本發(fā)明涉及一種農(nóng)藥殘留量的分析方法，具體涉及一種利用氣相色譜儀-電子捕獲檢測器(GC-ECD)測定花生植株或花生殼中仲丁靈殘留量的方法。

背景技術(shù)：

仲丁靈英文通用名稱：butralin，其化學(xué)名稱為N-仲丁基-4-特丁基-2,6-二硝基苯胺，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1，化學(xué)分子式：C₁₄H₂₁N₃O₄，由法國福比埃公司開發(fā)而成，為二硝基苯胺類選擇性芽前土壤處理除草劑，其進入植物體后,主要抑制分生組織的細胞分裂,從而抑制雜草幼芽及幼根生長。主要用于防除花生、地瓜、棉花、蔬菜、大豆、大蒜、元蔥、瓜類等作物田中稗草、牛筋草、馬唐,狗尾草等1年生單子葉雜草及部分雙子葉雜草，亦可作植物生長調(diào)節(jié)劑使用,控制煙草腋芽生長。

目前，測定仲丁靈殘留量的方法有高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，氣相色譜法和氣相色譜－質(zhì)譜法，其應(yīng)用于水、土壤、糧谷、水果、蔬菜、動物肌肉、煙草和中草藥中仲丁靈殘留量的檢測已有報道。國內(nèi)外至今尚未見花生中仲丁靈殘留量的測定方法報道。因此，從保障農(nóng)產(chǎn)品安全及完善農(nóng)殘檢測標(biāo)準(zhǔn)體系的角度出發(fā)，有必要建立一種科學(xué)的、適于測定花生中仲丁靈殘留量的方法。

氣相色譜－質(zhì)譜法和液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法，普及度不高，并非每個檢測機構(gòu)都具備相應(yīng)的檢測條件。而氣相色譜法所用儀器設(shè)備簡單，操作方便，易于推廣，高靈敏度和高精度的技術(shù)優(yōu)勢，目前仍然為分析環(huán)境介質(zhì)和各種作物體中仲丁靈殘留量的首選方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種能利用GC-ECD法測定花生植株或花生殼中仲丁靈殘留量的方法，以簡單、準(zhǔn)確、快速、可靠地對花生植株或花生殼中仲丁靈殘留量進行檢測。

本發(fā)明提供的基于GC-ECD測定花生植株或花生殼中仲丁靈殘留量的方法包括以下步驟：

步驟一：根據(jù)仲丁靈的性質(zhì)選定GC-ECD檢測條件為：

檢測器采用電子捕獲檢測器ECD；色譜柱長度為30m，內(nèi)徑320μm，粒徑為1μm的DB1701氣相色譜柱；色譜柱溫度為：初始溫度100℃保持1min后，以20℃/min升至260℃，再以40℃/min升至280℃保持5min；進樣口溫度為260℃；檢測器溫度為300℃；載氣為純度99.999％的高純氮氣，載氣流量為2.5mL/min，尾吹氣為流速40mL/min的氮氣；采用不分流進樣方式，進樣量為5μL；

步驟二：標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取質(zhì)量濃度為99.0％的仲丁靈標(biāo)準(zhǔn)品0.0101g于100mL的容量瓶中，用正己烷溶解并配制成仲丁靈質(zhì)量濃度為1000.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)母液，并采用梯度稀釋法用正己烷稀釋配制成0.01、0.05、0.10、0.50及1.00mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，并在選定的GC-ECD檢測條件下進行測定，以仲丁靈的質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的色譜峰面積A₁為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得出線性方程為：A₁＝37225C－437.9，線性方程的相關(guān)系數(shù)R²≥0.9990，由此確定，在選定的GC-ECD檢測條件下能進行花生植株或花生殼樣品的定性和定量分析；

步驟三：樣品前處理

將待測的花生植株或花生殼破碎，得到花生植株或花生殼樣品；

步驟四：仲丁靈的提取

將步驟三制備的花生植株或花生殼樣品置于第一容器中，加入乙腈，在35℃下振蕩提取，之后經(jīng)布氏漏斗減壓抽濾，再用乙腈進行兩次殘渣洗滌，收集全部濾液轉(zhuǎn)入第二容器中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于45℃濃縮至近干，得到花生植株或花生殼樣品提取濃縮液；

步驟五：提取液的凈化

將弗羅里硅土凈化層析柱先用體積比例為99：1的正己烷和乙酸乙酯混合液預(yù)淋洗，然后將步驟四制備的花生植株或花生殼樣品提取濃縮液全部移入弗羅里硅土層析柱中，用體積比例為99：1的正己烷和乙酸乙酯混合液進行少量多次淋洗，收集全部淋出液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于45℃濃縮近干，再用正己烷定容，即得到花生植株或花生殼樣品待測溶液；

步驟六：殘留量測定結(jié)果的計算

運用步驟一中選定的GC-ECD檢測條件對步驟五得到的花生植株或花生殼樣品待測溶液m g，V mL進行GC-ECD測定，測得花生植株或花生殼樣品待測溶液中仲丁靈的色譜峰面積A₂，代入殘留量計算公式，求得花生植株或花生殼樣品待測溶液中仲丁靈的質(zhì)量濃度X，即得樣品待測溶液中仲丁靈的殘留量，其中殘留量計算公式如下：

$X=\frac{A_2\×C\×V}{A_1\×m}$

式中：X－樣品待測溶液中仲丁靈的質(zhì)量濃度(殘留量)，mg/kg；

C－標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中仲丁靈的濃度，mg/L；

V－樣品最終定容體積，ml；

A₁－標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中的仲丁靈色譜峰面積；

A₂－樣品待測溶液中的仲丁靈的色譜峰面積；

m－樣品質(zhì)量，g。

所述基于GC-ECD測定花生植株或花生殼中仲丁靈殘留量的方法還包括測定回收率、相對偏差及檢出限：在步驟三制備得到的花生植株或花生殼樣品中添加仲丁靈的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使其濃度分別為0.02、0.20和2.00mg/kg，每檔濃度重復(fù)5次，后續(xù)操作同步驟四和步驟五，得到花生植株或花生殼樣品待測溶液，利用步驟一中選定的GC-ECD檢測條件測定花生植株或花生殼樣品待測溶液中仲丁靈的殘留量，并計算其回收率是否達到70-110％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差是否為0-20％，仲丁靈的最小檢出量是否為1.0×10^-11g，步驟二中線性方程的相關(guān)系數(shù)是否大于0.99，若四個指標(biāo)皆達到標(biāo)準(zhǔn)，說明建立的檢測方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度都符合農(nóng)藥殘留檢測的要求。

所述步驟三中花生植株樣品的制備方法為：將采集的花生植株，去除腐爛部分，剪除根部，然后剪碎成1cm左右的小碎段，即得；所述步驟三中花生殼樣品的制備方法為：將花生外殼用食品加工機粉碎，過20目篩，即得。

所述步驟五中弗羅里硅土層析柱從下至上依次裝填有脫脂棉、2cm厚無水硫酸鈉、5g弗羅里硅土、2cm厚無水硫酸鈉，且在裝柱過程中敲緊敲實。

本發(fā)明建立了花生殼和花生植株中仲丁靈殘留量的GC-ECD檢測方法，該方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留測定的技術(shù)要求。

附圖說明

圖1為仲丁靈化學(xué)式。

圖2為仲丁靈標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖3 1.00mg/L仲丁靈標(biāo)準(zhǔn)工作溶液GC-ECD檢測色譜圖

圖4為花生植株空白樣品GC-ECD檢測色譜圖。

圖5為花生植株添加0.20mg/kg GC-ECD檢測色譜圖。

圖6為花生殼空白樣品GC-ECD檢測色譜圖。

圖7為花生殼添加0.20mg/kg GC-ECD檢測色譜圖。

圖8為花生籽粒空白樣品GC-ECD檢測色譜圖。

圖9為花生籽粒添加0.20mg/kg GC-ECD檢測色譜圖。

具體實施方式

步驟一根據(jù)仲丁靈的性質(zhì)選定GC-ECD檢測條件

檢測器：電子捕獲檢測器(ECD)；色譜柱為：DB1701氣相色譜柱(30m×320μm×1μm)；色譜柱溫度：初始溫度100℃保持1min，以20℃/min升至260℃，再以40℃/min升至280℃保持5min；進樣口溫度：260℃；檢測器溫度：300℃；載氣為高純氮氣(純度為99.999％)，流量：2.5mL/min，尾吹氣為氮氣(流速為40mL/min)；不分流進樣，進樣量5μL。在上述選定的氣相色譜檢測條件下，仲丁靈的相對保留時間為11.3min左右。

步驟二標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取99.0％的仲丁靈標(biāo)準(zhǔn)品0.0101g(精確至0.0001g)于100mL的容量瓶中，用正己烷溶解并配制成仲丁靈質(zhì)量濃度為1000.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)母液。采用梯度稀釋法用正己烷稀釋配制成0.01、0.05、0.10、0.50及1.00mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，并在選定的GC-ECD檢測條件下進行測定。以仲丁靈的質(zhì)量濃度(x，mg/L)為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果如圖2所示，經(jīng)統(tǒng)計分析處理得出仲丁靈的線性方程為：y＝37225x-437.9(R²＝0.9990)。結(jié)果表明仲丁靈的質(zhì)量濃度與其相對應(yīng)的色譜峰面積之間呈良好的線性關(guān)系，故選定的GC-ECD檢測條件可以用來進行樣品的定性和定量分析。在選定的GC-ECD檢測條件下仲丁靈的最小檢出量為1.0×10^-11g。仲丁靈的最低檢出濃度分別為：花生植株、花生殼樣品均為0.02mg/kg。

步驟三樣品前處理

將采集的花生植株，去除腐爛部分，剪除根部，然后剪碎成1cm左右的小碎段，形成花生植株樣品。

將花生外殼用食品加工機粉碎，過20目篩，形成花生殼粒樣品。

步驟四仲丁靈的提取

準(zhǔn)確稱取已制備好的花生植株(花生殼)樣品10.0g，置于250mL具塞三角瓶中，加入80mL乙腈(花生殼加60mL乙腈)，在35℃下振蕩提取30min，之后經(jīng)布氏漏斗減壓抽濾，再用30mL乙腈分兩次洗滌殘渣，收集全部濾液轉(zhuǎn)入250mL磨口三角瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(45℃)上濃縮至近干，得到花生植株(花生殼)樣品提取濃縮液，待弗羅里硅土層析柱凈化。

步驟五提取液的凈化

上述花生植株或花生殼樣品提取濃縮液需要過弗羅里硅土層析柱凈化，弗羅里硅土層析柱從下至上依次裝填有少許脫脂棉、2cm厚無水硫酸鈉、5g弗羅里硅土、2cm厚無水硫酸鈉，在裝柱的過程中要敲緊敲實，在弗羅里硅土層析柱裝好后，先用15mL正己烷：乙酸乙酯(99:1)混合液預(yù)淋洗，再將上述花生植株或花生殼的提取濃縮液全部移入弗羅里硅土層析凈化柱中，用50mL的正己烷：乙酸乙酯(99:1)混合液淋洗(少量多次，每次5mL左右)，收集全部淋出液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(45℃)上濃縮近干，再用正己烷定容至2.0mL，得花生植株或花生殼樣品待測溶液，待GC-ECD檢測。

步驟六殘留量測定結(jié)果的計算

運用步驟一中選定的GC-ECD檢測條件對花生植株或花生殼樣品待測溶液進行GC-ECD測定，測得花生植株或花生殼樣品待測溶液中仲丁靈的色譜峰面積，代入殘留量計算公式，求得花生植株或花生殼樣品待測溶液中仲丁靈的質(zhì)量濃度，即得花生植株或花生殼樣品待測溶液中仲丁靈的殘留量。殘留量計算公式如下：

$X=\frac{A_2\×C\×V}{A_1\×m}$

式中：X－樣品待測溶液中仲丁靈的殘留量，mg/kg；

C－標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中仲丁靈的濃度，mg/L；

V－樣品最終定容體積，ml；

A₁－標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中仲丁靈的峰面積；

A₂－樣品待測溶液中的仲丁靈的峰面積；

m－樣品質(zhì)量，g。

步驟七添加回收率和精密度

分別在步驟三制備的花生植株或花生殼樣品中添加仲丁靈的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使其濃度分別為0.02、0.20和2.00mg/kg(3檔濃度)，每檔重復(fù)5次，后續(xù)操作同步驟四和步驟五，得到花生植株或花生殼樣品待測溶液，利用步驟一中選定的GC-ECD檢測條件測定花生植株或花生殼樣品待測溶液中仲丁靈的殘留量，并計算其回收率，結(jié)果見表1。

表1仲丁靈在花生植株或花生殼中的加標(biāo)回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝5)

由此可見，本發(fā)明建立了GC-ECD法檢測花生植株或花生殼中仲丁靈，該方法線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9990，最小檢出量均為1.0×10^-11g,最小檢測濃度均為0.02mg/kg，平均回收率在94.49-104.60％之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.36-3.57％范圍內(nèi)，方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度都符合農(nóng)藥殘留檢測的要求。

下面舉例說明實際樣品測定情況：

(1)花生植株

對2016年采集于湖南省長沙市東岸鄉(xiāng)的土壤按有效成分3262.5g a.i./ha(制劑用量為453.12毫升/畝)施藥1次，制劑兌水稀釋(60kg/畝)，在播后苗前噴霧。待花生出苗后長至10cm左右后開始取樣，分別在出苗后長至10cm左右后0、1、3、5、7、10、14、21、28、35、42d采集花生植株進行仲丁靈殘留量檢測，結(jié)果見表2。

表2花生植株中仲丁靈的殘留量

(2)花生殼

對2016年采集于湖南省長沙市東岸鄉(xiāng)的土壤按2175g a.i./ha(制劑用量為302.08毫升/畝)和3262.5g a.i./ha(制劑用量為453.12毫升/畝)兌水稀釋(60kg/畝)，分別施藥1次，在播后苗前噴霧。在正常收獲期分別采集花生，并將它曬干，花生用手工將花生殼和花生籽分開，花生殼經(jīng)植物粉碎機粉碎并過20目篩，進行仲丁靈殘留量檢測，結(jié)果見表3。

表3仲丁靈在花生殼中的殘留量

注：ND系指仲丁靈在花生殼中的殘留量低于其最小檢測濃度(0.02mg/kg)，其中花生殼以風(fēng)干花生殼重量計。

上述方法經(jīng)驗證也可用于花生籽粒中仲丁靈殘留量的測定，只是測定前對花生籽粒的前處理及其仲丁靈的提取、凈化稍有不同。當(dāng)將此法用于花生籽粒時，需要人工先將花生果實去外殼并用食品加工機粉碎，過20目篩，形成花生籽粒樣品。然后，準(zhǔn)確稱取已制備好的花生籽粒樣品10.0g，置于250mL具塞三角瓶中，加入80mL乙腈，超聲波提取10min,然后加入10g氯化鈉，在35℃下振蕩提取30min，將上層澄清液經(jīng)布氏漏斗減壓抽濾，抽濾時在濾紙上鋪一層無水硫酸鈉，收集全部濾液轉(zhuǎn)入250mL磨口三角瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(45℃)上濃縮至近干，待凈化。再將花生籽粒樣品的提取濃縮液過弗羅里硅土和C_18E混合層析柱凈化，層析柱從下至上依次裝填有少許脫脂棉、2cm厚無水硫酸鈉、8.3g混合凈化劑(弗羅里硅土：C_18E，8:0.3)、2cm厚無水硫酸鈉，在裝柱的過程中要敲緊敲實，在凈化層析柱裝好后，先用15mL正己烷：乙酸乙酯(99:1)混合液預(yù)淋洗，再將上述花生籽粒的提取濃縮液全部移入層析凈化柱中，用50mL的正己烷：乙酸乙酯(99:1)混合液淋洗(少量多次，每次5mL左右)，收集全部淋出液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(45℃)上濃縮近干，再用正己烷定容至2.0mL，待GC-ECD檢測。之后，參照上述花生植株及花生殼的GC-ECD檢測方法即可。