本發(fā)明涉及電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種以硫化鎘和二硫化鉬納米復(fù)合物（CdS/MoS₂）為發(fā)光材料和基底材料，以過(guò)硫酸鉀和過(guò)氧化氫為雙共反應(yīng)劑的免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用。將CdS和MoS₂兩種帶隙相近的半導(dǎo)體納米材料復(fù)合可以有效提高傳感器的發(fā)光強(qiáng)度、并且增強(qiáng)穩(wěn)定性。過(guò)硫酸鉀和過(guò)氧化氫同時(shí)做共反應(yīng)劑，可以發(fā)揮協(xié)同作用，提高傳感器的發(fā)光強(qiáng)度?；诳乖贵w之間的特異性結(jié)合，該傳感器用于檢測(cè)原降鈣素（PCT），根據(jù)不同濃度的PCT對(duì)電子傳遞阻礙程度不同，繼而使得傳感器電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度不同，實(shí)現(xiàn)PCT的檢測(cè)。。

背景技術(shù)：

PCT屬于一種降鈣素前肽物質(zhì)，無(wú)激素活性，在血清中的水平升高是由于嚴(yán)重的細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)的感染破壞以及膿毒癥和多臟器功能衰竭而致，PCT在自身免疫、過(guò)敏和病毒感染時(shí)，含量不會(huì)升高。因此PCT可以對(duì)細(xì)菌、真菌引起的系統(tǒng)性感染作出診斷，PCT將會(huì)被視為全身性細(xì)菌感染和膿毒癥輔助以及鑒別診斷的常規(guī)指標(biāo)。目前對(duì)PCT抗原的檢測(cè)手段主要有放射免疫學(xué)分析法、雙抗夾心免疫化學(xué)發(fā)光法(ILMA)、膠體金比色法、透射免疫濁度法。這些方法具有較高的靈敏度和選擇性，但檢測(cè)過(guò)程需要昂貴的專用儀器，需要復(fù)雜的前處理且操作繁瑣、樣品消耗量較大，不適宜快速檢測(cè)。電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器具有設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，靈敏度高，選擇性好，檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明基于電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的優(yōu)點(diǎn)制備了一種基于雙共反應(yīng)劑放大信號(hào)的PCT電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，將免疫學(xué)方法與電致化學(xué)發(fā)光技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)抗原抗體之間的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)PCT的靈敏檢測(cè)。

本發(fā)明中CdS/MoS₂作為基底材料，一方面由于其比表面積大、成膜能力強(qiáng)，可以固定大量抗體；另一方面由于 MoS₂和CdS具有相近的帶隙結(jié)構(gòu)，兩者復(fù)合可以有效增強(qiáng)光電轉(zhuǎn)換效率，提高電致化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度和穩(wěn)定性，進(jìn)而提高靈敏度。而過(guò)硫酸鉀和過(guò)氧化氫做雙共反應(yīng)劑，可以發(fā)揮協(xié)同作用，進(jìn)一步提高傳感器的靈敏度。本發(fā)明中構(gòu)建的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器具有制備過(guò)程簡(jiǎn)單，成本低，穩(wěn)定性好，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，為 PCT檢測(cè)提供了一種可行的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是以CdS/MoS₂為基底和發(fā)光材料，以過(guò)硫酸鉀和過(guò)氧化氫做雙共反應(yīng)劑增強(qiáng)電致發(fā)光強(qiáng)度，構(gòu)建一種簡(jiǎn)單快速，穩(wěn)定性好，靈敏度高的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，并且將該電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于PCT的靈敏檢測(cè)。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

1. 一種基于雙共反應(yīng)劑放大信號(hào)的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法：

(1)用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm的Al₂O₃拋光粉依次打磨直徑為4 mm的玻碳電極(GCE)，分別在乙醇和超純水中超聲清洗5 min，氮?dú)獯蹈桑?~10 μL CdS/MoS₂納米復(fù)合材料分散液滴涂到電極表面，室溫下晾干成膜，用PBS (pH 7.4) 緩沖溶液沖洗以除去未鍵合的CdS/MoS₂得到CdS/MoS₂/GCE；

(2)取10 μL 8 ~10μg/mL的原降鈣素抗體(anti-PCT)標(biāo)準(zhǔn)溶液滴涂到電極表面，4 ℃下孵化過(guò)夜，用PBS (pH 7.4)緩沖溶液沖洗得anti-PCT/CdS/MoS₂/GCE；

(3)取10 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1~3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到電極表面，在37℃下孵化1 h，封閉非特異性結(jié)合的位點(diǎn)，用PBS (pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面得到BSA/anti-PCT/CdS/MoS₂/GCE；

(4)滴加10 μL濃度為0.0001~10 ng/mL的一系列不同濃度的原降鈣素標(biāo)準(zhǔn)溶液用于與抗體特異性識(shí)別，在37 ℃下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面，制得一種基于CdS/MoS₂的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器(PCT/BSA/anti-PCT/CdS/MoS₂/GCE)。

上述的CdS/MoS₂分散液的制備：

稱取一定量摩爾比例為1:1的CdCl₂和NaMoO₄加入到100 mL 水中，超聲至完全溶解，加入2.66 g硫脲和1.0 g PVP，攪拌得乳白色分散液，將分散液轉(zhuǎn)移到100 mL高壓釜中，180℃反應(yīng)48h，自然冷卻。用水和乙醇（1:1）洗滌三次，干燥過(guò)夜，得CdS/MoS₂粉末。稱取10 mg CdS/MoS₂粉末超聲分散到10 mL超純水中，即得CdS/MoS₂粉末分散液。

的檢測(cè)：

(1) PCT/BSA/anti-AFP/CdS/MoS₂/GCE為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對(duì)電極；使用MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光分析測(cè)試系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試，將光電倍增管的高壓設(shè)置為800 V，掃描區(qū)間為-1.8~0 V，掃描速度為100 mV/s；

(2)在10 mL含有0.1 mol/L過(guò)硫酸鉀和8~12 mmol/L過(guò)氧化氫的PBS(pH 7.4)緩沖溶液的電解池中，通過(guò)MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光分析測(cè)試系統(tǒng)檢測(cè)0.0001~10 ng/mL一系列不同濃度PCT標(biāo)準(zhǔn)溶液的電極的電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，繪制工作曲線；

(3)將待測(cè)樣品溶液代替PCT標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明的有益效果為：

(1)本發(fā)明以CdS/MoS₂二維半導(dǎo)體納米材料做基底，比表面積大、成膜能力強(qiáng)，可固定大量抗體；

(2)本發(fā)明把CdS/MoS₂發(fā)光材料滴涂到電極表面，通過(guò)蛋白質(zhì)阻礙電子傳遞從而改變發(fā)光強(qiáng)度的機(jī)理檢測(cè)PCT，無(wú)酶、無(wú)標(biāo)記，極大的簡(jiǎn)化了電極制備過(guò)程；

(3)本發(fā)明用CdS和MoS₂兩種帶隙相近的半導(dǎo)體材料復(fù)合，提高了光電轉(zhuǎn)換效率和穩(wěn)定性，有效的增強(qiáng)了電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度；

(4)本發(fā)明以過(guò)硫酸鉀和過(guò)氧化氫做雙共反應(yīng)劑，可發(fā)揮協(xié)同作用，有效的增強(qiáng)了電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度；

(5)本發(fā)明制備的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于PCT的檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，線性范圍寬，檢出限低，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)PCT的簡(jiǎn)單、快速、高靈敏檢測(cè)。線性范圍為0.0001~10 ng/mL，檢出限為0.05 pg/mL。

附圖說(shuō)明：

圖1為不同濃度PCT的電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度圖；

圖2為不同濃度PCT的相對(duì)電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與lgc的線性擬合圖。

其中，圖1中由1到10的電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度圖分別代表PCT的濃度為0，0.0001，0.001，0.005，0.01，0.05，0.1， 0.5，1，10 ng/mL。

具體實(shí)施方式：

為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實(shí)例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但是本發(fā)明并不局限于此。

實(shí)施例1 一種基于雙共反應(yīng)劑放大信號(hào)的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法：

(1)用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm的Al₂O₃拋光粉依次打磨直徑為4 mm的玻碳電極(GCE)，分別在乙醇和超純水中超聲清洗5 min，氮?dú)獯蹈?，? μL CdS/MoS₂納米復(fù)合材料分散液滴涂到電極表面，室溫下晾干成膜，用PBS (pH 7.4) 緩沖溶液沖洗以除去未鍵合的CdS/MoS₂得到CdS/MoS₂/GCE；

(2)取10 μL 10μg/mL的原降鈣素抗體(anti-PCT)標(biāo)準(zhǔn)溶液滴涂到電極表面，4 ℃下孵化過(guò)夜，用PBS (pH 7.4)緩沖溶液沖洗得anti-PCT/CdS/MoS₂/GCE；

(3)取10 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到電極表面，在37℃下孵化1 h，封閉非特異性結(jié)合的位點(diǎn)，用PBS (pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面得到BSA/anti-PCT/CdS/MoS₂/GCE；

(4)滴加10 μL濃度為0.0001~10 ng/mL的一系列不同濃度的原降鈣素標(biāo)準(zhǔn)溶液用于與抗體特異性識(shí)別，在37 ℃下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面，制得一種基于CdS/MoS₂的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器(PCT/BSA/anti-PCT/CdS/MoS₂/GCE)。

實(shí)施例2 一種基于雙共反應(yīng)劑增強(qiáng)半導(dǎo)體納米復(fù)合材料光強(qiáng)的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法：

(1)用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm的Al₂O₃拋光粉依次打磨直徑為4 mm的玻碳電極(GCE)，分別在乙醇和超純水中超聲清洗5 min，氮?dú)獯蹈?，? μL CdS/MoS₂納米復(fù)合材料分散液滴涂到電極表面，室溫下晾干成膜，用PBS (pH 7.4) 緩沖溶液沖洗以除去未鍵合的CdS/MoS₂得到CdS/MoS₂/GCE；

(2)取10 μL 10μg/mL的原降鈣素抗體(anti-PCT)標(biāo)準(zhǔn)溶液滴涂到電極表面，4 ℃下孵化過(guò)夜，用PBS (pH 7.4)緩沖溶液沖洗得anti-PCT/CdS/MoS₂/GCE；

(3)取10 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到電極表面，在37℃下孵化1 h，封閉非特異性結(jié)合的位點(diǎn)，用PBS (pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面得到BSA/anti-PCT/CdS/MoS₂/GCE；

(4)滴加10 μL濃度為0.0001~10 ng/mL的一系列不同濃度的原降鈣素標(biāo)準(zhǔn)溶液用于與抗體特異性識(shí)別，在37 ℃下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面，制得一種基于CdS/MoS₂的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器(PCT/BSA/anti-PCT/CdS/MoS₂/GCE)。

實(shí)施例3 一種基于雙共反應(yīng)劑增強(qiáng)半導(dǎo)體納米復(fù)合材料光強(qiáng)的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法：

(1)用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm的Al₂O₃拋光粉依次打磨直徑為4 mm的玻碳電極(GCE)，分別在乙醇和超純水中超聲清洗5 min，氮?dú)獯蹈?，?0 μL CdS/MoS₂納米復(fù)合材料分散液滴涂到電極表面，室溫下晾干成膜，用PBS (pH 7.4) 緩沖溶液沖洗以除去未鍵合的CdS/MoS₂得到CdS/MoS₂/GCE；

(2)取10 μL 10μg/mL的原降鈣素抗體(anti-PCT)標(biāo)準(zhǔn)溶液滴涂到電極表面，4 ℃下孵化過(guò)夜，用PBS (pH 7.4)緩沖溶液沖洗得anti-PCT/CdS/MoS₂/GCE；

(3)取10 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到電極表面，在37℃下孵化1 h，封閉非特異性結(jié)合的位點(diǎn)，用PBS (pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面得到BSA/anti-PCT/CdS/MoS₂/GCE；

(4)滴加10 μL濃度為0.0001~10 ng/mL的一系列不同濃度的原降鈣素標(biāo)準(zhǔn)溶液用于與抗體特異性識(shí)別，在37 ℃下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)緩沖溶液沖洗電極表面，制得一種基于CdS/MoS₂的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器(PCT/BSA/anti-PCT/CdS/MoS₂/GCE)。

實(shí)施例4 上述的CdS/MoS₂分散液的制備

稱取一定量摩爾比例為1:1的CdCl₂和NaMoO₄加入到100 mL 水中，超聲至完全溶解，加入2.66 g硫脲和1.0 g PVP，攪拌得乳白色分散液，將分散液轉(zhuǎn)移到100 mL高壓釜中，180℃反應(yīng)48h，自然冷卻。用水和乙醇（1:1）洗滌三次，干燥過(guò)夜，得CdS/MoS₂粉末。稱取10 mg CdS/MoS₂粉末超聲分散到10 mL超純水中，即得CdS/MoS₂粉末分散液。

實(shí)施例5 PCT的檢測(cè)

(1) PCT/BSA/anti-AFP/CdS/MoS₂/GCE為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對(duì)電極；使用MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光分析測(cè)試系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試，將光電倍增管的高壓設(shè)置為800 V，掃描區(qū)間為-1.8~0 V，掃描速度為100 mV/s；

(2)在10 mL含有0.1 mol/L過(guò)硫酸鉀和8 mmol/L過(guò)氧化氫的PBS(pH 7.4)緩沖溶液的電解池中，通過(guò)MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光分析測(cè)試系統(tǒng)檢測(cè)0.0001~10 ng/mL一系列不同濃度PCT標(biāo)準(zhǔn)溶液及未特異性結(jié)合PCT的電極的電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，所得結(jié)果見(jiàn)圖1，根據(jù)所得的峰值(不同濃度PCT標(biāo)準(zhǔn)溶液的電極的峰值為I，未特異性結(jié)合PCT的電極的峰值為I₀)和PCT濃度的關(guān)系，繪制工作曲線；

(3)ΔI/I₀與PCT濃度的對(duì)數(shù)(lgc)的線性關(guān)系見(jiàn)圖2（ΔI=I-I₀），由圖2可知，PCT在0.1 pg/mL~10 ng/mL濃度范圍內(nèi)，ΔI/I₀與PCT濃度的對(duì)數(shù)呈良好的線性相關(guān)，線性方程為ΔI/I₀= 0.107lgc + 0.461，c是濃度，單位是g/mL，線性相關(guān)系數(shù)為0.981，檢出限為0.05 pg/mL；

(4)將待測(cè)樣品溶液代替PCT標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)施例6 PCT的檢測(cè)

(1) PCT/BSA/anti-AFP/CdS/MoS₂/GCE為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對(duì)電極；使用MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光分析測(cè)試系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試，將光電倍增管的高壓設(shè)置為800 V，掃描區(qū)間為-1.8~0 V，掃描速度為100 mV/s；

(2)在10 mL含有0.1 mol/L過(guò)硫酸鉀和10 mmol/L過(guò)氧化氫的PBS(pH 7.4)緩沖溶液的電解池中，通過(guò)MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光分析測(cè)試系統(tǒng)檢測(cè)0.0001~10 ng/mL一系列不同濃度PCT標(biāo)準(zhǔn)溶液及未特異性結(jié)合PCT的電極的電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，所得結(jié)果見(jiàn)圖1，根據(jù)所得的峰值(不同濃度PCT標(biāo)準(zhǔn)溶液的電極的峰值記為I，未特異性結(jié)合PCT的電極的峰值為I₀)和PCT濃度的關(guān)系，繪制工作曲線；

(3) ΔI/I₀與PCT濃度的對(duì)數(shù)(lgc)的線性關(guān)系見(jiàn)圖2（ΔI=I-I₀），由圖2可知，PCT在0.1 pg/mL~10 ng/mL濃度范圍內(nèi)，ΔI/I₀與PCT濃度的對(duì)數(shù)呈良好的線性相關(guān)，線性方程為ΔI/I₀= 0.107lgc + 0.461，c是濃度，單位是g/mL，線性相關(guān)系數(shù)為0.981，檢出限為0.05 pg/mL；

(4)將待測(cè)樣品溶液代替PCT標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)施例7 PCT的檢測(cè)

(1) PCT/BSA/anti-AFP/CdS/MoS₂/GCE為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對(duì)電極；使用MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光分析測(cè)試系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試，將光電倍增管的高壓設(shè)置為800 V，掃描區(qū)間為-1.8~0 V，掃描速度為100 mV/s；

(2)在10 mL含有0.1 mol/L過(guò)硫酸鉀和12 mmol/L過(guò)氧化氫的PBS(pH 7.4)緩沖溶液的電解池中，通過(guò)MPI-B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光分析測(cè)試系統(tǒng)檢測(cè)0.0001~10 ng/mL一系列不同濃度PCT標(biāo)準(zhǔn)溶液及未特異性結(jié)合PCT的電極的電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，所得結(jié)果見(jiàn)圖1，根據(jù)所得的峰值(不同濃度PCT標(biāo)準(zhǔn)溶液的電極的峰值記為I，未特異性結(jié)合PCT的電極的峰值記為I₀)和PCT濃度的關(guān)系，繪制工作曲線；

(3) ΔI/I₀與PCT濃度的對(duì)數(shù)(lgc)的線性關(guān)系見(jiàn)圖2（ΔI=I-I₀），由圖2可知，PCT在0.1 pg/mL~10 ng/mL濃度范圍內(nèi)，ΔI/I₀與PCT濃度的對(duì)數(shù)呈良好的線性相關(guān)，線性方程為ΔI/I₀= 0.107lgc + 0.461，c是濃度，單位是g/mL，線性相關(guān)系數(shù)為0.981，檢出限為0.05 pg/mL；

(4)將待測(cè)樣品溶液代替PCT標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)。