪、丹參、木耳、黃瓜子，現(xiàn)代藥理研究已證明其含有多種生物活性物質(zhì)?，F(xiàn)有骨疏康制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)其主要成分淫羊藿苷進(jìn)行定量檢測(cè)，對(duì)于成分復(fù)雜、有效成分尚不十分明確的中成藥來說，單靠測(cè)定某種有效成分解決質(zhì)量檢測(cè)和產(chǎn)品批次間質(zhì)量差異的問題是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。為提高測(cè)定骨疏康制劑的有效成分及其含量的準(zhǔn)確性，發(fā)明人對(duì)骨疏康制劑的質(zhì)量控制技術(shù)做了更加深入的研究，采用目前國(guó)際公認(rèn)的同時(shí)具備實(shí)用性和科學(xué)性的天然植物制品指紋圖譜技術(shù)，通過高效液相色譜法(HPLC)對(duì)骨疏康制劑進(jìn)行指紋圖譜的研究，建立標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，達(dá)到準(zhǔn)確反映骨疏康產(chǎn)品中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量的目的，進(jìn)而對(duì)其中有效成分進(jìn)行科學(xué)的鑒別和測(cè)定的目的。目前，尚無骨疏康制劑指紋圖譜研究工作的報(bào)道。本發(fā)明提供一種檢測(cè)更加準(zhǔn)確、操作更加便捷、快速的骨疏康指紋圖譜的測(cè)定方法。彌補(bǔ)了現(xiàn)有骨疏康產(chǎn)品質(zhì)量控制技術(shù)的不足，使其質(zhì)量控制更加完善和科學(xué)，達(dá)到控制骨疏康產(chǎn)品質(zhì)量和監(jiān)控藥品安全生產(chǎn)的目的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種骨疏康制劑指紋圖譜的建立方法及其指紋圖譜，彌補(bǔ)現(xiàn)有骨疏康產(chǎn)品質(zhì)量控制技術(shù)的不足，使其質(zhì)量控制更加完善和科學(xué)，達(dá)到控制骨疏康產(chǎn)品質(zhì)量和監(jiān)控藥品安全生產(chǎn)的目的。根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種骨疏康制劑HPLC指紋圖譜的建立方法，包括以下步驟：1)骨疏康制劑供試品溶液的配制：精密稱定本品1.0g，研細(xì)，加甲醇20ml加熱回流1小時(shí)，放冷，濾過得濾液和濾餅，濾餅用10ml甲醇分2次洗滌，合并濾液及洗滌液蒸干得一次蒸干物，一次蒸干物再用20ml三氯甲烷分2次振搖提取，合并兩次三氯甲烷提取液后蒸干得二次蒸干物，二次蒸干物用甲醇定容至10ml量瓶中，采取0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；2)測(cè)定：取10個(gè)不同批次的骨疏康制劑，按照1)所述步驟制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀，比較11批骨疏康制劑的高效液相色譜圖，確定共有10個(gè)共有峰，建立了骨疏康制劑HPLC指紋圖譜；骨疏康制劑HPLC指紋圖譜各共有峰的來源確定：取各對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜儀得對(duì)照品HPLC圖譜，對(duì)照品HPLC圖譜與骨疏康制劑HPLC指紋圖譜對(duì)照得骨疏康制劑HPLC指紋圖譜各共有峰的來源；對(duì)照品溶液的配制：分別精密稱取淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、柚皮苷、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹參素、丹參酮ⅡA、丹酚酸B、木耳多糖、異槲皮甙適量，加甲醇使溶解，制成對(duì)照品溶液；各對(duì)照品溶液濃度分別為：淫羊藿苷為25μg/ml，毛蕊花糖苷為20μg/ml，柚皮苷為60μg/ml，黃芪甲苷為500μg/ml，毛蕊異黃酮葡萄糖苷為50μg/ml，丹參素為50μg/ml，丹參酮ⅡA為20μg/ml，丹酚酸B為100μg/ml，木耳多糖為70μg/ml，異槲皮甙為50μg/ml；本發(fā)明的測(cè)定方法，采用高效液相色譜法，其色譜條件為：色譜柱為PHENOMENEXLUNAC-18柱，填料粒徑5μm，柱長(zhǎng)250mm，柱內(nèi)徑4.6mm；檢測(cè)波長(zhǎng)270nm，柱溫30℃，流速1.0ml/min，進(jìn)樣量10μl；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為甲醇，B為乙腈，C為50mmol/L磷酸-30mmol/L三乙胺溶液(用2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至5.0)洗脫方式：梯度洗脫；理論塔板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)算不低于3000，與其它峰的分離度均大于1.0，所有組分均在65min內(nèi)被檢測(cè)完。其中，梯度洗脫過程如下表1表1.HPLC檢測(cè)梯度洗脫過程時(shí)間(分鐘)流動(dòng)相A流動(dòng)相B流動(dòng)相C0-155～10％3％～7％92％～83％16-2510％～15％7％～12％83％～73％26-5015～24％12％～30％73％～46％51-6024％～35％30％～45％46％～20％60-6535％45％20％本發(fā)明的測(cè)定方法是經(jīng)過創(chuàng)造性的篩選得來的，分別對(duì)供試品溶液的制備條件，色譜條件，檢測(cè)波長(zhǎng)和分析時(shí)間等條件進(jìn)行了優(yōu)選。其中，供試品溶液制備條件的考察：試驗(yàn)比較了不同提取溶劑如丙酮、乙醇、甲醇、三氯甲烷的水浴回流和索氏提取、超聲提取等不同提取方法的提取效果，結(jié)果以甲醇水浴回流提取的總體效果為佳。同時(shí)還考察了以甲醇為提取溶劑，不同提取時(shí)間(30，60，120min)的提取效果。結(jié)果表明，以甲醇為提取溶劑，回流提取60min，提取較完全，操作方法簡(jiǎn)便，且方法穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。同時(shí)還考察甲醇、乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷為萃取劑的分離效果。結(jié)果表明，以三氯甲烷為萃取劑，所得圖譜信息量較大，既含脂溶性成分也包括水溶性成分，符合指紋圖譜整體性的要求，其盡可能反映了藥材所含的全部信息，可以作為綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)的方法。其中，色譜條件的選擇及優(yōu)化，在流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇中，分別以甲醇-水、甲醇-0.05％磷酸水、乙腈-0.05％磷酸水、乙腈-甲醇-0.05％磷酸三乙胺水等不同體積分?jǐn)?shù)、不同比例的流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了等度和梯度洗脫試驗(yàn)。結(jié)果表明，用乙腈-甲醇-磷酸三乙胺水溶液進(jìn)行梯度洗脫為佳，色譜峰檢測(cè)比較全面，鋒形尖銳且分離度較好，峰面積較大，調(diào)整流動(dòng)相不同時(shí)間洗脫比例之后，各峰的保留時(shí)間適中，且基線較平穩(wěn)，不易漂移，同時(shí)提高了色譜圖的分離度，有效避免了色譜圖的拖尾現(xiàn)象，有利于指紋圖譜的分析。其中，檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，對(duì)190～400nm掃描的各波長(zhǎng)下的色譜圖進(jìn)行比較分析，結(jié)果270nm處檢測(cè)的色譜圖不僅基線平穩(wěn)，信息量多，各色譜峰的分離效果很好，峰面積大。因此，選270nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。同時(shí)按照試行標(biāo)準(zhǔn)的要求考察了其他波長(zhǎng)下的色譜圖，其結(jié)果顯示骨疏康顆粒在不同波長(zhǎng)下的色譜指紋圖譜具有很好的相似度。其中，分析時(shí)間的選擇，在選擇指紋圖譜的洗脫時(shí)間時(shí)記錄了2h的色譜行為圖。結(jié)果表明60min以后基本沒有色譜峰出現(xiàn)，同時(shí)為了照顧樣品的差異性，保證所有樣品的特征峰都能夠被檢出，因此選擇65min作為分析時(shí)間。本發(fā)明所述的骨疏康制劑可以為：顆粒劑、膠囊或片劑等口服固體制劑。本發(fā)明中骨疏康制劑由淫羊藿，熟地黃，骨碎補(bǔ)，黃芪，丹參，木耳，黃瓜子組成。各重量配比如下：淫羊藿7.5％-70％，熟地黃6％-50％，骨碎補(bǔ)5％-65％，黃芪5％-40％，丹參5％-60％，木耳3％-20％，黃瓜子5％-30％。優(yōu)選的淫羊藿17.5％，熟地黃23.2％，骨碎補(bǔ)11.6％，黃芪17.5％，丹參11.6％，木耳9.3％，黃瓜子9.3％。所述的骨疏康制劑的制備方法，包括以下步驟：黃瓜子破碎，與木耳加水煎煮1-4次，每次加水3-20倍量，每次煎煮1-4.5小時(shí)，煎液分別濾過，濾液減壓濃縮至相對(duì)密度約為1.00-1.35、溫度為20℃-100℃的清膏；丹參用乙醇回流提取1-4次，每次加乙醇2-12倍量，每次回流提取1-4.5小時(shí)，合并濾液，回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度約為1.00-1.35、溫度為20℃-100℃的清膏；丹參藥渣與淫羊藿、熟地黃、骨碎補(bǔ)、黃芪加水煎煮1-6次，每次加水3-12倍量，每次煎煮1-4.5小時(shí)，合并煎液，靜置2-24小時(shí)，取上清液，經(jīng)吸附樹脂吸附，用20％-95％濃度乙醇洗脫，洗脫液回收乙醇，并濃縮至相對(duì)密度為1.00-1.35、溫度為20℃-100℃的清膏；取上述清膏，干燥，粉碎，制成骨疏康制劑，包裝，即得。本發(fā)明建立的骨疏康制劑HPLC指紋圖譜在檢測(cè)中可以對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量的檢測(cè)，將檢測(cè)樣品的指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究版(2004A)”，通過“相似度計(jì)算”功能進(jìn)行色譜圖譜樣本與骨疏康標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)。相似度大于或等于0.9即為合格產(chǎn)品，小于0.9即為不合格產(chǎn)品。本發(fā)明的測(cè)定方法與現(xiàn)有方法相比較，檢測(cè)更加準(zhǔn)確，操作更加簡(jiǎn)便，有效的縮短了檢測(cè)時(shí)間，重現(xiàn)性好和信息量大。附圖說明圖1為本發(fā)明建立的骨疏康制劑HPLC指紋圖譜和10批骨疏康HPLC圖譜疊圖；圖2為本發(fā)明建立的骨疏康制劑HPLC指紋圖譜。具體實(shí)施方式實(shí)施例一、器材與方法1.1儀器：Agilent1200型高效液相色譜儀(四元泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器)。1.2試劑甲醇、乙腈、為色譜醇(美國(guó)Tedia試劑公司)，水為二次蒸餾水，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、柚皮苷、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹參素、丹參酮ⅡA、丹酚酸B、木耳多糖、異槲皮甙標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。骨疏康顆粒由遼寧康辰藥業(yè)有限責(zé)任公司提供(批號(hào)：150301、150415、150502、150613、150709、150815、150911、151012、151107、151203)，藥品批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字Z20003255。1.3色譜條件：色譜柱為PHENOMENEXLUNAC-18柱(250mm×4.6mm,5μm)(美國(guó)Phenomenex公司)；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為甲醇，B為乙腈，C為50mmol/L磷酸-30mmol/L三乙胺溶液(用2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至5.0)。檢測(cè)波長(zhǎng)270nm，柱溫30℃，流速1.0ml/min，進(jìn)樣量10μl。理論塔板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)算不低于3000，與其它峰的分離度均大于1.0，所有組分均在65min內(nèi)被檢測(cè)完。梯度洗脫過程如下表1表1.HPLC檢測(cè)梯度洗脫過程時(shí)間(分鐘)流動(dòng)相A流動(dòng)相B流動(dòng)相C0-155～10％3％～7％92％～83％16-2510％～15％7％～12％83％～73％26-5015～24％12％～30％73％～46％51-6024％～35％30％～45％46％～20％60-6535％45％20％1.4供試品溶液的制備及其檢測(cè)：骨疏康制劑供試品溶液的配制：精密稱定本品1.0g，研細(xì)，加甲醇20ml加熱回流1小時(shí)，放冷，濾過得濾液和濾餅，濾餅用10ml甲醇分2次洗滌，合并濾液及洗滌液蒸干得一次蒸干物，一次蒸干物再用20ml三氯甲烷分2次振搖提取，合并兩次三氯甲烷提取液后蒸干得二次蒸干物，二次蒸干物用甲醇定容至10ml量瓶中，采取0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；取遼寧康辰藥業(yè)有限責(zé)任公司提供10個(gè)批次的骨疏康顆粒，制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀，按照1.3所述色譜條件進(jìn)行分析，記錄65min色譜圖，得出10批次骨疏康顆粒共有峰的骨疏康制劑HPLC指紋圖譜。1.5標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備及其檢測(cè)：精密稱取淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、柚皮苷、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹參素、丹參酮ⅡA、丹酚酸B、木耳多糖、異槲皮甙適量，加甲醇使溶解，分別制成對(duì)照品溶液；其濃度分別為：淫羊藿苷為25μg/ml，毛蕊花糖苷為20μg/ml，柚皮苷為60μg/ml，黃芪甲苷為500μg/ml，毛蕊異黃酮葡萄糖苷為50μg/ml，丹參素為50μg/ml，丹參酮ⅡA為20μg/ml，丹酚酸B為100μg/ml，木耳多糖為70μg/ml，異槲皮甙為50μg/ml。按照1.3的檢測(cè)方法通過HPLC檢測(cè)定位。對(duì)照品HPLC譜圖與1.4得出的骨疏康制劑HPLC指紋圖譜比較確定：1號(hào)峰為木耳多糖，2號(hào)峰為丹參素，3號(hào)峰為淫羊藿苷，4號(hào)峰為柚皮苷，5號(hào)峰為異槲皮甙，6號(hào)峰為丹參酮ⅡA；7號(hào)峰為毛蕊花糖苷，8號(hào)峰為丹酚酸B，9號(hào)峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，10號(hào)峰為黃芪甲苷。以2號(hào)峰作為指紋圖譜的參比峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果如下表2和3所示：表2.10批骨疏康指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間表3.10批骨疏康指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積應(yīng)用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究版(2004A)”對(duì)檢測(cè)的10批骨疏康指紋圖譜進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如下表4。表410批骨疏康指紋圖譜的相似度結(jié)果二、對(duì)本發(fā)明開發(fā)出的骨疏康制劑HPLC指紋圖譜的檢測(cè)方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果如下：2.1穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品，分別在0,2,4,8,16,24h進(jìn)樣，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的一致性，結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3％，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.2精密度實(shí)驗(yàn)：取同一供試品，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得的結(jié)果顯示，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3％，結(jié)果表明本方法精密度良好，符合指紋圖譜測(cè)定要求。2.3重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批號(hào)的樣品，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3％，表明該方法重復(fù)性良好。三、本發(fā)明建立的骨疏康制劑HPLC指紋圖譜可進(jìn)行待測(cè)樣品質(zhì)量的判斷結(jié)果判定依據(jù)：將檢測(cè)樣品利用本發(fā)明構(gòu)建的檢測(cè)方法進(jìn)行檢驗(yàn)，將HPLC指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究版(2004A)”，通過“相似度計(jì)算”功能進(jìn)行色譜圖譜樣本與本發(fā)明建立的骨疏康制劑HPLC指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)。相似度大于或等于0.9即為合格產(chǎn)品，小于0.9即為不合格產(chǎn)品。當(dāng)前第1頁1 2 3