本發(fā)明涉及一種檢測、篩選及鑒定腎陽虛證代謝生物標(biāo)記物的方法。

背景技術(shù)：

中醫(yī)的藏象是“藏居于內(nèi)，形見于外”，臨床上則以“證”為表現(xiàn)?！白C”本質(zhì)是機體失衡而致的代謝或其網(wǎng)路的改變，該特征性表型是通過臟器分泌到血液或尿液中的內(nèi)源性代謝成分(小分子代謝物)表達譜的改變而被客觀地反映出來。而代謝組學(xué)正是研究機體受外界因素干擾后，其代謝產(chǎn)物(內(nèi)源代謝物質(zhì))的種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的科學(xué)。因此，代謝組學(xué)的興起提供了一條從系統(tǒng)層面將多層次多維度數(shù)據(jù)進行整合分析的方法，用現(xiàn)代科學(xué)語言表述了中醫(yī)藥的特性。代謝組學(xué)以其整體、動態(tài)、重視整體功能變化等特點，與中醫(yī)證候?qū)Σ±頎顟B(tài)的表達理念不謀而合。

腎陽虛證是中醫(yī)臨床常見病證，也是影響現(xiàn)代人類健康的多種常見病的共性基礎(chǔ)性病理，臨床主要表現(xiàn)為畏冷肢寒、精神不振、頭暈?zāi)垦！㈥栶絷幙s、夜尿頻多、宮寒不孕等癥狀。因此補腎陽作用研究在防病治病方面具有重要意義。大量研究表明腎陽虛證可在下丘腦-垂體-靶腺軸、能量代謝、免疫系統(tǒng)、細(xì)胞信號系統(tǒng)、心臟和腎臟有不同程度的紊亂現(xiàn)象，是多種系統(tǒng)和器官功能的綜合表現(xiàn)。其中，下丘腦-垂體-靶器官(腎上腺、性腺和甲狀腺)軸的功能紊亂是腎陽虛證的共同特征。

“證”本質(zhì)上是指機體失衡而致的代謝或其網(wǎng)路的改變，該特征性表型是通過血液或尿液等生物樣本的內(nèi)源性小分子代謝物及大分子蛋白表達譜的改變而被客觀地反映出來的。而代謝組學(xué)正是研究機體受外界因素干擾后內(nèi)源代謝物質(zhì)的種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的科學(xué)。因此，代謝組學(xué)的興起提供了一個從系統(tǒng)層面將多層次多維度數(shù)據(jù)進行整合分析的方法和用現(xiàn)代生物學(xué)語言表述中醫(yī)證候特性的手段。但是現(xiàn)有技術(shù)不能確定腎陽虛證的生物標(biāo)記物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)不能確定腎陽虛證的生物標(biāo)記物的問題，而提出的一種檢測、篩選及鑒定腎陽虛證代謝生物標(biāo)記物的方法。

上述的發(fā)明目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

步驟一、復(fù)制腎陽虛證大鼠模型；將正常組的每只清潔級大鼠皮下注射橄欖油溶液，將模型組的每只清潔級大鼠按0.1mL/Kg體重皮下注射10mg/mL皮質(zhì)酮橄欖油溶液；采集正常組和模型組清潔級大鼠的尿樣樣本、血液樣本和臟器樣本；

步驟二、評價腎陽虛證大鼠模型；計算血清和尿液樣本的各生化指標(biāo)的相應(yīng)濃度、大鼠體重數(shù)據(jù)、臟器指數(shù)以及免疫組織化學(xué)指標(biāo)；根據(jù)各指標(biāo)具有極顯著性差異，確定復(fù)制的腎陽虛證大鼠模型以及皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛大鼠模型；

步驟三、將大鼠原始濃度尿液制備得到大鼠尿液QC樣本；將步驟一得到的采集正常組及模型組清潔級大鼠的尿樣樣本制備得到大鼠的尿液樣本；

步驟四、將大鼠原始濃度血液制備得到大鼠血液QC樣本；將步驟一得到的采集正常組及模型組清潔級大鼠的血液樣本制備得到大鼠血液樣本；

步驟五、分別將步驟三得到的大鼠尿液QC樣本和大鼠的尿液樣本以及步驟四得到的大鼠血液QC樣本和大鼠血液樣本進行高效液相色譜柱梯度洗脫得到大鼠樣本的尿液內(nèi)源性代謝物和血液內(nèi)源性代謝物；

步驟六、將步驟五中計算得到的尿液內(nèi)源性代謝物和血液內(nèi)源性代謝物分別進行正離子掃描模式和正離子掃描模式下的質(zhì)譜分析，得到大鼠尿液樣本的代謝輪廓信息和大鼠血液樣本的代謝輪廓信息；

步驟七、利用模式識別分析-主成分分析方法將步驟六得到大鼠尿液樣本的代謝輪廓信息和大鼠血液樣本的代謝輪廓信息進行分析得到正常組大鼠尿液、模型組大鼠尿液、正常組大鼠血液以及模型組大鼠血液的代謝輪廓軌跡的變化趨勢PCA得分圖；

步驟八、根據(jù)步驟七得到的正常組大鼠尿液與模型組大鼠尿液代謝輪廓軌跡的變化趨勢PCA得分圖確定腎陽虛證大鼠尿液的代謝輪廓信息；

步驟九、根據(jù)步驟七得到的正常組大鼠與模型組大鼠血液代謝輪廓軌跡的變化趨勢PCA得分圖獲得腎陽虛證大鼠血液的的代謝輪廓信息；

步驟十、鑒定腎陽虛證潛在生物標(biāo)記物，根據(jù)腎陽虛證大鼠尿液和腎陽虛證大鼠血液潛在生物標(biāo)記物保留時間和質(zhì)核比信息進行代謝物庫的匹配；通過高效液相色譜以及質(zhì)核比MS/MS數(shù)據(jù)來確定標(biāo)記物的化學(xué)結(jié)構(gòu)；共鑒定得到尿液生物標(biāo)記物33個，血液生物標(biāo)記物17個；

所述33個尿液代謝物鑒定結(jié)果分別為：12-羥基十二烷酸、乙?；?L-酪氨酸、N-乙酰血清素、黃尿酸、馬尿酸、二碘羥基喹啉、氫化肉桂酸、?；撬?、煙酰胺、11β，21-二羥基-5β-孕酮-3,20-二酮、肌酐、胸苷、胞嘧啶、3-甲醛吲哚、醛賴氨酸、犬尿酸、3-甲氧基腎上腺素、羥苯基乙酰甘氨酸、N-丁二酰-L-谷氨酸-半醛、L-纈氨酸、3-羥基十二碳二酸、泛酸、癸二酸、苯丙酮酸、尿酸、α-亞麻酸、苯乙酰甘氨酸、葡萄糖醛酸內(nèi)酯、N-乙酰-L-精氨酸、酮戊二酸、尿囊素、N-乙酰神經(jīng)氨酸、吡咯啉羧酸；

所述17個血液代謝物鑒定結(jié)果分別為：9,12,15-十八碳三烯酸甲酯、皮質(zhì)酮、亞麻酸、L-色氨酸、棕櫚酰胺、LysoPC(16:1(9Z))、LysoPC(15:0)、PC(17:1(9Z)/0:0)、表脫氧膽酸、硫酸吲哚酚、棕櫚酰肉堿、1-磷酸-鞘氨醇、尿苷、?；悄懰?、PE(19:0/0:0)、LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))、LysoPE(18:0/0:0)；

其中，匹配原則：一級質(zhì)量數(shù)結(jié)合質(zhì)譜IDA采集得到的二級數(shù)據(jù)與代謝物庫進行匹配。

發(fā)明效果

本發(fā)明基于UPLC-MS技術(shù)快速鑒定皮質(zhì)酮誘導(dǎo)腎陽虛大鼠模型的生物標(biāo)記物。

(1)采用糖皮質(zhì)激素建模法建立皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證大鼠模型，運用經(jīng)典臨床化學(xué)、組織形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)等方法對模型進行綜合評價；(2)應(yīng)用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿/飛行時間質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)技術(shù)獲取模型大鼠尿液中的內(nèi)源性小分子成分；應(yīng)用多變量模式識別技術(shù)篩選并鑒定腎陽虛證代謝生物標(biāo)記。

1.腎陽虛證大鼠模型的復(fù)制與評價

模型組大鼠血清中CRH、T3、T4、T、ACTH、cGMP、cAMP、cAMP/cGMP和尿17-OHCS呈顯著下降趨勢；模型組大鼠的下丘腦神經(jīng)細(xì)胞和腎上腺束狀帶均出現(xiàn)了明顯的萎縮，甲狀腺腺泡萎縮及間質(zhì)增生。

2.腎陽虛證模型大鼠的生物標(biāo)記物鑒定

共鑒定出對腎陽虛證模型具有顯著貢獻率的33個尿液潛在標(biāo)記物和17個血液潛在標(biāo)記物。通過逐步聚焦并明確了腎陽虛證的核心代謝標(biāo)記物為11β,21-二羥基-5β孕烷-3,20-二酮、皮質(zhì)酮、表脫氧膽酸、?；撬?、N-乙酰血清素、黃尿酸、犬尿酸、苯丙酮酸、苯乙酰甘氨酸、N-乙酰神經(jīng)氨酸、尿酸、胞嘧啶、α-亞麻酸、1-磷酸鞘氨醇、肌酐等，涉及了亞麻酸代謝，?；撬岷蛠喤；撬岽x，苯丙氨酸代謝，色氨酸代謝，嘧啶代謝，甘油磷脂代謝，甾體激素合成，精氨酸和脯氨酸代謝，鞘脂類代謝，初級膽汁酸生成等。這些標(biāo)記物的生物學(xué)意義與文獻報導(dǎo)的腎陽虛證患者臨床表現(xiàn)出神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)紊亂及腎臟損傷等密切相關(guān)。

本發(fā)明采取長期皮下注射大劑量皮質(zhì)酮的方法建立腎陽虛證相關(guān)的大鼠模型，結(jié)合檢測臨床化學(xué)指標(biāo)及觀察組織病理學(xué)的改變，與臨床腎陽虛證的評價標(biāo)準(zhǔn)進行比較，建立腎陽虛證大鼠模型的評價體系，同時采用UPLC-MS手段檢測實驗大鼠的尿液和血液樣本，利用代謝組學(xué)技術(shù)分析腎陽虛證大鼠模型發(fā)生、發(fā)展中整體代謝輪廓的動態(tài)變化，并闡明這些標(biāo)記物的生物學(xué)意義，為開展相關(guān)藥物評價和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為實施例提出的正常大鼠和皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證模型大鼠臨床生化指標(biāo)結(jié)果示意圖；其中，CRH為促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素；ACTH為促腎上腺皮質(zhì)激素；CORT為皮質(zhì)酮；17-OHCS為17-羥基類固醇；T3為三氟甲狀原氨酸；T4為甲狀腺素；T為睪酮；cAMP為環(huán)磷酸腺苷；cGMP為環(huán)磷酸鳥苷；1正常組；2模型組*P<0.05，**P<0.01vs正常組；#P<0.05，##P<0.01vs模型組由圖1可知，與正常組比較，模型組大鼠尿中17-OHCS和血清中T含量有明顯降低趨勢，具有極顯著性差異(P<0.01)；血清中CRH、T3、T4、ACTH、血漿cGMP和cAMP含量亦有降低趨勢，具有顯著性差異(P<0.05)；cAMP/cGMP的比值降低，具有顯著性差異(P<0.05)。血清中CORT含量有明顯升高趨勢，具有顯著性差異(P<0.05)。

圖2為實施例提出的基于METPA的腎陽虛證標(biāo)記物代謝通路分析圖；其中，1亞麻酸代謝；2?；撬岷蛠喤；撬岽x；3纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸代謝；4苯丙氨酸代謝；5煙酸煙酰胺代謝；6色氨酸代謝；7檸檬酸代謝；8嘧啶代謝；9丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝；10甘油磷脂代謝；11甾體激素合成；12精氨酸和脯氨酸代謝；13鞘脂類代謝；14初級膽汁酸生成；15嘌呤代謝；16泛酸鹽和輔酶A生成；

注釋：將已鑒定的腎陽虛證生物標(biāo)記物的英文名稱或KEGG或HMDB號導(dǎo)入代謝通路分析網(wǎng)站(http://www.metaboanalyst.ca)進行分析后，有29個代謝通路發(fā)生擾動，以impact大于0的通路為標(biāo)準(zhǔn)，得到與腎陽虛證密切相關(guān)的16個代謝通路；

圖3為實施例提出的皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證模型大鼠血液和尿液核心標(biāo)記物含量水平示意圖；注釋：通過對皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證具有顯著貢獻的潛在生物標(biāo)記物闡述后，發(fā)現(xiàn)17個標(biāo)記物與腎陽虛證的臨床表現(xiàn)密切相關(guān)，參與了腎陽虛證的發(fā)生與發(fā)展過程，可以作為評價腎陽虛證的核心生物標(biāo)記物；*P<0.05，**P<0.01vs正常組。

圖4(a)為實施例提出的正常組顯微鏡下(×200)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證模型大鼠和正常大鼠下丘腦HE染色形態(tài)觀察示意圖；由圖4(a)結(jié)果可見，實驗第22天，正常組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞胞漿飽滿；

圖4(b)為實施例提出的模型組顯微鏡下(×200)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證模型大鼠和正常大鼠下丘腦HE染色形態(tài)觀察示意圖；由圖4(b)結(jié)果可見，實驗第22天，模型組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的萎縮，部分神經(jīng)元細(xì)胞核固縮。

圖5(a)為實施例提出的正常組顯微鏡下(×200)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證模型大鼠和正常大鼠垂體HE染色形態(tài)觀察示意圖；由圖5(a)實驗第22天，正常組垂體細(xì)胞形態(tài)正常，嗜酸細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞和中性細(xì)胞排列均勻，分界清晰；

圖5(b)為實施例提出的模型組顯微鏡下(×200)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證模型大鼠和正常大鼠垂體HE染色形態(tài)觀察示意圖；圖5(b)實驗第22天，)模型組垂體嗜堿細(xì)胞明顯減少，部分細(xì)胞核固縮，間隙較大并存有大量紅細(xì)胞，伴有充血現(xiàn)象。

圖6(a)為實施例提出的正常組顯微鏡下(×200)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證模型大鼠和正常大鼠甲狀腺HE染色形態(tài)觀察示意圖；實驗第22天，正常組皮質(zhì)、髓質(zhì)界限清楚，球狀帶、束狀帶、網(wǎng)狀帶細(xì)胞排列均勻，髓質(zhì)細(xì)胞排列成團、成索；

圖6(b)為實施例提出的模型組顯微鏡下(×200)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證模型大鼠和正常大鼠甲狀腺HE染色形態(tài)觀察示意圖；實驗第22天，模型組皮質(zhì)增生明顯，細(xì)胞密度增高，球狀條增厚，束狀條透明變，網(wǎng)狀帶變窄，細(xì)胞變小，顏色變深，且毛細(xì)管充血。

圖7(a)為實施例提出的正常組顯微鏡下(×200)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證模型大鼠和正常大鼠腎上腺HE染色形態(tài)觀察示意圖；實驗第22天，正常組甲狀腺腺泡飽滿多呈立方形，間質(zhì)清晰，上皮細(xì)胞呈柱形；

圖7(b)為實施例提出的模型組顯微鏡下(×200)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證模型大鼠和正常大鼠腎上腺HE染色形態(tài)觀察示意圖；實驗第22天，模型組腺泡萎縮，上皮扁平，間質(zhì)細(xì)胞纖維增生。

圖8(a)為實施例提出的正常組顯微鏡下(×200)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證模型大鼠和正常大鼠睪丸HE染色形態(tài)觀察示意圖；

圖8(b)為實施例提出的模型組顯微鏡下(×200)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證模型大鼠和正常大鼠睪丸HE染色形態(tài)觀察；實驗第22天，模型組睪丸組織與正常組比較無明顯區(qū)別，生精小管橫切面可見精原細(xì)胞及不同發(fā)育階段的精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子；

圖9(a)為實施例提出的正常組顯微鏡下(×200)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證模型大鼠和正常大鼠下丘腦CRH免疫組織化學(xué)染色分析示意圖；

圖9(b)為實施例提出的模型組顯微鏡下(×200)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證模型大鼠和正常大鼠下丘腦CRH免疫組織化學(xué)染色分析示意圖；圖9(a)和圖9(b)所述下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞胞漿、胞體及突起部位的CRH免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈棕黃色斑塊狀。與正常組比較，模型組大鼠下丘腦神經(jīng)元染色淺且陽性染色細(xì)胞少，部分神經(jīng)元鏡下呈正常形態(tài)但是無陽性表達，經(jīng)顯微定量分析發(fā)現(xiàn)，下丘腦的CRH陽性表達面密度明顯降低，具有極顯著性差異(P<0.01)；

圖10(a)為實施例提出的正離子模式2D圖；正常組大鼠與腎陽虛證模型組大鼠不同時間第0天尿液樣本正、負(fù)離子模式PCA Scores plot軌跡圖；

圖10(b)為實施例提出的負(fù)離子模式2D圖；正常組大鼠與腎陽虛證模型組大鼠不同時間第7天尿液樣本正、負(fù)離子模式PCA Scores plot軌跡圖；

圖10(c)為實施例提出的正離子模式3D圖正常組大鼠與腎陽虛證模型組大鼠不同時間第14天尿液樣本正、負(fù)離子模式PCA Scores plot軌跡圖；

圖10(d)為實施例提出的負(fù)離子模式3D圖正常組大鼠與腎陽虛證模型組大鼠不同時間第22天尿液樣本正、負(fù)離子模式PCA Scores plot軌跡圖；

圖10(a)～圖10(d)模型組大鼠尿液不同時間點尿液樣本明顯分開，并且隨著時間的推移，向著遠(yuǎn)離第0天尿液樣本的方向變化，以第22天偏離程度最大；說明模型大鼠正常的代謝網(wǎng)絡(luò)逐步受到干擾，從而造成了其代謝軌跡的變化；經(jīng)注射皮質(zhì)酮造模21天，大鼠的代謝輪廓產(chǎn)生影響，且正常組大鼠與模型組大鼠開始有明顯的遠(yuǎn)離趨勢。

圖11(a)為實施例提出的正離子模式下正常組和模型組大鼠第22天尿液PCA模式識別分析Scores plot圖；

圖11(b)為實施例提出的負(fù)離子模式下正常組和模型組大鼠第22天尿液PCA模式識別分析Scores plot圖；

圖12(a)為實施例提出的正離子模式正常組和模型組大鼠第22天血液PCA模式識別分析Scores plot圖；

圖12(b)為實施例提出的負(fù)離子模式正常組和模型組大鼠第22天血液PCA模式識別分析Scores plot圖；

圖13(a)為實施例提出的正離子模式下正常組和模型組大鼠第22天尿液OPLS-DA分析Scores plot圖；

圖13(b)為實施例提出的負(fù)離子模式下正常組和模型組大鼠第22天尿液OPLS-DA分析Scores plot圖；

圖14(a)為實施例提出的POS(正離子模式)正常組和模型組第22天尿液樣本VIP圖；

圖14(b)為實施例提出的NEG正常組和模型組第22天尿液樣本VIP圖；NEG(負(fù)離子模式)

圖15(a)為實施例提出的正離子模式下正常組和模型組大鼠血液OPLS-DA分析后的Scores plot圖；

圖15(b)為實施例提出的負(fù)離子模式下正常組和模型組大鼠血液OPLS-DA分析后的Scores plot圖；

圖16(a)為實施例提出的POS正常組和模型組血液樣品VIP散點圖；

圖16(b)為實施例提出的NEG正常組和模型組血液樣品VIP散點圖；

圖17(a)為實施例提出的尿液生物標(biāo)記物皮質(zhì)酮誘導(dǎo)腎陽虛證模型大鼠及正常大鼠的尿液和血液生物標(biāo)記物含量水平示意圖；

圖17(b)為實施例提出的血液生物標(biāo)記皮質(zhì)酮誘導(dǎo)腎陽虛證模型大鼠及正常大鼠的尿液和血液生物標(biāo)記物含量水平示意圖；

具體實施方式

具體實施方式一：本實施方式的一種檢測、篩選及鑒定腎陽虛證代謝生物標(biāo)記物的方法，具體是按照以下步驟制備的：

步驟一、復(fù)制腎陽虛證大鼠模型；將正常組的每只清潔級大鼠皮下注射橄欖油溶液，將模型組的每只清潔級大鼠按0.1mL/Kg體重皮下注射10mg/mL皮質(zhì)酮橄欖油溶液；采集正常組和模型組清潔級大鼠的尿樣樣本、血液樣本和臟器樣本；

步驟二、評價腎陽虛證大鼠模型；腎陽虛證的臨床定位為神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)的抑制，而神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)中所涉及到的相應(yīng)激素水平和靶器官的功能狀態(tài)可以反映其是否處于抑制狀態(tài)；因此，采用檢測血清CRH、CORT、ACTH、T3、T4、T、cAMP、cGMP和尿17-OHCS臨床化學(xué)指標(biāo)并觀察下丘腦、垂體、腎上腺、甲狀腺和睪丸的組織病理學(xué)形態(tài)改變，對腎陽虛證大鼠模型進行綜合評價；

計算血清和尿液樣本的各生化指標(biāo)的相應(yīng)濃度、大鼠體重數(shù)據(jù)、臟器指數(shù)以及免疫組織化學(xué)指標(biāo)；根據(jù)各指標(biāo)具有極顯著性差異，確定復(fù)制的腎陽虛證大鼠模型以及皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛大鼠模型；

所述確定免疫組織化學(xué)指標(biāo)具有極顯著性差異具體過程為：詳見實施例步驟二中2.3.4；

臟器指數(shù)為臟器組織的改變，詳見實施例步驟二中2.2.3；

免疫組織化學(xué)指標(biāo)，詳見實施例步驟二中2.3.3；

血清各生化指標(biāo)包括內(nèi)容和尿液樣本的生化指標(biāo)詳見實施例中步驟二3.1中的臨床化學(xué)指標(biāo)結(jié)果；

步驟三、將大鼠原始濃度尿液(未經(jīng)注射藥物的大鼠采集的尿液)制備得到大鼠尿液QC(質(zhì)控)樣本；將步驟一得到的采集正常組及模型組清潔級大鼠的尿樣樣本制備得到大鼠的尿液樣本；

步驟四、將大鼠原始濃度血液(未經(jīng)注射藥物的大鼠采集的血液)制備得到大鼠血液QC樣本；將步驟一得到的采集正常組及模型組清潔級大鼠的血液樣本制備得到大鼠血液樣本；

步驟五、分別將步驟三得到的大鼠尿液QC樣本和大鼠的尿液樣本以及步驟四得到的大鼠血液QC樣本和大鼠血液樣本進行高效液相色譜柱梯度洗脫得到大鼠樣本的尿液內(nèi)源性代謝物和血液內(nèi)源性代謝物；

步驟六、將步驟五中計算得到的尿液內(nèi)源性代謝物和血液內(nèi)源性代謝物分別進行正離子掃描模式和正離子掃描模式下的質(zhì)譜分析，得到大鼠尿液樣本的代謝輪廓信息和大鼠血液樣本的代謝輪廓信息；

步驟七、利用模式識別分析-主成分分析方法將步驟六得到大鼠尿液樣本的代謝輪廓信息和大鼠血液樣本的代謝輪廓信息進行分析得到正常組大鼠尿液、模型組大鼠尿液、正常組大鼠血液以及模型組大鼠血液的代謝輪廓軌跡的變化趨勢PCA得分圖；

步驟八、根據(jù)步驟七得到的正常組大鼠尿液與模型組大鼠尿液代謝輪廓軌跡的變化趨勢PCA得分圖確定腎陽虛證大鼠尿液的代謝輪廓信息；

步驟九、根據(jù)步驟七得到的正常組大鼠與模型組大鼠血液代謝輪廓軌跡的變化趨勢PCA得分圖獲得腎陽虛證大鼠血液的的代謝輪廓信息；

步驟十、鑒定腎陽虛證潛在生物標(biāo)記物，根據(jù)腎陽虛證大鼠尿液和腎陽虛證大鼠血液潛在生物標(biāo)記物保留時間和質(zhì)核比信息進行代謝物庫的匹配；對軟件所給出的可能結(jié)構(gòu)進行標(biāo)記，同時導(dǎo)出含有相對峰強度的鑒定結(jié)果列表，進行二次鑒定。二次鑒定主要是通過HMDB(http://www.hmdb.ca/)、KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)和Massbank(http://www.massbank.jp/)等檢索數(shù)據(jù)庫，并結(jié)合MSMS數(shù)據(jù)進行驗證，通過高效液相色譜保留行為以及質(zhì)核比MS/MS數(shù)據(jù)來確定標(biāo)記物的化學(xué)結(jié)構(gòu)；共鑒定得到尿液生物標(biāo)記物33個，血液生物標(biāo)記物17個；

所述33個尿液代謝物鑒定結(jié)果分別為：12-羥基十二烷酸、乙酰基-L-酪氨酸、N-乙酰血清素、黃尿酸、馬尿酸、二碘羥基喹啉、氫化肉桂酸、牛磺酸、煙酰胺、11β，21-二羥基-5β-孕酮-3,20-二酮、肌酐、胸苷、胞嘧啶、3-甲醛吲哚、醛賴氨酸、犬尿酸、3-甲氧基腎上腺素、羥苯基乙酰甘氨酸、N-丁二酰-L-谷氨酸-半醛、L-纈氨酸、3-羥基十二碳二酸、泛酸、癸二酸、苯丙酮酸、尿酸、α-亞麻酸、苯乙酰甘氨酸、葡萄糖醛酸內(nèi)酯、N-乙酰-L-精氨酸、酮戊二酸、尿囊素、N-乙酰神經(jīng)氨酸、吡咯啉羧酸；

所述17個血液代謝物鑒定結(jié)果分別為：9,12,15-十八碳三烯酸甲酯、皮質(zhì)酮、亞麻酸、L-色氨酸、棕櫚酰胺、LysoPC(16:1(9Z))、LysoPC(15:0)、PC(17:1(9Z)/0:0)、表脫氧膽酸、硫酸吲哚酚、棕櫚酰肉堿、1-磷酸-鞘氨醇、尿苷、?；悄懰?、PE(19:0/0:0)、LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))、LysoPE(18:0/0:0)；

其中，匹配原則：一級質(zhì)量數(shù)結(jié)合質(zhì)譜IDA采集得到的二級數(shù)據(jù)與代謝物庫進行匹配，以得分高低排序，得分越高，結(jié)構(gòu)確定的準(zhǔn)確性越大。

具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是：所述采集正常組和模型組清潔級大鼠的尿樣樣本具體為：

(1)、將清潔級大鼠完全隨機分成2組，即正常組和模型組；

(2)、正常組每只大鼠按0.1mL/Kg體重皮下注射橄欖油溶液，模型組每只大鼠按0.1mL/Kg體重皮下注射10mg/mL皮質(zhì)酮橄欖油溶液，

(3)、采集每只大鼠12h的尿樣，將新鮮尿液樣于4℃、13000rpm離心10min條件下在-80℃貯存，進行分析之前室溫解凍。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。

具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一或二不同的是：所述采集正常組和模型組清潔級大鼠的血液樣本具體為：

1)每只大鼠均于腹主動脈采集血液，在離心4℃，4000r/min，10min條件下分離血清；

2)分裝后凍存于-80℃冰箱，進行分析之前室溫解凍。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一或二相同。

具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一至三之一不同的是：所述采集正常組和模型組清潔級大鼠的臟器樣本具體為：

①采集每只大鼠經(jīng)腹主動脈血樣后，迅速取出腎上腺、胸腺、睪丸并用分析天平稱重，計算各臟器的臟器指數(shù)；

②下丘腦與垂體在大鼠灌注4％多聚甲醛溶液后，將下丘腦、垂體、腎上腺、甲狀腺和睪丸(均取左側(cè))共同置于4％多聚甲醛溶液固定備用。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一至三之一相同。

具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一至四之一不同的是：步驟三中將大鼠原始濃度尿液制備得到大鼠尿液QC(質(zhì)控)樣本；將步驟一得到的采集正常組及模型組清潔級大鼠的尿樣樣本制備得到大鼠的尿液樣本具體為：

步驟三一、按照步驟一尿液樣本的采集方法采集大鼠尿液，從大鼠原始濃度尿液中各取200μL，混合后渦旋10s后分裝后得到大鼠尿液待處理樣本，-80℃保存；

步驟三二、在室溫下解凍步驟三一的大鼠尿液待處理樣本和步驟一得到的采集正常組及模型組清潔級大鼠的尿樣樣本，并利用4倍體積的蒸餾水進行稀釋，渦旋10s后，在4℃、13000rpm條件下離心10min，過0.22μm濾膜，得到大鼠尿液質(zhì)控QC樣本和大鼠的尿液樣本。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一至四之一相同。

具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式一至五之一不同的是：步驟四中將大鼠原始濃度血液制備得到大鼠血液QC樣本；將步驟一得到的采集正常組及模型組清潔級大鼠的血液樣本制備得到大鼠血液樣本具體過程為：

步驟四一、按照步驟一血液樣本采集方法從大鼠血液樣本中各取50μL，混合后渦旋10s后得到大鼠血液QC待處理樣本；

步驟四二、在室溫下解凍步驟四一血液QC待處理樣本和步驟一得到的采集正常組和模型組清潔級大鼠的血液樣本后，渦旋10s，取200μL上層血清置于1.5mL離心管中，加800μL甲醇，渦旋10s，超聲1min，13000rpm離心10min，取上清液850μL，于40℃水浴下氮氣吹干，殘渣用200μL 80％甲醇復(fù)溶，4℃、13000rpm離心10min，過0.22μm濾膜，取上清液即得大鼠血液QC樣本和處理后的血液樣本。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一至五之一相同。

具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式一至六之一不同的是：步驟五所述進行高效液相色譜柱梯度洗脫采用的色譜條件為：

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3(100mm×2.1mm i.d.，1.8μm)(Waters集團公司，美國)；流動相：流動相A的質(zhì)量百分比為0.1％甲酸-水，流動相B的質(zhì)量百分比為0.1％甲酸-乙腈；柱溫：40℃；流速：0.4ml/min；進樣量：3μL。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一至六之一相同。

具體實施方式八：本實施方式與具體實施方式一至七之一不同的是：步驟六中所述的正離子掃描模式條件為：離子噴霧電壓：5.5KV；離子源溫度：600℃；解簇電壓(DP)：100V；碰撞能量(CE)：35eV；氮氣為霧化氣和輔助氣：霧化氣55psi，輔助氣55psi，氣簾氣35psi；在質(zhì)核比m/z在100-1200amu質(zhì)量范圍ESI正離子模式下進行全掃描，積累時間250ms；

自動關(guān)聯(lián)掃描IDA采用標(biāo)準(zhǔn)：詳見實施例步驟三中2.1.3.2質(zhì)譜條件

負(fù)離子掃描模式：離子噴霧電壓：4.0KV；離子源溫度：600℃；解簇電壓(DP)：100V；碰撞能量(CE)：35eV；氮氣為霧化氣和輔助氣：霧化氣65psi，輔助氣65psi，氣簾氣35psi；在m/z為100-1200amu質(zhì)量范圍ESI正離子模式下進行全掃描，積累時間250ms；IDA采用標(biāo)準(zhǔn)：每個分析物，超過100cps的八個最強的碎片離子在100～1200amu質(zhì)量范圍內(nèi)進行子離子掃描，累積時間為100ms；碰撞電壓差為15eV，動態(tài)背景扣除DBS開啟；自動校準(zhǔn)系統(tǒng)(CDS)對MS和MS/MS自動進行調(diào)節(jié)和校正；數(shù)據(jù)獲取和處理分析采用2.1軟件、MasterView軟件和ProgenisisQI 1.0軟件；工作站為 TF1.6軟件。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一至七之一相同。

具體實施方式九：本實施方式與具體實施方式一至八之一不同的是：步驟八中根據(jù)步驟七得到的正常組大鼠尿液與模型組大鼠尿液代謝輪廓軌跡的變化趨勢PCA得分圖確定腎陽虛證大鼠模型尿液生物標(biāo)記物具體過程為：

步驟八一、在確認(rèn)實驗第22天PCA得分圖中顯示正常組大鼠與模型組大鼠尿液代謝數(shù)據(jù)完全分離后，對正常組與模型組的代謝數(shù)據(jù)矩陣進行模式識別分析-正交偏最小二乘法分析(Orthogonal Partial Least Squares Analysis，OPLS-DA)方法，選取一定VIP((vriable importance in the projection,變量投影重要性)值進行潛在生物標(biāo)記物的初步篩查；

步驟八二、將初步篩查的潛在標(biāo)記物在每天樣本的含量變化趨勢進行繪制，以代謝物微觀含量變化趨勢一致且滿足正常組與模型組組間大鼠尿液各代謝物具有顯著性差異P<0.05的原則，將潛在生物標(biāo)記物進行第二次篩選獲得第二次潛在標(biāo)記物，

步驟八三，獲得的初步篩查的潛在標(biāo)記物和第二次潛在標(biāo)記物為腎陽虛證大鼠模型尿液潛在生物標(biāo)記物。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一至八之一相同。

具體實施方式十：本實施方式與具體實施方式一至九之一不同的是：步驟九中根據(jù)步驟七得到的正常組大鼠與模型組大鼠血液代謝輪廓軌跡的變化趨勢PCA得分圖獲得腎陽虛證大鼠模型血液生物標(biāo)記物具體過程為：

步驟九一、在確認(rèn)實驗第22天PCA得分圖顯示兩組完全分離后，對正常組與模型組的代謝數(shù)據(jù)矩陣進行模式識別分析方-正交偏最小二乘法分析(Orthogonal Partial Least Squares Analysis，OPLS-DA)，通過VIP值進行潛在生物標(biāo)記物的初步篩查；

步驟九二、滿足正常組與模型組組間大鼠血液各代謝物具有顯著性差異(P<0.05)的原則進行第二次潛在標(biāo)記物篩選，

步驟九三、初步篩查的潛在標(biāo)記物和第二次潛在標(biāo)記物做為腎陽虛證大鼠模型血液潛在生物標(biāo)記物。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一至九之一相同。

采用以下實施例驗證本發(fā)明的有益效果：

實施例一：

本實施例一種檢測、篩選及鑒定腎陽虛證代謝生物標(biāo)記物的方法，具體是按照以下步驟制備的：

一腎陽虛證大鼠模型的復(fù)制；

1.Wistar大鼠(清潔級)，雄性，體重250g±10g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)溫度24±22℃，濕度65％-75％，12h避光，12h光照，自由攝食飲水。

2.2實驗分組及造模方法；將大鼠完全隨機分成2組，即正常組、模型組，每組8只，各組開始實驗前于代謝籠適應(yīng)環(huán)境一周。參照沈自尹等建立腎陽虛證大鼠模型方法：正常組每只大鼠按0.1mL/Kg體重皮下注射橄欖油溶液，模型組每只大鼠按0.1mL/Kg體重皮下注射10mg/mL皮質(zhì)酮橄欖油溶液，連續(xù)21天。

2.3樣本采集；2.3.1尿液樣本采集

從實驗第0天到實驗第22天，每間隔7天收集每只大鼠12h的尿樣，新鮮尿液樣4℃、13000rpm離心10min后于-80℃貯存，進行分析之前室溫解凍。

2.3.2血液樣本采集:實驗第22天，每只大鼠均于腹主動脈采集血液，離心(4℃，4000r/min，10min)分離血清，分裝后凍存于-80℃冰箱，進行分析之前室溫解凍。

2.3.3臟器樣本采集:實驗第22天，每只大鼠經(jīng)腹主動脈采集血樣后，迅速取出腎上腺、胸腺、睪丸并用分析天平稱重，計算各臟器的臟器指數(shù)；下丘腦、垂體在大鼠灌注4％多聚甲醛溶液后，與腎上腺、甲狀腺和睪丸(均取左側(cè))共同置于4％多聚甲醛溶液固定備用。

二、評價腎陽虛證大鼠模型；腎陽虛證的臨床定位為神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)的抑制，而神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)中所涉及到的相應(yīng)激素水平和靶器官的功能狀態(tài)可以反映其是否處于抑制狀態(tài)。因此，采用檢測血清CRH、CORT、ACTH、T3、T4、T、cAMP、cGMP和尿17-OHCS臨床化學(xué)指標(biāo)并觀察下丘腦、垂體、腎上腺、甲狀腺和睪丸的組織病理學(xué)形態(tài)改變，對腎陽虛證大鼠模型進行綜合評價。

1.2試劑：促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)放免試劑盒、皮質(zhì)酮(CORT)放免試劑盒、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)放免試劑盒(北京華英生物有限公司提供)；三氟甲狀原氨酸(T3)放免試劑盒、甲狀腺素(T4)放免試劑盒、睪酮(T)放免試劑盒放免試劑盒(濰坊三維生物工程有限公司提供)；環(huán)磷酸腺苷(cAMP)活性分析試劑盒、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)活性分析試劑盒、17-羥基類固醇(17-OHCS)活性分析試劑盒(南京建成有限公司提供)。

2.2組織病理學(xué)指標(biāo)評價；

2.2.2臟器組織HE染色：按照蘇木素-伊紅的染色方法說明書對相應(yīng)組織進行染色。

2.2.3組織染色切片的圖像采集：采用顯微鏡照相系統(tǒng)在200倍視野下進行鏡下觀察各組織染色切片，同時重點觀察文獻報導(dǎo)的腎陽虛證大鼠模型相關(guān)臟器組織的改變，包括下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞、垂體嗜酸性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞、甲狀腺腺泡和間質(zhì)、腎上腺皮質(zhì)以及睪丸生精細(xì)胞等，采集高清圖像信息。

2.2.4數(shù)據(jù)分析：實驗所得各組大鼠體重數(shù)據(jù)、臟器指數(shù)利用SPSS18.0軟件進行獨立樣本T檢驗，計算P值，P值小于0.05為顯著性差異，P值小于0.01為極顯著性差異。

2.3免疫組織化學(xué)指標(biāo)評價；2.3.1組織蠟塊的制備：與HE染色共用同一蠟塊。

2.3.2免疫組織化學(xué)染色方法：按照SABC免疫組化染色方法說明書對相應(yīng)組織進行染色。

2.3.3組織染色切片的圖像采集：采用顯微鏡照相系統(tǒng)在200倍視野下進行鏡下觀察各組織染色切片，陽性表達的細(xì)胞核、細(xì)胞漿或者間質(zhì)著色呈棕黃色，則隨機10個視野，顯微攝像系統(tǒng)拍攝高清圖像信息。

2.3.4數(shù)據(jù)分析：利用Motic Medical 6.0圖像分析軟件對每張免疫組織化學(xué)染色切片照片進行顯微定量分析，分析組織片上的陽性面密度值，計算各組大鼠下丘腦切片的CRH陽性目標(biāo)面密度，作為其陽性表達的定量分析結(jié)果。利用SPSS18.0軟件對實驗所得定量結(jié)果數(shù)據(jù)進行獨立樣本T檢驗，計算P值，P值小于0.05為顯著性差異，P值小于0.01為極顯著性差異。

3.結(jié)果與討論；3.1臨床化學(xué)指標(biāo)結(jié)果：

由臨床生化指標(biāo)測定結(jié)果(表1和圖1)可知，與正常組比較，模型組大鼠尿中17-OHCS和血清中T含量有明顯降低趨勢，具有極顯著性差異(P<0.01)；血清中CRH、T3、T4、ACTH、血漿cGMP和cAMP含量亦有降低趨勢，具有顯著性差異(P<0.05)；其中cAMP/cGMP的比值降低，具有顯著性差異(P<0.05)。血清中CORT含量有明顯升高趨勢，具有顯著性差異(P<0.05)如圖1。

表1正常大鼠和皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證模型大鼠臨床生化指標(biāo)分析結(jié)果(Mean±SD n＝8)

表1(續(xù))

*P<0.05，**P<0.01vs正常組

3.3.2臟器組織形態(tài)觀察結(jié)果

由圖4(a)和(b)結(jié)果可見，實驗第22天，正常組下丘腦神經(jīng)元數(shù)目多且細(xì)胞胞漿飽滿；模型組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)不同程度萎縮，部分神經(jīng)元細(xì)胞核固縮。

由圖5(a)和(b)結(jié)果可見，實驗第22天，正常組垂體細(xì)胞形態(tài)正常，嗜酸細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞和中性細(xì)胞排列均勻，分界清晰；模型組垂體嗜堿細(xì)胞明顯減少，部分細(xì)胞核固縮，間隙較大并存有大量紅細(xì)胞，伴有充血現(xiàn)象。

由圖6(a)和(b)結(jié)果可知，實驗第22天，正常組皮質(zhì)、髓質(zhì)界限清楚，球狀帶、束狀帶、網(wǎng)狀帶細(xì)胞排列均勻，髓質(zhì)細(xì)胞排列成團、成索；模型組皮質(zhì)增生明顯，細(xì)胞密度增高，球狀條增厚，束狀條透明變，網(wǎng)狀帶變窄，細(xì)胞變小，顏色變深，且毛細(xì)管充血。

由圖7(a)和(b)結(jié)果可見，實驗第22天，正常組甲狀腺腺泡飽滿多呈立方形，間質(zhì)清晰，上皮細(xì)胞呈柱形；模型組腺泡萎縮，上皮扁平，間質(zhì)細(xì)胞纖維增生。

由圖8(a)和(b)可以說明，實驗第22天，模型組睪丸組織與正常組比較無明顯區(qū)別，生精小管橫切面可見精原細(xì)胞及不同發(fā)育階段的精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、精子。

3.3免疫組織化學(xué)指標(biāo)結(jié)果

下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞胞漿、胞體及突起部位的CRH免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈棕黃色斑塊狀(見圖9(a)和(b))。與正常組比較，模型組大鼠下丘腦神經(jīng)元染色淺且陽性染色細(xì)胞少，部分神經(jīng)元鏡下呈正常形態(tài)但是無陽性表達，經(jīng)顯微定量分析發(fā)現(xiàn)，下丘腦的CRH陽性表達面密度明顯降低，具有極顯著性差異(P<0.01)(見表2)。

表2皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證模型大鼠及正常大鼠下丘腦CRH陽性表達分析結(jié)果

*P<0.05，**P<0.01vs正常組

4.實驗小結(jié)：通過長期皮下注射大劑量皮質(zhì)酮方法建立的大鼠腎陽虛證大鼠模型，經(jīng)過21天制備周期，模型組大鼠腎上腺和胸腺臟器指數(shù)降低；下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞和腎上腺皮質(zhì)束狀帶均出現(xiàn)了明顯萎縮，甲狀腺腺泡萎縮間質(zhì)增生，表明模型組大鼠下丘腦-垂體-靶器官的組織生理結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生變化；模型組大鼠血清CRH、T3、T4、T、ACTH、cGMP、cAMP、cAMP/cGMP和尿17-OHCS的變化趨勢較正常大鼠呈明顯降低，成功地復(fù)制了皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛大鼠模型。

三、腎陽虛證模型大鼠的代謝輪廓及生物標(biāo)記物分析

采集腎陽虛證大鼠模型復(fù)制過程中的尿液樣本和血液樣本進行代謝組學(xué)研究，利用模式識別結(jié)合網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫的方法鑒定腎陽虛證模型大鼠血液和尿液的代謝生物標(biāo)記物。

1.實驗材料；1.1儀器：ekspert ultra LC100液相色譜儀(AB Sciex集團公司，美國)；AB Sciex Triple TOF 5600⁺質(zhì)譜儀(AB Sciex集團公司，美國)；Progenesis QI(Waters集團公司，美國)；KDC-160HR型高速低溫離心機(科大創(chuàng)新股份公司，中國)；VX-Ⅱ多管渦旋振蕩器(北京踏錦科技有限公司，中國)；PB1501-N型電子分析天枰(梅特勒·托利多儀器(上海)有限公司，中國)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，中國)；SL-1000XLS型移液器(梅特勒·托利多儀器(上海)有限公司，中國)(規(guī)格：100-1000μL)。

1.2試劑：校正液(AB Sciex集團公司，美國)；乙腈，色譜級，(Merck技術(shù)有限公司，德國)；甲醇，色譜級，(Merck技術(shù)有限公司,德國)；甲酸，色譜級，(科密歐化學(xué)試劑有限公司，中國)；蒸餾水，(廣州屈臣氏食品飲料公司，中國)。

2.實驗方法2.1樣本制備與采集；2.1.1尿液分析樣本的制備：詳見上述步驟三二的記載；

2.1.2血液分析樣本的制備：詳見上述步驟四二；

2.1.3尿液分析樣本的采集方法；2.1.3.1色譜條件；詳見上述步驟五梯度洗脫方法見表3。

表3大鼠尿液樣品UPLC流動相梯度洗脫方法

A:0.1％甲酸水；B.0.1％乙腈水

2.1.3.2.質(zhì)譜條件：詳見上述步驟六

IDA(自動關(guān)聯(lián)掃描)采用標(biāo)準(zhǔn)：每個分析物，超過100cps的八個最強的碎片離子在100～1200amu質(zhì)量范圍內(nèi)進行子離子掃描，累積時間為100ms。碰撞電壓差為15eV，動態(tài)背景扣除DBS開啟。自動校準(zhǔn)系統(tǒng)(CDS)對MS和MS/MS自動進行調(diào)節(jié)和校正。數(shù)據(jù)獲取和處理分析采用2.1軟件、MasterView軟件和Progenisis QI 1.0軟件。工作站為 TF 1.6軟件。

負(fù)離子掃描模式：詳見上述步驟六

2.1.4血液分析樣本的采集方法；2.1.4.1色譜條件：詳見上述步驟五；

表4血液樣品的流動相梯度洗脫方法

A:0.1％甲酸水；B.0.1％乙腈水

2.1.4.2質(zhì)譜條件；2.2.尿液和血液的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析；2.2.1尿液的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析；

2.2.1.1尿液代謝輪廓分析

取實驗第0天、7天、14天和22天各組大鼠尿液樣本，按照尿液樣品制備方法處理，利用已建立的分析方法進行對上述尿液樣品正負(fù)離子模式全掃描，得到每組每只大鼠尿液樣本的代謝輪廓信息。

2.2.1.2大鼠尿液代謝輪廓軌跡分析

將實驗第0天、7天、14天和22天各組大鼠尿液樣本代謝輪廓數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenisis QI軟件進行峰匹配、峰提取、標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)據(jù)降維和質(zhì)譜矩陣信息獲取。進一步利用EZinfo軟件模塊對各給藥組不同時間點數(shù)據(jù)進行模式識別分析-主成分分析(Principal Components Analysis，PCA)，繪制正常組大鼠與模型組大鼠尿液代謝輪廓軌跡的變化趨勢PCA得分圖，明晰造模因素誘導(dǎo)正常大鼠向模型大鼠的轉(zhuǎn)變過程。

2.2.2血液的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析；2.2.2.1血液代謝輪廓分析：

取實驗第22天各組大鼠血液樣本，按照血液樣品制備方法處理，利用已建立的分析方法進行對上述血液樣品正負(fù)離子模式全掃描，得到每組每只大鼠尿液樣本的代謝輪廓信息。

2.2.1.2大鼠血液代謝輪廓分析：將實驗第22天大鼠血液樣本代謝輪廓數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenisis QI軟件進行峰匹配、峰提取、標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)據(jù)降維和質(zhì)譜矩陣信息獲取。進一步利用EZinfo軟件模塊對各給藥組不同時間點數(shù)據(jù)進行模式識別分析-主成分(Principal Components Analysis，PCA)分析，繪制正常組大鼠與模型組大鼠代謝輪廓PCA得分圖。

2.3腎陽虛證潛在生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)與鑒定；2.3.1腎陽虛證大鼠模型尿液生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)：

在確認(rèn)實驗第22天PCA得分圖顯示兩組完全分離后，對正常組與模型組的代謝數(shù)據(jù)矩陣進行模式識別分析-正交偏最小二乘法分析(Orthogonal Partial Least Squares Analysis，OPLS-DA)分析，通過VIP值進行潛在生物標(biāo)記物的初步篩查，進一步對這些潛在標(biāo)記物在每天樣本的含量變化趨勢進行繪制，以代謝物微觀含量變化趨勢一致且滿足正常組與模型組組間各代謝物具有顯著性差異(P<0.05)的原則進行第二次潛在標(biāo)記物篩選，獲得腎陽虛證大鼠模型血液潛在生物標(biāo)記物。

2.3.2腎陽虛證大鼠模型血液生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)

在確認(rèn)實驗第22天PCA得分圖顯示兩組完全分離后，對正常組與模型組的代謝數(shù)據(jù)矩陣進行模式識別分析方-正交偏最小二乘法分析(Orthogonal Partial Least Squares Analysis，OPLS-DA)分析，建立VIP文件，選取一定VIP值進行潛在生物標(biāo)記物的初步篩查，且滿足正常組與模型組組間各代謝物具有顯著性差異(P<0.05)的原則進行第二次潛在標(biāo)記物篩選，獲得腎陽虛證大鼠模型血液潛在生物標(biāo)記物。

2.3.3腎陽虛證潛在生物標(biāo)記物的鑒定

將所得到的腎陽虛證尿液和血液潛在生物標(biāo)記物保留時間和質(zhì)核比信息，導(dǎo)入Progenisis QI軟件生成的代謝物鑒定模塊下并設(shè)定成標(biāo)簽，進行代謝物庫的匹配。匹配原則：一級質(zhì)量數(shù)結(jié)合質(zhì)譜IDA采集得到的二級數(shù)據(jù)與代謝物庫進行匹配，以得分高低排序，得分越高，結(jié)構(gòu)確定的準(zhǔn)確性越大。對軟件所給出的可能結(jié)構(gòu)進行標(biāo)記，同時導(dǎo)出含有相對峰強度的鑒定結(jié)果列表，進行二次鑒定。二次鑒定主要是通過HMDB(http://www.hmdb.ca/)、KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)和Massbank(http://www.massbank.jp/)等檢索數(shù)據(jù)庫，并結(jié)合MSMS數(shù)據(jù)進行驗證，最終通過色譜保留行為以及MS/MS數(shù)據(jù)來確定標(biāo)記物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

2.4生物標(biāo)記物的代謝通路分析；將已鑒定的腎陽虛證生物標(biāo)記物的英文名稱、KEGG或HMDB號導(dǎo)入代謝通路分析網(wǎng)站(http://www.metaboanalyst.ca)進行分析后，以impact大于0的標(biāo)準(zhǔn)篩選關(guān)注代謝途徑，并繪制相應(yīng)代謝通路示意圖。

2.5腎陽虛證相關(guān)核心標(biāo)記物的生物信息分析與闡述：

首先，對所得到的生物標(biāo)記物及代謝通路進行歸納，分類。然后以生物標(biāo)記物名稱、疾病名稱、靶點名稱等與腎陽虛證相關(guān)的關(guān)鍵詞進行文獻搜尋，獲得臨床和實驗研究結(jié)果，結(jié)合腎陽虛證臨床化學(xué)指標(biāo)和組織病理學(xué)指標(biāo)，綜合分析其生物學(xué)信息，并獲得與腎陽虛證的發(fā)生發(fā)展相關(guān)的核心標(biāo)記物。最終闡述這些標(biāo)記物在這個腎陽虛證發(fā)生與發(fā)展過程的指示與作用。

3結(jié)果與討論；3.1尿液和血液的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析結(jié)果；3.1.1尿液的代謝組輪廓數(shù)據(jù)分析結(jié)果：

由圖10(a)～(d)和圖11(a)和(b)發(fā)現(xiàn)模型組大鼠尿液不同時間點尿液樣本明顯分開，并且隨著時間的推移，向著遠(yuǎn)離第0天尿液樣本的方向變化，以第22天偏離程度最大。說明模型大鼠正常的代謝網(wǎng)絡(luò)逐步受到干擾，從而造成了其代謝軌跡的變化。經(jīng)注射皮質(zhì)酮造模21天，大鼠的代謝輪廓產(chǎn)生影響，且模型組大鼠與正常組組大鼠開始有明顯的遠(yuǎn)離趨勢。為了觀察腎陽虛證大鼠質(zhì)譜代謝輪廓的動態(tài)變化，將不同時間點的正常組大鼠和模型組大鼠的第0天、7天、14天、22天的質(zhì)譜代謝輪廓數(shù)據(jù)圖11(a)和(b)導(dǎo)入Ezinfo 2.0軟件進行PCA分析，得出模型組大鼠質(zhì)譜代謝輪廓變化軌跡圖(如圖10(a)～(d))。

3.1.2血液的代謝輪廓數(shù)據(jù)分析結(jié)果

采用已建立的代謝組學(xué)分析技術(shù)，對實驗第22天正常大鼠和腎陽虛證模型大鼠的血清樣本數(shù)據(jù)進行代謝組學(xué)分析，結(jié)合尿液代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，綜合分析由皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的腎陽虛證大鼠模型的潛在性標(biāo)記物。經(jīng)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的大鼠血液代謝組經(jīng)PCA分析后獲得Scores plot圖。由圖12(a)和(b)可發(fā)現(xiàn)，正負(fù)離子模式下正常組均聚類在同一區(qū)域，說明實驗操作對代謝輪廓影響較小，而長期注射皮質(zhì)酮后的大鼠遠(yuǎn)離正常組大鼠區(qū)域，與正常組大鼠間已發(fā)生離散屬于不同的生命狀態(tài)，這是由于外界因素皮質(zhì)酮長期作用引起正常大鼠代謝輪廓的變化導(dǎo)致。

3.2腎陽虛證潛在生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)與鑒定結(jié)果；3.2.1尿液代謝組學(xué)數(shù)據(jù)模式識別結(jié)果：對模型組與正常組大鼠尿液代謝輪廓數(shù)據(jù)進行方-正交偏最小二乘判別分析(Orthonal Partial Least Square-Discriminate Analysis，OPLS-DA)分析，獲得能夠直觀反映對代謝輪廓軌跡變化貢獻率的VIP-Plot、圖13(a)和(b)和圖14(a)和(b)。在VIP散點圖中，離子碎片呈V型排列，底部離子(VIP值小)對代謝輪廓軌跡產(chǎn)生變化的貢獻率?。豁敹穗x子(VIP值大)對代謝輪廓軌跡產(chǎn)生變化的貢獻率大。在S-Plot和Loading plot中，依據(jù)載荷圖中距離原點越遠(yuǎn)，離子對代謝輪廓軌跡產(chǎn)生變化的貢獻越大。同時對各組所獲得計量資料信息數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，比較兩組間差別是否具有統(tǒng)計學(xué)意義，基于P值小于0.05作為篩查條件，作為潛在生物標(biāo)記物集合。

于Ezinfo選取VIP值貢獻值大于1的保留時間質(zhì)荷比數(shù)據(jù)，然后通過Loadingplot模塊將數(shù)據(jù)導(dǎo)回到Progenesis QI軟件并設(shè)定成標(biāo)簽，并對其中P小于0.05的潛在生物標(biāo)記物進行同時標(biāo)記，以VIP大于1和P值小于0.05的標(biāo)簽為目標(biāo)，進行代謝物庫的匹配。

3.2.2血液代謝組學(xué)數(shù)據(jù)模式識別結(jié)果

進一步挖掘?qū)Υx組分群起關(guān)鍵作用的血液內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，將實驗第22天血液樣本代謝輪廓進行OPLS-DA分析，得到相應(yīng)的VIP得分圖(見圖15(a)和(b)和圖16(a)和(b))，進行潛在生物標(biāo)記物的篩選。與尿液生物標(biāo)記物處理方法一致。

3.2.3腎陽虛證潛在生物標(biāo)記物的鑒定結(jié)果

對上述得到的潛在生物標(biāo)記物進行化合物結(jié)構(gòu)鑒定，鑒定結(jié)果見表5所示，共鑒定得到尿液生物標(biāo)記物33個，血液生物標(biāo)記物17個上述步驟十所述。各個生物標(biāo)記物的微觀含量變化見圖17。

表5腎陽虛證大鼠模型尿液(U)和血液(S)生物標(biāo)記物詳細(xì)信息

3.3生物標(biāo)記物的代謝通路分析將已鑒定的腎陽虛證生物標(biāo)記物的KEGG或HMDB號導(dǎo)入代謝通路在線網(wǎng)站(http://www.metaboanalyst.ca)進行分析后，有29個代謝通路發(fā)生擾動，以impact大于0的通路為標(biāo)準(zhǔn)，得到與腎陽虛證密切相關(guān)的16個代謝通路，包括α-亞麻酸的代謝，甘油磷脂的代謝，?；撬岷团；撬岽x，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，苯丙氨酸代謝，煙酸和煙酰胺的代謝，色氨酸代謝，泛酸和輔酶A的生物合成，嘧啶代謝，檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))，丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝，原發(fā)性膽汁酸的生物合成，類固醇激素的生物合成，精氨酸和脯氨酸代謝，嘌呤代謝，鞘脂類代謝。這些結(jié)果說明這些內(nèi)源性代謝產(chǎn)物在整個代謝軌跡中產(chǎn)生了強烈的擾動并且與與腎陽虛證模型密切相關(guān)，代謝路徑網(wǎng)絡(luò)中各代謝路徑詳細(xì)內(nèi)容(見圖2和表6)。

表6基于METPA的腎陽虛證標(biāo)記物代謝通路分析結(jié)果

4.實驗小結(jié)

采用OPLS-DA模式識別方法結(jié)合統(tǒng)計學(xué)分析，并通過整合數(shù)據(jù)庫檢索和多級質(zhì)譜辨識分析，已鑒定其中對整體代謝譜貢獻的50個代謝產(chǎn)物如圖3。利用生物信息學(xué)和相關(guān)數(shù)據(jù)庫追蹤上述關(guān)鍵代謝產(chǎn)物的代謝軌跡變化，重點考察與之相關(guān)聯(lián)的代謝通路的變化規(guī)律，以及這種代謝通路變化與腎陽虛證的臨床癥狀的關(guān)聯(lián)程度，明確了尿中33個關(guān)鍵代謝產(chǎn)物是與腎陽虛證的臨床定位和癥狀體現(xiàn)直接相關(guān)系的代謝標(biāo)記物。同理，明確了血中17個關(guān)鍵代謝產(chǎn)物是與腎陽虛證的臨床定位和癥狀體現(xiàn)直接相關(guān)聯(lián)的核心代謝標(biāo)記物。這些代謝產(chǎn)物參與的類固醇激素的生物合成(糖皮質(zhì)激素合成途徑)、酪氨酸代謝和苯丙氨酸代謝(神經(jīng)遞質(zhì)和激素合成途徑)、色氨酸代謝(神經(jīng)遞質(zhì)合成和犬尿氨酸途徑)、?；撬岷团；撬岽x(神經(jīng)遞質(zhì)合成途徑)、嘧啶代謝(嘌呤代謝途徑)、精氨酸代謝(肌酐代謝途徑)與腎陽虛證密切相關(guān)。