本發(fā)明屬于體外診斷學(xué)領(lǐng)域，涉及一種腫瘤診斷試劑盒，尤其是涉及一種胰腺癌干式熒光量子點(diǎn)聯(lián)檢診斷試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：胰腺癌是指胰腺外分泌系統(tǒng)發(fā)生的癌，大多數(shù)胰腺癌起源于導(dǎo)管上皮為導(dǎo)管腺癌，少數(shù)為囊腺癌、腺泡細(xì)胞癌等，它是一種死亡率極高（～99.9%，確診后）的腫瘤。由于早期無特異性臨床癥狀，胰腺癌的癥狀取決于腫瘤所在的位置和大小。臨床上約有90%以上的患者確診時(shí)已經(jīng)屬于中晚期，失去了最佳治療時(shí)機(jī)，其5年生存率僅為5%。在世界普通癌癥中，患胰腺癌的男性居世界第四位，女性居第五位，而且預(yù)后效果差。因此，實(shí)現(xiàn)對胰腺癌的早期診斷，提高胰腺癌患者的生存率，必然是治療該疾病的關(guān)鍵。目前，診斷胰腺癌的常用檢測指標(biāo)有CA19-9、CEA、CA242、POA和MUC等幾種。在實(shí)際診斷胰腺癌時(shí)，一般是用CA19-9、CEA、CA242三種具有代表性的指標(biāo)來綜合確診胰腺癌，多種腫瘤標(biāo)記物的綜合分析在特異性和靈敏度上明顯高于單一指標(biāo)。常規(guī)實(shí)驗(yàn)室或醫(yī)療單位用于檢測該三項(xiàng)指標(biāo)通常僅限于采用單一試劑盒，即一個(gè)試劑盒針對一種腫瘤標(biāo)記物的檢測，此種方式存在的缺點(diǎn)是：1、檢測步驟繁多，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；2、目前三種標(biāo)記物分別采用三種單指標(biāo)試劑盒進(jìn)行檢測，然后再進(jìn)行綜合判斷，由于不同生產(chǎn)廠家的試劑盒存在差異，且同一廠家的不同試劑盒由于檢測的標(biāo)記物不同可能會存在控制條件、參數(shù)的差異而導(dǎo)致檢測結(jié)果存在誤差，此種誤差在綜合分析三種標(biāo)記物的特異性和靈敏度上會產(chǎn)生較大的影響，可能導(dǎo)致判斷結(jié)果相差甚遠(yuǎn)。因此，開發(fā)一種能夠在相對統(tǒng)一的檢測條件下同時(shí)檢測該三種胰腺癌腫瘤標(biāo)記物的試劑盒，降低了由于人為原因造成的系統(tǒng)檢測誤差，大大提高了胰腺癌臨床檢測的特異性和靈敏度?，F(xiàn)已商品化的免疫層析試紙條多用膠體金作為標(biāo)記物，雖然檢測結(jié)果通過肉眼可見，但是膠體金由于顆粒粒徑較大、均一性差、免疫標(biāo)記物不穩(wěn)定等導(dǎo)致無法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量檢測、靈敏度低等缺陷。量子點(diǎn)（QDs）是一種半導(dǎo)體納米晶，其激發(fā)光譜寬，呈連續(xù)分布，發(fā)射光譜窄，單色性好、顏色可調(diào)并且具有持久的光化學(xué)穩(wěn)定性，其獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)使其作為一種新型的熒光探針而得到廣泛應(yīng)用。因此，本發(fā)明用量子點(diǎn)取代傳統(tǒng)的膠體金作為標(biāo)記物可以彌補(bǔ)膠體金標(biāo)記的不足，發(fā)明高靈敏度、多指標(biāo)同時(shí)檢測、簡便、直觀、價(jià)格低廉的免疫層析方法，提高胰腺癌陽性檢測率。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于應(yīng)用量子點(diǎn)熒光免疫層析技術(shù)研制出一種操作簡便、價(jià)格低廉和結(jié)果準(zhǔn)確的臨床聯(lián)合檢測胰腺癌的試劑盒，可以同時(shí)檢測CA19-9、CEA、CA242三種腫瘤標(biāo)記物，從而大大提高胰腺癌的檢測速度和效率，相對于單檢試劑盒具有靈敏度高及特異性強(qiáng)等優(yōu)勢。同時(shí)，每種腫瘤標(biāo)記物的熒光顏色不同，在紫外光照射下，結(jié)果判斷更加直觀。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)其目的采用如下技術(shù)方案：一種胰腺癌干式熒光量子點(diǎn)聯(lián)檢診斷試劑盒，包括試紙條、吸滴管、樣本稀釋液、樣本稀釋杯和存貯介質(zhì)，所述的反應(yīng)卡自下而上依次由樣品墊、量子點(diǎn)標(biāo)記的結(jié)合墊、反應(yīng)膜和吸水墊連接在一起后固定于背襯上而組成；其中，所述的反應(yīng)膜上含有由CA19-9單克隆抗體、CEA單克隆抗體、CA242單克隆抗體分別包被而成的3條T線即檢測線和1條由羊抗鼠IgG包被而成的C線即質(zhì)控線。其中，所述的量子點(diǎn)標(biāo)記的結(jié)合墊按照以下方法制備得到：將CA19-9單克隆抗體用Em=530nm的量子點(diǎn)標(biāo)記、CEA單克隆抗體用Em=610nm的量子點(diǎn)標(biāo)記、CA242單克隆抗體用Em=652nm的量子點(diǎn)標(biāo)記，即得三種檢測液，將三種檢測液用檢測稀釋液混合后（優(yōu)選為等比例混合），包被于玻璃纖維膜上，即得。優(yōu)選的，所述的硝酸纖維素膜上的3條檢測線和1條質(zhì)控線按照以下次序排列而成：從靠近吸水墊一端到靠近量子點(diǎn)結(jié)合墊一端依次為羊抗鼠IgG質(zhì)控線（C）、CA19-9單克隆抗體（T1）、CEA單克隆抗體（T2）、CA242單克隆抗體（T3）檢測線。所述反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜。所述檢測稀釋液的組分為5~8%蔗糖、12~15%海藻糖、1.5~2.0%BSA、0.5~1.0%吐溫Tween20、1.5~2.0%S9、0.02～0.05%proclin300的0.01MPBS緩沖溶液。所述樣本稀釋液的組分為0.5～1.0%吐溫Tween-20、0.02～0.05%proclin300的0.01MPBS緩沖溶液。所述的背襯為各種硬質(zhì)的支持物，只有在紫外照射下無熒光且具有負(fù)載和支持的功能都可用于本發(fā)明。本發(fā)明所述的量子點(diǎn)可為Ⅱ-Ⅳ族元素組成的化合物，如CdS、CdSe、CdTe、ZnS、ZnSe等，以及它們組成的核殼式量子點(diǎn)（如CdSe@CdS、CdSe@ZnS等）的任意一種，且均為水溶性羧基量子點(diǎn)。本發(fā)明所述同步定量胰腺癌的量子點(diǎn)免疫層析試紙條的制備方法包括以下步驟：1）量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的制備：A、取不同波長量子點(diǎn)分別用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH=6～8，加入EDC和sulfo-NHS（QDs:EDC的摩爾比為1:50～1:200；EDC:sulfo-NHS的摩爾比為1:1～5:1），渦旋振蕩均勻，室溫活化15～60min；B、分別對應(yīng)加入胰腺癌標(biāo)記物的相應(yīng)抗體（CA19-9單抗、CEA單抗、CA242單抗，且QDs和抗體的摩爾比為1:4～1:10），室溫振蕩反應(yīng)1～4h；C、反應(yīng)結(jié)束后用分子截留量30～100KDa的超濾離心管濃縮至30～100ul，然后采用凝膠尺寸排阻法進(jìn)行純化，收集有熒光的部分，再用超濾離心管濃縮后保存于PBS緩沖溶液中（含0.05%proclin300），4℃保存?zhèn)溆?，即得量子點(diǎn)標(biāo)記抗體檢測液；2）結(jié)合墊的處理：在濕度為40～60%的條件下，將1）中的檢測液用稀釋液稀釋50～100倍（檢測液等比例混合）后，噴到玻璃纖維膜上，37℃干燥1～2h，4℃保存?zhèn)溆?。檢測稀釋液成分為5~8%蔗糖、12~15%海藻糖、1.5~2.0%BSA、0.5~1.0%吐溫Tween20、1.5~2.0%S9、0.02～0.05%proclin300的0.01MPBS緩沖溶液。3）制備包被有檢測指標(biāo)的硝酸纖維素膜（NC膜）：檢測指標(biāo)為CA19-9單抗、CEA單抗、CA242單抗。以NC膜為反應(yīng)膜，將檢測指標(biāo)和羊抗鼠IgG用包被緩沖液調(diào)節(jié)濃度至0.1～2.0mg/ml，按照1～2ul/cm的溶液劃線液量，在濕度為40～60%的條件下，將檢測指標(biāo)和羊抗鼠IgG噴到反應(yīng)膜上對應(yīng)的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)進(jìn)行包被，各個(gè)指標(biāo)間隔為3～6mm，放置20～37℃干燥1～2h，4℃保存?zhèn)溆?，所用包被液?.01MPBS緩沖溶液。4）在干燥環(huán)境下，依次在熒光專用背襯上粘貼樣品墊、步驟2）所得結(jié)合墊、步驟3）制得的反應(yīng)膜以及吸水墊，得到試紙板，將試紙板切割成試紙條，得量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條。本發(fā)明試劑盒的使用方法及評測標(biāo)準(zhǔn)：定性或定量檢測：取200～500ul樣本稀釋液與10～40ul待檢樣本充分混勻后，取50～100ul混合液加入到試紙條的樣本墊內(nèi)，反應(yīng)3～10min即可讀取結(jié)果，具體操作如下：1）定性檢測或半定量檢測：用激發(fā)量子點(diǎn)的光源范圍在320～450nm的普通激發(fā)光源照射反應(yīng)膜區(qū)域，根據(jù)雙抗體夾心原理，當(dāng)待測樣本中含有胰腺癌的相應(yīng)抗原時(shí)，復(fù)合物將同時(shí)被T線和C線捕獲，激光照射下出現(xiàn)2條及2條以上條帶，且其中一條為C線時(shí)，檢測結(jié)果為陽性；反之，檢測樣本中不含相關(guān)抗原，則只在C線位置出現(xiàn)熒光條帶，檢測結(jié)果為陰性；如果T線和C線都不出現(xiàn)條帶則說明檢測無效，條帶顏色越深說明待測樣本中含有胰腺癌標(biāo)記物相關(guān)抗原含量越高，反之，條帶顏色越淺說明相關(guān)抗原含量越少。2）定量檢測：將加樣反應(yīng)后的試紙條，利用熒光定量分析儀進(jìn)行免疫層析掃描，將檢測線熒光強(qiáng)度/質(zhì)控線熒光強(qiáng)度的比值代入同批次存貯介質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)公式得知待測抗原含量。其中存貯介質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：配備一系列不同濃度的待檢抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入試紙條檢測孔，然后利用熒光定量分析儀分別進(jìn)行免疫層析檢測，通過檢測線熒光強(qiáng)度/質(zhì)控線熒光強(qiáng)度比值對相應(yīng)抗原濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明所述的量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條檢測法，具體為雙抗體夾心法，應(yīng)用范圍廣，可用于胰腺癌單項(xiàng)指標(biāo)或者多指標(biāo)的高靈敏度快速檢測，能夠檢測全血、血清、血漿等樣本。本發(fā)明所述一種胰腺癌干式熒光量子點(diǎn)聯(lián)檢診斷試劑盒及其制備方法，用量子點(diǎn)取代膠體金顆粒作為信號標(biāo)記物，與待測腫瘤標(biāo)記物相應(yīng)抗體偶聯(lián)后噴涂或者直接涂布于結(jié)合物釋放墊上，三種腫瘤標(biāo)記物所對應(yīng)的另三個(gè)位點(diǎn)的抗體以及羊抗鼠IgG包被于硝酸纖維素膜上，分別形成T1、T2、T3線（檢測線）和C線（質(zhì)控線）；通過將樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按一定順序組裝制成免疫層析試紙條。進(jìn)行臨床檢測時(shí)，根據(jù)T線和C線上是否出現(xiàn)熒光條帶以及熒光的強(qiáng)弱進(jìn)行定性和定量檢測。本發(fā)明的試紙條檢測靈敏度和特異性高于商品化的膠體金免疫試紙條，多指標(biāo)同時(shí)檢測，操作簡單快速，檢測耗時(shí)短，結(jié)果判讀容易，特別適合家庭，社區(qū)，醫(yī)院等場所對于胰腺癌的篩查、診斷、判斷預(yù)告和轉(zhuǎn)歸，評價(jià)治療效果和高危人群的跟蹤觀察，市場潛力巨大。附圖說明圖1免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)圖；圖2免疫試紙條定性或半定量檢測評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)；圖3CA19-9抗原濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖4CEA抗原濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖5CA242抗原濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例用以對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1一種胰腺癌干式熒光量子點(diǎn)聯(lián)檢診斷試劑盒1、試劑盒結(jié)構(gòu)1.1試劑盒組成一種胰腺癌干式熒光量子點(diǎn)聯(lián)檢診斷試劑盒，包括試紙條、吸滴管、樣本稀釋液、樣本稀釋杯和存貯介質(zhì)。1.2試紙條結(jié)構(gòu)圖1說明試紙條結(jié)構(gòu)。圖1中，所述的胰腺癌量子點(diǎn)聯(lián)檢診斷試劑條，其包括依次搭接于熒光專用底襯5上的樣品墊1、結(jié)合墊2、NC膜3、吸水墊4。所述試紙條的樣本墊1為可過濾紅細(xì)胞的玻璃纖維膜。結(jié)合墊2為玻璃纖維膜或聚酯膜。所述NC膜3，其上具有檢測線T1（即31）、檢測線T2（即32）、檢測線T3（即33）和質(zhì)控線C（即30）。2、試紙條制備方法1）量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的制備；A、取不同波長量子點(diǎn)分別用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH=6～8，加入EDC和sulfo-NHS（QDs:EDC的摩爾比為1:50～1:200；EDC:sulfo-NHS的摩爾比為1:1～5:1），渦旋振蕩均勻，室溫活化15～60min；B、分別對應(yīng)加入胰腺癌標(biāo)記物的相應(yīng)抗體（CA19-9單抗、CEA單抗、CA242單抗，且QDs和抗體的摩爾比為1:4～1:10），室溫振蕩反應(yīng)1～4h；C、反應(yīng)結(jié)束后用分子截留量30～100KDa的超濾離心管濃縮至30～100ul，然后采用凝膠尺寸排阻法進(jìn)行純化，收集有熒光的部分，再用超濾離心管濃縮后保存于PBS緩沖溶液中（含0.05%proclin300），4℃保存?zhèn)溆?，即得量子點(diǎn)標(biāo)記抗體檢測液；2）結(jié)合墊的處理：在濕度為40～60%的條件下，將1）中的檢測液用稀釋液稀釋50～100倍（檢測液等比例混合）后，噴到玻璃纖維膜上，37℃干燥1～2h，4℃保存?zhèn)溆?。檢測稀釋液成分為5~8%蔗糖、12~15%海藻糖、1.5~2.0%BSA、0.5~1.0%吐溫Tween20、1.5~2.0%S9、0.02～0.05%proclin300的0.01MPBS緩沖溶液；3）制備包被有檢測指標(biāo)的硝酸纖維素膜（NC膜）：檢測指標(biāo)為CA19-9單抗、CEA單抗、CA242單抗。以NC膜為反應(yīng)膜，將檢測指標(biāo)和羊抗鼠IgG用包被緩沖液調(diào)節(jié)濃度至0.1～2.0mg/ml，按照1～2ul/cm的溶液劃線液量，在濕度為40～60%的條件下，將檢測指標(biāo)和羊抗鼠IgG噴到反應(yīng)膜上對應(yīng)的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)進(jìn)行包被，各個(gè)指標(biāo)間隔為3～6mm，放置20～37℃干燥1～2h，4℃保存?zhèn)溆茫冒灰簽?.01MPBS緩沖溶液。4）在干燥環(huán)境下，依次在熒光專用背襯上粘貼樣品墊、步驟2）所得結(jié)合墊、步驟3）制得的反應(yīng)膜以及吸水墊，得到試紙板，將試紙板切割成試紙條，得量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條。實(shí)施例2試劑盒檢測方法及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)用樣本稀釋液將待檢樣本稀釋到樣本稀釋杯中，用吸滴管吸取待測樣本稀釋液滴加到試紙條的上樣處，等候約3~10min后，待樣本沿試紙條層析后，對其進(jìn)行鑒定。定性或半定量檢測：用激發(fā)量子點(diǎn)的光源范圍在320~450nm的普通激發(fā)光源照射反應(yīng)膜區(qū)域，根據(jù)量子點(diǎn)標(biāo)記的對應(yīng)抗體的熒光的顏色進(jìn)行鑒定，自吸水墊至樣品墊分別為檢測CA19-9、CEA、CA242的條帶，相對應(yīng)熒光顏色為綠色、橙色、紅色，且靠近吸水墊端的質(zhì)控線始終有熒光。則可以根據(jù)不同組合顏色變化對應(yīng)胰腺癌的機(jī)率，見圖2所示。定量檢測：利用熒光定量分析儀進(jìn)行免疫層析掃描加樣反應(yīng)后的試紙條，自吸水墊至樣品墊分別為C、T1、T2、T3對應(yīng)的熒光譜圖，將所得檢測線熒光強(qiáng)度/質(zhì)控線熒光強(qiáng)度的比值代入同批次存貯介質(zhì)中的相對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)公式得知待檢抗原含量。實(shí)施例3試紙標(biāo)準(zhǔn)曲線建立（a）取CA199、CEA、CA242標(biāo)準(zhǔn)品配制一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)液，如表1所示，將標(biāo)準(zhǔn)液CA199、CEA、CA242的1號標(biāo)準(zhǔn)液混合均勻，標(biāo)記為B1，同理，配制標(biāo)號為B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、B10系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)使用液。表1標(biāo)準(zhǔn)液類別12345678910CA199(U/mL)151050100250500100015002000CEA(ng/mL)0.31250.6251.252.5510205075100CA242(U/mL)15105010025050075010001500（b）將1-10標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別滴加在10條量子點(diǎn)免疫層析試條上，相同條件下用檢測儀進(jìn)行檢測（即：每一標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別用10條量子點(diǎn)免疫層析試條在相同條件下用檢測儀檢測10次），分別讀得其T1、T2、T3帶熒光強(qiáng)度（FL1、FL2、FL3）與C帶熒光強(qiáng)度（FLc），得到平均值和FL1/FLc、FL2/FLc、FL3/FLc比值。（c）以標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度作X軸，分別以FL1/FLc、FL2/FLc、FL3/FLc比值作Y軸，得到同批次量子點(diǎn)檢測CA19-9、CEA、CA242抗原試紙條的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3、圖4、圖5。（d）將（c）所得標(biāo)準(zhǔn)曲線采用二維碼、條碼、或IC卡芯片等存貯介質(zhì)進(jìn)行儲存，用于同批次試紙條的參照標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)前第1頁1 2 3