本發(fā)明屬于煙草成分檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種定量測定煙草中Amadori化合物的分析方法，具體是采用溶劑直接萃取煙草粉末，萃取液經(jīng)離心、過濾、稀釋后，直接采用HPLC-MS/MS同時定量檢測10種Amadori化合物的含量。
背景技術(shù)：
：Amadori化合物是由還原糖和氨基酸（或其它含氨基基團(tuán)化合物）經(jīng)縮合、脫水、Amadori重排而得到的一類美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物，即1-氨基-1-脫氧-2-酮糖。據(jù)報道[1]，在烤煙煙葉中Amadori化合物總量在2%以上，是重要的煙草香味成分前體物，對卷煙的感官品質(zhì)具有重要作用。關(guān)于Amadori化合物的測定，國外最早采用氨基酸分析儀、GC進(jìn)行測定，但均存在一定問題。如，氨基酸分析儀存在分離度不足、定性不準(zhǔn)確、干擾嚴(yán)重的問題；而GC方法衍生化將引入多個異構(gòu)體，難以進(jìn)行定量。2010年后，有兩篇文獻(xiàn)報道了用HPLC-MS/MS分析煙草中的Amadori化合物的相關(guān)研究[2,3]，但是測定的Amadori化合物數(shù)目分別為2個和6個，測定指標(biāo)數(shù)量較少,且均未涵蓋煙草中含量較高的Fru-Asn（葡萄糖和天冬酰胺反應(yīng)生成的Amadori化合物），可能原因是受到色譜方法的分離度不足的限制。根據(jù)系統(tǒng)調(diào)研，目前已有文獻(xiàn)方法檢測目標(biāo)也均沒有覆蓋結(jié)構(gòu)近似的1對異構(gòu)體化合物，即Fru-Ile和Fru-Leu（葡萄糖和異亮氨酸、亮氨酸分別形成的Amadori化合物），其主要原因是目前文獻(xiàn)方法中Fru-Ile與Fru-Leu的色譜峰均不能分開，導(dǎo)致無法定量。發(fā)明專利CN201310487876公開了一種煙草中同時測定Amadori化合物的方法，該方法的樣品前處理步驟包括萃取、過濾、凈化、HPLC-MS/MS測定步驟。其中凈化步驟需要向濾液中加入正己烷進(jìn)行萃取多次，再將甲醇-水相濃縮至干，用甲醇水溶液再定容，過有機(jī)濾膜。發(fā)明專利CN201310487876.9所采用的樣品前處理步驟較為繁瑣，需要引入正己烷進(jìn)行多次萃取。除此之外，CN201310487876.9所采用樣品前處理步驟中需要對甲醇-水溶液進(jìn)行濃縮蒸干，而甲醇-水溶液的濃縮蒸干過程是必須引入進(jìn)行加熱的。但是，Amadori化合物由糖和氨基酸（或其他含氨基化合物）反應(yīng)生成的中間產(chǎn)物，在加熱的條件下，會導(dǎo)致Amadori化合物進(jìn)一步分解生成小分子的醛、酮、酸等物質(zhì)，所以Amadori化合物的分析方法的樣品前處理步驟應(yīng)該盡量避免加熱以防止副反應(yīng)發(fā)生。因此，開發(fā)一種簡單、快速、前處理方法溫和、準(zhǔn)確度及精密度高且可同時定量測定煙草中多種Amadori化合物的分析方法是一個迫切需要解決的問題，對煙草品質(zhì)評價、卷煙配方開發(fā)具有著重要指導(dǎo)意義，對食品等行業(yè)具有著重要的參考價值。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有狀況而提供一種采用HPLC-MS/MS定量測定煙草中Amadori化合物的分析方法，該方法操作簡單、快速、溫和，準(zhǔn)確度及靈敏度高，重現(xiàn)性及回收率好，可同時實現(xiàn)10種Amadori化合物的測定，且10種化合物涵蓋了煙草中豐度最高的Fru-Asn，以及一對異構(gòu)體Fru-Leu和Fru-Lle。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種測定煙草中Amadori化合物的分析方法，其特征在于：包括下列步驟：1）將煙葉或煙絲樣品研磨成粉，過40目篩；2）稱取煙末樣品50～200mg，加入20～40mL甲醇/水（3:7，v:v），超聲萃取20～40min，在5000～10000rpm轉(zhuǎn)速下離心3～10min后，取上清液采用0.22上清濾膜過濾；3）將濾液用稀釋溶劑稀釋5～20倍后，得樣品溶液；4）樣品溶液直接用于HPLC-MS/MS分析，采用外標(biāo)法定量測定如表1所示10種Amdori化合物含量。HPLC-MS/MS分析條件如下：采用規(guī)格為250mm×2.1mmi.d.,5.0μm的AtlantisHILICSilica色譜柱；柱溫：25oC；進(jìn)樣量：5μL；流速：600μL/min；流動相：A.0.2%甲酸溶液，B.乙腈；洗脫梯度：0-0.1min，10.5%B到22%B梯度洗脫，0.1-10min,22%B；離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描模式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；氣簾氣壓力：15psi；碰撞氣壓力：7psi；噴霧電壓（Capillaryvoltage）：5500V；霧化溫度：550oC；霧化氣壓力：60psi；輔助氣壓力：75psi。步驟4）中稀釋溶劑為甲醇、乙腈或甲醇/乙腈混合溶劑（任意混合比例）。10種Amadori分析物的名稱及MRM參數(shù)見表1.表110種Amadori化合物的MRM參數(shù)注：1-10的Amadori化合物分別是葡萄糖與氨水、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、脯氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸反應(yīng)形成的Amadori化合物。本發(fā)明的特點(diǎn)在于：用萃取溶劑直接萃取煙草樣品，萃取液經(jīng)離心、過濾、稀釋后采用HPLC-MS/MS進(jìn)行分析，可同時對煙葉、煙絲中10種Amadori化合物進(jìn)行定量檢測，并可首次對Fru-Leu，F(xiàn)ru-Ile這兩種異構(gòu)體實現(xiàn)分離、測定，具有操作簡單、快速、重新性及回收率好、靈敏度及準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)。附圖說明圖1為標(biāo)樣（左圖）及一種烤煙煙葉樣品（右圖）中10種Amadori化合物的MRM圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實施例1將Fru-Leu,Fru-Asn,Fru-Trp,Fru-Pro,Fru-Phe,Fru-Val,Fru-Lle,Fru-Ala,Fru-Glu,Glucosamine共10種Amadori化合物配制成不同濃度的混合系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中Fru-Pro、Fru-Asn的濃度梯度為0.05、0.2、0.5、2.0、5.0、10.0μg/mL，而其它8種Amadori化合物濃度梯度為0.005、0.02、0.05、0.2、0.5、1.0μg/mL。用HPLC-MS/MS對系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行分析，以目標(biāo)物的色譜峰面積對濃度進(jìn)行線性回歸分析，線性方程及相關(guān)系數(shù)如表2所示。以最低濃度混標(biāo)溶液進(jìn)行10次測定，計算10種目標(biāo)物色譜峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為檢出限，10種標(biāo)準(zhǔn)偏差為定量限,結(jié)果列入表2。結(jié)果表明，方法線性好，檢出限低。表2方法線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限化合物線性方程相關(guān)系數(shù)r線性范圍μg/mL檢出限ng/mL定量限ng/mLGlucosaminey=5.97×103x+1.85×1040.99940.005–1.001.926.40Fru-Alay=6.08×103x+1.79×1040.99980.005–1.001.525.07Fru-Asny=2.26×103x-2.99×1030.99980.050–10.02.538.33Fru-Gluy=5.61×103x-1.31×1030.99960.005–1.001.836.09Fru-Proy=3.37×103x+4.88×1030.99990.050–10.01.595.31Fru-Valy=1.14×104x+5.32×1030.99980.005–1.001.765.87Fru-Lley=9.18×103x-5430.99970.005–1.002.117.04Fru-Leuy=7.47×103x+8.3×1030.99900.005–1.001.575.22Fru-Phey=8.87×103x+4.82×1030.99990.005–1.001.354.51Fru-Trpy=1.21×104x-5.27×1040.99770.005–1.001.645.48實施例2稱量100mg同一煙粉樣品，加入20mL甲醇/水（3:7,v:v），超聲萃取30min；在5000rpm轉(zhuǎn)速下離心3min后，取上清液5mL過濾，取1mL濾液用甲醇稀釋10倍后，采用HPLC-MS/MS測定，HPLC-MS/MS方法參考
發(fā)明內(nèi)容部分。按照上述操作進(jìn)行日內(nèi)6次平行和日間6次平行試驗，計算測定結(jié)果的日內(nèi)精密度和日間精密度，如表3所示，日內(nèi)精密度小于4.1%，日間精密度小于5.4%，證明方法的重現(xiàn)性較好。表3方法日內(nèi)精密度及日間精密度實施例3稱量實施例2所用煙草樣品100mg，分別添加濃度為高、中、低含量水平的Amadori標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，其中每個添加濃度水平下進(jìn)行3次重復(fù)實驗，其它操作步驟和實施例2完全相同，采用HPLC-MS/MS進(jìn)行測定并計算回收率。如表4所示，對10種目標(biāo)Amadori化合物，三個添加水平下，回收率在86.1%～120.3%，結(jié)果較為滿意。表4方法回收率實施例4稱量200mg的樣品A（烤煙煙葉粉末）、樣品B（白肋煙煙葉粉末）、樣品C（香料煙煙葉粉末），分別加入30mL甲醇/水（3:7,v:v），超聲萃取40min；在8000rpm轉(zhuǎn)速下離心3min后，取上清液5mL過濾，取1mL濾液用甲醇稀釋（樣品A、C稀釋10倍，樣品B稀釋3倍），采用HPLC-MS/MS測定，HPLC-MS/MS方法參考
發(fā)明內(nèi)容部分。測定結(jié)果如表5所示，表明烤煙、白肋煙、香料煙煙絲樣品中Amadori化合物的含量具有較大差異性。參考文獻(xiàn)：[1]Dickerson.Useofadditivestoenhanceformationofamadoricompoundsduringaging[J].ChemicalResearch.1972;1101-1150.[2]ZhouW,WangJ,WuD.Determinationofimportantflavourprecursorcompounds(Amadoricompounds)incigarettesbyLC-MS/MS[J].JournalofAnalyticalChemistry,2014,69(7):691-695.[3]賈春曉，修龍飛，牟定榮，毛多斌,液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定煙草中6種Amadori化合物,質(zhì)譜學(xué)報，36（1）:45-51。當(dāng)前第1頁1 2 3