本發(fā)明屬于環(huán)境樣品檢測領域，具體涉及一種土壤中2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮和丁基甲氧基二苯甲酰甲烷的檢測方法。
背景技術：
防曬化妝品是現(xiàn)今人們必備的化妝品之一，它的防曬功效主要來自于其中的紫外線吸收劑。按防曬原理來分，防曬劑可分為物理防曬劑和化學防曬劑。其中，物理防曬劑是不透光的，主要是靠反射和散射作用，屏蔽掉紫外線來防曬；而化學防曬劑則是透明的，可以吸收紫外線，再以低能射線釋放，以達到防曬的目的，應用較多，這類物質通常含有一個或多個芳香環(huán)或結構，通過碳碳雙鍵或酰基相連，形成共軛結構，在陽光照射下，可吸收光子達到高能態(tài)，
然后再通過釋放低能射線的方式，完成能量的轉移，從而達到吸收紫外線，保護皮膚的目的。防曬霜中的防曬劑一般可以吸收UV-A 320-400nm和UV-B 280-320nm的紫外線，為了達到良好的防曬效果，一種防曬霜中會加入多種防曬劑。其中，2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮(BP-3)和丁基甲氧基二苯甲酰甲烷(BMDBM)是兩種常用的紫外吸收劑，基本信息如表1所示。
表1 BP-3和BMDBM的基本信息
近年來的研究發(fā)現(xiàn)，河流、湖泊、海洋、沉積物和土壤等環(huán)境介質以及魚類等生物樣品中檢測了多種紫外線吸收劑，說明隨著化妝品和相關產品的使用，紫外線吸收劑已進入環(huán)境中，并在環(huán)境長期殘留，甚至進入食物鏈，在生物體內積累。有研究表明，部分紫外線吸收劑在水生生物體內具有雌激素活性，其潛在危害和不利影響已不容忽視。
目前針對紫外線吸收劑的檢測方法主要集中在它們在化妝品和相關產品中的含量，但是對于它們在環(huán)境介質特別是土壤中的分析方法關注較少。因此，為了了解土壤中紫外線吸收劑的濃度水平和遷移變化規(guī)律，需要建立一種高效靈敏，回收率高的處理和分析方法，用于定性定量地檢測沉積物和土壤中的痕量紫外線吸收劑的含量水平。
技術實現(xiàn)要素：
為解決現(xiàn)有技術的缺點和不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種土壤中2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮(BP-3)和丁基甲氧基二苯甲酰甲烷(BMDBM)的檢測方法，更具體地說是采用加速溶劑萃取(Accelerated solvent extraction，ASE)和三重串聯(lián)四極桿液質聯(lián)用儀(LC-MS/MS)定性定量測定土壤中兩種紫外線吸收劑2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮(BP-3)和丁基甲氧基二苯甲酰甲烷(BMDBM)含量的方法，可以同時對土壤中BP-3和BMDBM兩種紫外吸收劑進行定性和定量檢測。
加速溶劑萃取(accelerated solvent extraction，ASE)是近年來新興起的一種提取方法。其原理是在將樣品放入密封的萃取池內，加入提取溶劑，進行加溫加壓的萃取，相比起常規(guī)的提取方法，ASE提取時間短，所用溶劑少，對大部分化合物都有較高的回收率，是一種高效的提取方法。另外，本發(fā)明提取溶劑為有機溶劑，可以同時提取多種目標化合物，提取后只需要同時旋轉蒸發(fā)儀濃縮處理，不需要再使用固相萃取等手段濃縮，提取效率高，實驗時間短，是一種高效快捷的提取方法。
高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)采用多反應檢測模式(MRM)，可以同時檢測樣品中的多種目標化合物，并且每種物質都選擇特定的一對母離子和子離子作為定量離子，同時選定一對或多對特定的母離子和子離子作為定性離子，可以有效地降低基質干擾，提高方法定性和定量的靈敏度和準確度。另外本發(fā)明的定量方法使用內標法，相比外標法，內標法能降低實驗前處理操作所造成的誤差，定量結果更準確。
本發(fā)明目的通過以下技術方案實現(xiàn)：
一種土壤中2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮和丁基甲氧基二苯甲酰甲烷的檢測方法，包括以下步驟：
(1)樣品前處理
土壤樣品采集后，盡快干燥，去除石塊和植物根葉等較大的雜質，研磨均勻并過篩；
(2)提取
將前處理后的樣品采用加速溶劑萃取儀提取，提取過程如下：在萃取池底部放上一張濾紙，加入一定量石英砂，再加入前處理后的樣品，滴加內標溶液后，加入石英砂，最后用另一張濾紙壓緊并擰緊萃取池；將萃取池放入加速溶劑萃取儀內開始萃取程序，萃取完成后，萃取液用旋轉蒸發(fā)儀蒸干后，重新以甲醇定容，然后過有機相尼龍濾膜，轉移至進樣小瓶，等待LC-MS/MS檢測；
(3)標準工作溶液的配制
用分析天平稱取BP-3、BMDBM和1種內標物的標準物質，分別配制成儲備溶液和工作溶液，最后配制成梯度濃度的標準工作溶液，以內標法建立標準工作曲線；
(4)高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)檢測
將步驟(3)中的各濃度梯度的標準工作溶液進行LC-MS/MS測定，使用內標法建立標準工作曲線；在相同條件下將步驟(2)中得到的樣品溶液注入LC-MS/MS進行測定，將樣品中目標化合物的色譜峰面積代入標準工作曲線，得到樣品溶液中BP-3和BMDBM的含量，然后根據(jù)樣品質量計算得到樣品中BP-3和BMDBM的含量；若樣品溶液中目標化合物的含量超過標準工作曲線的線性范圍上限，應減少樣品量再重新提取和檢測。
步驟(1)中，優(yōu)選地使用冷凍干燥儀將樣品凍干，樣品研磨后過0.90mm篩子，盡快進行提取和檢測，如樣品未能即刻提取，應將樣品密封保存于4℃的冰箱或冷庫中。
步驟(2)中，內標溶液優(yōu)選為異丙甲草胺-D6(Metolachlor-d6)。
步驟(2)中，優(yōu)選樣品量為2～8g，若樣品中目標化合物的濃度較大或者基質干擾較嚴重，可減少樣品量，并將樣品與1～4倍質量的石英砂混合均勻，再加入萃取池中進行提取；優(yōu)選加入1mL甲醇定容。
步驟(2)中，所述的石英砂作為填充劑加入，每次加入量3～7g，視樣品量而定，一方面的作用是壓緊萃取池中的樣品，防止樣品在提取過程中被高壓注入的溶劑沖散，另一方面的作用是填充萃取池的空間，在保證高回收率的情況下，減少提取溶劑的使用量。
步驟(2)中，優(yōu)選的提取條件如下：萃取池容量為34mL，提取溶劑為甲醇和二氯甲烷的混合溶劑，其中甲醇比例為60％～100％(體積比)，提取溫度為80～130℃，靜態(tài)提取時間為4～8min，氮氣吹掃時間為30～60s，提取循環(huán)次數(shù)為2～3次。
步驟(3)中，優(yōu)選的內標物為異丙甲草胺-D6(Metolachlor-d6)，標準工作曲線的梯度濃度至少5個以上。
步驟(4)中，優(yōu)選的色譜條件如下：色譜柱為Agilent SB-C18(3.0×100mm,1.8μm)、柱溫為30～40℃、進樣量為5～10μL；流動相為體積比的0.01％甲酸水溶液(A)和甲醇(B)，梯度洗脫程序如下：0～4min 40％～90％B，5～14min90％B，流速0.30mL/min。
步驟(4)中，優(yōu)選的質譜條件如下：離子源為電噴霧離子化源(ESI)正模式；干燥氣溫度200～300℃，流速3～5mL/min；噴霧氣壓力為15～45psi；鞘氣流速為9～11mL/min，鞘氣溫度為200～300℃。在此條件下，BP-3、BMDBM和內標的質譜參數(shù)如表2所示。
表2 BP-3、BMDBM和內標在LC-MS/MS中的質譜參數(shù)
a粗體為定量離子
本發(fā)明利用加速溶劑萃取技術，建立了快速高效高回收率的提取方法，然后利用高效液相色譜-質譜聯(lián)用進行檢測，有效地對土壤中2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮和丁基甲氧基二苯甲酰甲烷進行了分析檢測，本發(fā)明具有以下特點。
(1)由于丁基甲氧基二苯甲酰甲烷在土壤中的吸附能力較強，超聲萃取或索氏提取等方法的萃取條件較溫和，土壤中吸附的丁基甲氧基二苯甲酰甲烷不能被完全萃取，回收率較低。本發(fā)明采用加速溶劑萃取法，樣品在較高的溫度和壓力條件下進行萃取，丁基甲氧基二苯甲酰甲烷回收率較高，并且耗時短，所需溶劑少。
(2)由于2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮和丁基甲氧基二苯甲酰甲烷的極性和土壤吸附性等性質差別較大，單一溶劑難以同時提取這兩種化合物。本發(fā)明采用極性(甲醇)和非極性(二氯甲烷)溶劑混合，使得兩種化合物都能得到充分提取。
(3)本發(fā)明使用內標法定量，內標物異丙甲草胺-D6與目標化合物的性質接近，在液質聯(lián)用儀中保留時間接近，是一種理想的內標物，在樣品萃取前加入樣品中，抵消了目標化合物在萃取過程中損失所造成的誤差，使得兩種目標化合物都能得到良好的回收率。
(4)目前我國關于土壤中2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮和丁基甲氧基二苯甲酰甲烷的相關監(jiān)測技術尚處于技術空白，本發(fā)明從前處理和儀器分析方面提供了一套高效、快速和準確的土壤中BP-3和BMDBM的提取和分析技術，2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮和丁基甲氧基二苯甲酰甲烷的平均回收率為95.1％～99.3％和92.7％～93.2％，檢出限<1.0ng/g，定量限<2.0ng/g，適用于多種土壤介質中2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮和丁基甲氧基二苯甲酰甲烷的檢測。
附圖說明
圖1為2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮(BP-3)、丁基甲氧基二苯甲酰甲烷(BMDBM)和內標物異丙甲草胺-D6(Metolachlor-d6)的特征離子流圖。
具體實施方式
下面結合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例中使用的儀器與試劑
2種紫外線吸收劑：2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮(BP-3，98％)和丁基甲氧基二苯甲酰甲烷(BMDBM，99％)、1種內標物異丙甲草胺-D6(Metolachlor-d6，100％)，分別購自于Alfa Aesar和Dr.Ehrenstorfer公司。實驗所用甲醇和二氯甲烷均為進口色譜純，所用水為Milli-Q水；石英砂為國產分析純；實驗所用玻璃器皿均用自來水洗凈，Milli-Q水沖洗，烘干后，于馬弗爐中300℃以上烘烤3～4小時。
提取儀器為加速溶劑提取儀ASE 300(Dionex,Sunnyvale,CA,USA)配置34mL不銹鋼萃取池。檢測儀器為高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)Agilent 1200RRLC/Agilent G6460A Triple Quadrupole。
實施例1
(1)樣品前處理
采集200g土壤樣品，冷凍干燥后，去除石塊和植物根葉等較大的雜質，研磨均勻并過0.90mm篩。
(2)提取
萃取池底部放入一張玻璃纖維濾紙，壓平，加入5.0g石英砂，輕敲萃取池，使石英砂表面平整，再加入5.0g前處理后的土壤樣品，同樣平整樣品表面后，加入100μL 1mg/L的內標物工作溶液，加入5.0g石英砂，最后放入另一張濾紙壓緊后擰緊萃取池。提取溶劑為甲醇/二氯甲烷(90：10，v/v)，提取溫度為120℃，靜態(tài)提取時間為5min，氮氣吹掃時間為60s，靜態(tài)提取循環(huán)2次。萃取液用旋轉蒸發(fā)儀蒸干后，重新以1mL甲醇定容，然后過0.22μm有機相尼龍濾膜，并轉移至進樣小瓶中，待上機檢測。
(3)標準工作溶液的配制
用分析天平稱取2種紫外線吸收劑BP-3、BMDBM和1種內標物的標準物質，分別用甲醇配制成100mg/L的儲備溶液，將儲備溶液稀釋成1mg/L的工作溶液，最后配制成濃度為1、5、10、20、50、100和200μg/L的標準工作溶液，內標濃度為100μg/L。以內標法建立標準工作曲線。
(4)三重串聯(lián)四極桿液質聯(lián)用儀(LC-MS/MS)檢測
色譜柱為Agilent SB-C18(3.0×100mm,1.8μm)；色譜柱為Agilent SB-C18(3.0×100mm,1.8μm)、柱溫為40℃、進樣量為5μL。流動相為0.01％甲酸水溶液(體積比)(A)和甲醇(B)，梯度洗脫程序如下：0～4min 40％～90％B，5～14min 90％B，流速0.30mL/min。質譜離子源為電噴霧離子化源(ESI)正模式；噴霧氣壓力為30psi；鞘氣流速為11mL/min，鞘氣溫度為250℃；干燥氣溫度為300℃，干燥氣流速為3mL/min。在此條件下，目標化合物和內標的質譜參數(shù)如表2所示。
上述內標物為異丙甲草胺-D6(Metolachlor-d6)。
定性鑒定：在相同儀器條件下，若樣品中2種目標化合物的色譜峰保留時間與標準工作溶液中相應的目標化合物保留時間相一致，并且定性和定量離子對均出現(xiàn)，兩對離子的豐度比與標準溶液一樣，則可判斷用品中存在這種紫外線吸收劑。
定量分析：以標準工作溶液的結果建立標準工作曲線，線性范圍0～200μg/L，相關系數(shù)>0.999，帶入樣品中目標化合物的定量離子峰面積，計算樣品溶液中目標化合物的濃度，最后按樣品量計算樣品中目標化合物的濃度。
加標回收率、重復性和基質效應：
回收率采用3次平行加標，加標方法為：在不含目標化合物的土壤樣品中加入20ng/g濃度水平的目標化合物標準溶液，30min后溶劑揮發(fā)完全，目標化合物吸附于樣品中，按上述步驟進行提取和檢測。將測定的濃度與理論添加濃度進行比較，得到2種紫外線吸收劑的回收率，3個平行加標結果的標準偏差表示其重復性。基質效應測試方法：將不含目標化合物的土壤樣品提取和濃縮至1mL后，取100μL的樣品溶液，在氮吹儀上吹干，加入濃度為100μg/L的標準溶液100μL，搖勻后，上機檢測，將測定的濃度與理論濃度比較，得到方法的基質效應結果。方法的加標回收率、重復性和基質效應結果見表3所示，可以看出，BP-3和BMDBM的平均回收率為99.3％和93.2％，標準偏差(RSD)為2.3％和2.9％，基質效應為105％和96.9％，說明方法回收率高、重復性好、基質干擾低，可用于實際樣品的檢測。
檢出限和定量限：
S/N＝3時對應的濃度為檢出限，S/N＝10時對應的濃度為定量限，具體操作為：利用軟件計算出加標濃度下的信噪比，用該濃度除以信噪比，該結果的3倍為該方法的檢測限，10倍為定量限。方法的檢出限和定量限結果如表3所示，可以看出，在土壤樣品中，BP-3和BMDBM的檢出限(LOD)<1.0ng/g，定量限(LOQ)<2.0ng/g，說明本檢測方法靈敏度高，檢出限的定量限都較低。
表3 方法回收率、基質效應、檢出限和定量限
a平均值±標準偏差(％)(n＝3)；b平均值±標準偏差(％)(n＝3)；c(ng/g)；d(ng/g)
實施例2
(1)樣品前處理
采集200g土壤樣品，冷凍干燥后，去除石塊和植物根葉等較大的雜質，研磨均勻并過0.90mm篩。
(2)提取
萃取池底部放入一張玻璃纖維濾紙，壓平，加入5.0g石英砂，輕敲萃取池，使石英砂表面平整，再加入5.0g前處理后的土壤樣品，同樣平整樣品表面后，加入100μL 1mg/L的內標物工作溶液，加入5.0g石英砂，最后放入另一張濾紙壓緊后擰緊萃取池。提取溶劑為甲醇/二氯甲烷(60：40，v/v)，提取溫度為100℃，靜態(tài)提取時間為5min，氮氣吹掃時間為60s，靜態(tài)提取循環(huán)2次。萃取液用旋轉蒸發(fā)儀蒸干后，重新以1mL甲醇定容，然后過0.22μm有機相尼龍濾膜，并轉移至進樣小瓶中，待上機檢測。
(3)標準工作溶液的配制
用分析天平稱取2種紫外線吸收劑BP-3、BMDBM和1種內標物的標準物質，分別用甲醇配制成100mg/L的儲備溶液，將儲備溶液稀釋成1mg/L的工作溶液，最后配制成濃度為1、5、10、20、50、100和200μg/L的標準工作溶液，內標濃度為100μg/L。以內標法建立標準工作曲線。
(4)三重串聯(lián)四極桿液質聯(lián)用儀(LC-MS/MS)檢測
色譜柱為Agilent SB-C18(3.0×100mm,1.8μm)；色譜柱為Agilent SB-C18(3.0×100mm,1.8μm)、柱溫為40℃、進樣量為5μL。流動相為0.01％甲酸水溶液(體積比)(A)和甲醇(B)，梯度洗脫程序如下：0～4min 40％～90％B，5～14min 90％B，流速0.30mL/min。質譜離子源為電噴霧離子化源(ESI)正模式；噴霧氣壓力為30psi；鞘氣流速為11mL/min，鞘氣溫度為250℃；干燥氣溫度為300℃，干燥氣流速為3mL/min。在此條件下，目標化合物和內標的質譜參數(shù)如表2所示。
上述內標物為異丙甲草胺-D6(Metolachlor-d6)。
定性鑒定：在相同儀器條件下，若樣品中2種目標化合物的色譜峰保留時間與標準工作溶液中相應的目標化合物保留時間相一致，并且定性和定量離子對均出現(xiàn)，兩對離子的豐度比與標準溶液一樣，則可判斷用品中存在這種紫外線吸收劑。
定量分析：以標準工作溶液的結果建立標準工作曲線，線性范圍0～200μg/L，相關系數(shù)>0.999，帶入樣品中目標化合物的定量離子峰面積，計算樣品溶液中目標化合物的濃度，最后按樣品量計算樣品中目標化合物的濃度。
加標回收率、重復性和基質效應：
回收率采用3次平行加標，加標方法為：在不含目標化合物的土壤樣品中加入10ng/g濃度水平的目標化合物標準溶液，30min后溶劑揮發(fā)完全，目標化合物吸附于樣品中，按上述步驟進行提取和檢測。將測定的濃度與理論添加濃度進行比較，得到2種紫外線吸收劑的回收率，3個平行加標結果的標準偏差表示其重復性?；|效應測試方法：將不含目標化合物的土壤樣品提取和濃縮至1mL后，取100μL的樣品溶液，在氮吹儀上吹干，加入濃度為50μg/L的標準溶液100μL，搖勻后，上機檢測，將測定的濃度與理論濃度比較，得到方法的基質效應結果。方法的加標回收率、重復性和基質效應結果見表4所示，可以看出，BP-3和BMDBM的平均回收率為95.1％和92.7％，標準偏差(RSD)為2.0％和2.4％，基質效應為93.0％和91.7％，說明方法回收率高、重復性好、基質干擾低，可用于實際樣品的檢測。
檢出限和定量限：
S/N＝3時對應的濃度為檢出限，S/N＝10時對應的濃度為定量限，具體操作為：利用軟件計算出加標濃度下的信噪比，用該濃度除以信噪比，該結果的3倍為該方法的檢測限，10倍為定量限。方法的檢出限和定量限結果如表4所示，可以看出，在土壤樣品中，BP-3和BMDBM的檢出限(LOD)<1.0ng/g，定量限(LOQ)<2.0ng/g，說明本檢測方法靈敏度高，檢出限的定量限都較低。
表4 方法回收率、基質效應、檢出限和定量限
a平均值±標準偏差(％)(n＝3)；b平均值±標準偏差(％)(n＝3)；c(ng/g)；d(ng/g)
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。