本發(fā)明涉及磷酸酶活性的測(cè)定方法，具體涉及一種測(cè)定土壤中酸性磷酸酶活性的方法。
背景技術(shù)：
：土壤磷作為植物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，大部分是以有機(jī)態(tài)的磷存在（占全磷的15%~80%），而有機(jī)磷通常需要在土壤磷酸酶的酶促作用下，才能分解轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的形態(tài)。磷酸酶作為土壤中重要的水解酶類，可以催化磷酸酯和磷酸酐的水解，而其中酸性磷酸單脂酶與有機(jī)磷礦化及磷素營(yíng)養(yǎng)關(guān)系最為密切。土壤中酸性磷酸酶活性的強(qiáng)弱影響到土壤磷素循環(huán)中土壤有機(jī)磷的分解，轉(zhuǎn)化及其生物有效性。且催化土壤中一系列生物化學(xué)反應(yīng)，間接影響到土壤肥力及植物代謝過(guò)程等。所以，研究土壤中酸性磷酸酶的活性，有利于深入理解土壤中磷的轉(zhuǎn)化過(guò)程、方向及強(qiáng)度。土壤中酸性磷酸酶的活性受到土壤理化性質(zhì)，如水分，溫度，PH的強(qiáng)烈影響，同時(shí)也受到森林管理措施，不同植被類型等的影響，而到目前為止，國(guó)內(nèi)有關(guān)酸性磷酸酶活性的測(cè)定基本都是參照關(guān)松蔭的《土壤酶及其研究方法》和1995年Kandeler等人編著的《Methodsinsoilbiology》等書(shū)中的方法。該類方法比較繁瑣，操作步驟復(fù)雜，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，且試劑用量較多，比色顯色不穩(wěn)定等缺陷導(dǎo)致不宜作大樣本量的分析。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是解決上述問(wèn)題，提供一種使用的試劑種類少、用量小，操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，具有良好的重現(xiàn)性且能快速而準(zhǔn)確的測(cè)定土壤酸性磷酸酶活性的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種測(cè)定土壤中酸性磷酸酶活性的方法，包括以下步驟：1）準(zhǔn)備原料：一份新鮮土壤，pH在4.8~5.2之間的醋酸鹽緩沖液，濃度為5.0~5.1umol/ml、作為底物的對(duì)硝基苯磷酸二鈉溶液，濃度為38~41mg/ml的NaOH溶液；2）在新鮮土壤中取一份土壤樣品A，稱量并記錄鮮重，然后將其烘干至恒重后，稱量并記錄干重，由此計(jì)算得到該新鮮土壤的含水率；再在該新鮮土壤中取一份1~5g重的土壤樣品B，稱量并記錄其鮮重；3）在土壤樣品B中加入40ml的醋酸鹽緩沖液，攪拌均勻，得到粗酶液，測(cè)量并記錄其體積，繼續(xù)攪拌，保持粗酶液處在混合均勻的狀態(tài)；4）取一塊96孔酶標(biāo)板，記為酶標(biāo)版A，在酶標(biāo)版A中設(shè)置3~6組樣品和對(duì)照；所述每組樣品中都移取了100ul混合均勻的粗酶液和150ul底物作為培養(yǎng)液；所述每組對(duì)照均包括一個(gè)底物對(duì)照和一個(gè)粗酶液對(duì)照，所述底物對(duì)照都移取了150ul底物和100ul醋酸鹽緩沖液作為培養(yǎng)液，所述粗酶液對(duì)照都移取了100ul混合均勻的粗酶液和150ul醋酸鹽緩沖液作為培養(yǎng)液；5）將步驟4）中裝好培養(yǎng)液后的酶標(biāo)板A置于30℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)45~60min；6）先取一個(gè)干凈且無(wú)色透明的96孔酶標(biāo)板，記為酶標(biāo)板B，用酶標(biāo)儀于405nm波長(zhǎng)處比色，檢測(cè)到酶標(biāo)板B每孔對(duì)應(yīng)的Abs，記為空白對(duì)照Abs；然后取出培養(yǎng)結(jié)束后的酶標(biāo)板A，分別移取100ul的樣品和對(duì)照的上清液至酶標(biāo)板B上對(duì)應(yīng)的孔位，并分別加入10ul的NaOH溶液終止反應(yīng)，最后置入酶標(biāo)儀于405nm波長(zhǎng)處比色，得到樣品Abs、底物對(duì)照Abs和粗酶液對(duì)照Abs；7）計(jì)算OD值：所述OD=（樣品Abs-空白對(duì)照Abs）-[（底物對(duì)照Abs-空白對(duì)照Abs）+（粗酶液對(duì)照Abs-空白對(duì)照Abs）]，其中，每組樣品Abs和對(duì)照Abs所減去的空白對(duì)照Abs，都是與其在酶標(biāo)板A中的孔相對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)板B中的孔的空白對(duì)照Abs；所述OD為樣品吸光度減去對(duì)照吸光度后的吸光度；按照此步驟可計(jì)算出其余樣品的OD值；8）計(jì)算得到酸性磷酸酶活性：酶活性(umol·h-1·gDOM-1)=（OD×0.25×V）/（EC×h×m×0.1）m=m鮮×(mA干/mA鮮)其中，m為土壤樣品B的干重，單位為g；m鮮為土壤樣品B的鮮重，單位為g；mA干指樣品A的干重，單位為g，mA鮮指樣品A的鮮重，單位為g；0.25是指酶標(biāo)板單孔培養(yǎng)液體積為0.25ml；V為粗酶液體積，單位為ml；EC為消光系數(shù)；h為培養(yǎng)液在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的時(shí)間，單位為小時(shí)；0.1是比色所取上清液的體積0.1ml。具體的說(shuō)，所述醋酸鹽緩沖液由三水乙酸鈉、冰醋酸與去離子水混合而成。具體的說(shuō)，所述醋酸鹽緩沖液的pH為5.0。具體的說(shuō)，所述步驟2）中，所述烘干步驟是將土壤放置在溫度為60~105℃的烘箱中進(jìn)行哄干的，哄干時(shí)長(zhǎng)為36~48h。具體的說(shuō)，所述步驟3）中，粗酶液的配置過(guò)程為：先將土壤樣品B置于50ml的廣口三角瓶中，再向廣口三角瓶中加入40ml的醋酸鹽緩沖液，然后向其中放入一顆攪拌子，并將該廣口三角瓶放在磁力攪拌器上方進(jìn)行攪拌，使其混合均勻，得到粗酶液，并繼續(xù)攪拌，使粗酶液處在混合均勻的狀態(tài)。進(jìn)一步的，所述步驟5）中，酶標(biāo)板A放入培養(yǎng)箱之前，在其上方蓋一層保鮮膜。作為另一種方式，所述步驟4）中每組對(duì)照都增加了一個(gè)緩沖液對(duì)照，且每個(gè)緩沖液對(duì)照都移取了250ul醋酸鹽緩沖液作為培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)；同時(shí)，步驟6）中分別移取100ul緩沖液對(duì)照的上清液至酶標(biāo)板B上對(duì)應(yīng)的孔位，再分別加入10ul的NaOH溶液終止反應(yīng)，最后與其他組樣品和對(duì)照一起置入酶標(biāo)儀于405nm波長(zhǎng)處比色，得到3~6個(gè)緩沖液對(duì)照Abs。第1）~3）即第5）步均與前述步驟相同。進(jìn)一步的，所述步驟7）中，所述OD=（樣品Abs-空白對(duì)照Abs）-[（緩沖液對(duì)照Abs-空白對(duì)照Abs）+（底物對(duì)照Abs-空白對(duì)照Abs）+（粗酶液對(duì)照Abs-空白對(duì)照Abs）]，其中，每組樣品Abs和對(duì)照Abs所減去的空白對(duì)照Abs，都是與其在酶標(biāo)板A中的孔相對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)板B中的孔的空白對(duì)照Abs；所述OD為樣品吸光度減去對(duì)照吸光度后的吸光度；按照此步驟可計(jì)算出其余樣品和對(duì)照組的OD值。然后，按照前述步驟8）的方式即可計(jì)算得到土壤酸性磷酸酶活性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：（1）本發(fā)明方法采用對(duì)硝基苯磷酸二鈉為底物，與傳統(tǒng)方法采用磷酸苯二鈉作為底物相比，其培養(yǎng)時(shí)間更短，顯色方法更加簡(jiǎn)單，顯色所需時(shí)間短，且靈敏度更高，顯色更為穩(wěn)定，可在大大縮短了試驗(yàn)時(shí)間的同時(shí)，有效提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。同時(shí)，由于酶標(biāo)板本身對(duì)比色有一定影響，故本方法會(huì)在待測(cè)液比色前先將空酶標(biāo)板（空白對(duì)照組）進(jìn)行比色，作為空白，再將培養(yǎng)板上清液移至比色板比色，之后用整板數(shù)據(jù)減去空板數(shù)據(jù)得到更加準(zhǔn)確的OD值，有效提高了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。（2）本發(fā)明方法的培養(yǎng)試驗(yàn)是在96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行，且比色時(shí)是采用整板比色的，比色更快，不需用以往方法提及的離心管，玻璃試管等，所采用的實(shí)驗(yàn)儀器少，也減少了試驗(yàn)步驟的繁瑣性，加快了實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，提高了效率。（3）本發(fā)明方法試劑用量少，可同時(shí)在相同的條件下測(cè)定多種土壤的多個(gè)樣品組，且由于底物對(duì)照不涉及土壤，故可以多種土壤均只對(duì)應(yīng)同一酶標(biāo)板中的3-6組的底物對(duì)照，相對(duì)于重復(fù)測(cè)定的方式，減小了人工誤差，使測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確，測(cè)定過(guò)程更加簡(jiǎn)便，耗費(fèi)時(shí)間也更短。（4）本發(fā)明方法測(cè)定土壤酸性磷酸酶活性快速且準(zhǔn)確，且該方法使用的試劑種類少，用量小，操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，具有良好的重現(xiàn)性。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，本發(fā)明的方式包括但不僅限于以下實(shí)施例。實(shí)施例1本實(shí)例所使用的土壤樣品1-4號(hào)為暗棕壤，采自于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)阿壩州理縣畢棚溝“高山森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站”云杉人工林。所使用的土樣5-8號(hào)為黃壤，采自宜賓老君山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)水杉人工林。兩個(gè)地點(diǎn)土壤采集時(shí)間為2016年6月，采集0-15cm土壤樣品。測(cè)定該土壤中酸性磷酸酶活性的方法，包括以下步驟：（1）準(zhǔn)備原料1）配置醋酸鹽緩沖液：稱取4.374g的三水乙酸鈉，向其中加入1.1ml冰醋酸和800ml的去離子水，待固體溶解后，定容至1L，可得到pH在4.8~5.2之間的醋酸鹽緩沖液；2）配置NaOH溶液：稱取4gNaOH，將其溶于100ml去離子水，得到濃度為38~41mg/ml的NaOH溶液；3）配置底物：稱取185.6mg的對(duì)硝基苯磷酸二鈉（CAS號(hào)：333338-18-4，Sigma公司購(gòu)置），再量取A中醋酸鈉緩沖液100ml，將對(duì)硝基苯磷酸二鈉溶于該100ml醋酸鈉緩沖液中，即得到底物對(duì)硝基苯磷酸二鈉溶液。（2）土壤干重1）以土樣1為例，計(jì)算土樣1含水率：稱取9.1645g過(guò)2mm篩的新鮮土壤于鋁盒中，記為土壤樣品A，稱量并記錄鋁盒重11.5911g，鋁盒與新鮮樣品總重為20.7556g，然后放入溫度為60~105℃的烘箱中烘干至恒重，烘干時(shí)長(zhǎng)為36~48小時(shí)，然后取出，稱量并記錄鋁盒與烘干樣品總重為16.9961g，根據(jù)公式MA干/MA鮮=(16.9961-11.5911)/9.1645=0.5898，計(jì)算得到土樣含水率為69.56%。2）以土樣1為例，計(jì)算土樣樣品干重：稱取3.2478g過(guò)2mm篩的新鮮土壤，記為土壤樣品B，根據(jù)1）中含水率可計(jì)算得到土壤樣品B的干重m=m鮮×(MA干/MA鮮)=3.2478×0.5898=1.9156g。3）按上述方法測(cè)量并計(jì)算得到其他七個(gè)土樣的數(shù)據(jù)，如表1所示：表1土樣數(shù)據(jù)表土樣樣品A鮮重（g）樣品A干重（g）含水率（%）樣品B鮮重（g）樣品B干重（g）土樣19.16455.405069.563.24781.9155土樣210.43137.388841.183.41422.4184土樣39.40156.440545.973.37712.3135土樣49.05355.826455.393.34732.1542土樣510.33505.805078.043.83502.1541土樣610.35006.355062.863.79762.3318土樣710.31506.580056.763.84772.4545土樣810.41506.650056.623.81802.4378（3）制粗酶液在土壤樣品B置于50ml的廣口三角瓶中，加入40ml的醋酸鹽緩沖液，測(cè)量并記錄其體積后，放入一顆攪拌子，然后將廣口三角瓶置于磁力攪拌器上，將磁力攪拌器調(diào)整到高速狀態(tài)，攪拌2min，使其混合均勻，得到粗酶液；為了保持粗酶液一直處在混合均勻的狀態(tài)，將磁力攪拌器速度調(diào)低，繼續(xù)攪拌，使粗酶液處于混合均勻、內(nèi)部形成的旋渦直徑小于廣口三角瓶瓶口半徑的狀態(tài)。（4）測(cè)定Abs表296孔酶標(biāo)板示意圖123456789101112a底底底底底底酶8酶8酶8樣8樣8樣8b酶1酶1酶1樣1樣1樣1酶9酶9酶9樣9樣9樣9c酶2酶2酶2樣2樣2樣2酶10酶10酶10樣10樣10樣10d酶3酶3酶3樣3樣3樣3酶11酶11酶11樣11樣11樣11e酶4酶4酶4樣4樣4樣4酶12酶12酶12樣12樣12樣12f酶5酶5酶5樣5樣5樣5酶13酶13酶13樣13樣13樣13g酶6酶6酶6樣6樣6樣6酶14酶14酶14樣14樣14樣14h酶7酶7酶7樣7樣7樣7酶15酶15酶15樣15樣15樣15注：樣表示樣品孔；底表示底物對(duì)照孔；酶表示粗酶液對(duì)照孔；數(shù)字表示樣品號(hào)，一個(gè)酶標(biāo)板可以測(cè)定15個(gè)樣品3組重復(fù)。表3操作表空白對(duì)照孔底物對(duì)照孔粗酶液對(duì)照孔樣品孔醋酸鹽緩沖液空置100ul150ul-粗酶液--100ul100ul底物-150ul-150ul1）取兩塊如表2所示的完好透明的96孔酶標(biāo)板，為了方便描述，將其記為酶標(biāo)板A1和酶標(biāo)板A2，在其中設(shè)置8份土壤的樣品和對(duì)照（3個(gè)重復(fù)），理縣和宜賓分別在酶標(biāo)板A1和酶標(biāo)板A2培養(yǎng)。在酶標(biāo)板A1中，理縣板做1-4號(hào)孔，5-15號(hào)空置，土樣編號(hào)為1-4；在酶標(biāo)板A2中，宜賓板做1-4號(hào)孔，5-15號(hào)空置，土樣編號(hào)為5-8；其中，每份土樣都對(duì)應(yīng)3個(gè)樣品孔，和3個(gè)粗酶液對(duì)照孔，所有樣品共用6個(gè)底物對(duì)照孔，且該底物對(duì)照孔設(shè)置為酶標(biāo)板中的a1-a6孔；按表3所示，用移液器移取相應(yīng)體積的醋酸鹽緩沖液、粗酶液和底物到對(duì)應(yīng)的孔中；為了防止粗酶液堵塞移液器，所述移液器的吸頭尖部減掉了一截，使其直徑為1~2mm。2）將步驟1）中加完溶液的酶標(biāo)板A1和酶標(biāo)板A2上方各覆蓋一層保鮮膜，然后將其置于30℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)1h；若是培養(yǎng)失敗，則應(yīng)當(dāng)適當(dāng)增加粗酶液濃度或延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間；3）取出培養(yǎng)結(jié)束后的酶標(biāo)板A1和酶標(biāo)板A2，帶有粗酶液的樣品孔和對(duì)照孔中，土壤微粒沉淀在酶標(biāo)板底部，上部澄清；先選一個(gè)完好、干凈、透明且無(wú)色的96孔酶標(biāo)板，記為酶標(biāo)板B，并將酶標(biāo)板B用酶標(biāo)儀于405nm波長(zhǎng)處比色，得到酶標(biāo)板B中各個(gè)孔對(duì)應(yīng)Abs值，得到空白對(duì)照Abs；測(cè)定空白對(duì)照Abs是因?yàn)椴徽撁笜?biāo)板多么干凈，或多或少都會(huì)影響我們樣品和對(duì)照的吸光度的測(cè)定，因此，在此步驟中，現(xiàn)將空白的酶標(biāo)板的吸光度測(cè)定出來(lái)，然后待測(cè)定好帶有培養(yǎng)液的酶標(biāo)板的吸光度后，減去空白的酶標(biāo)板的吸光度，以消除空酶標(biāo)板本身的吸光度值對(duì)它們的影響。然后取出培養(yǎng)好的酶標(biāo)板A1和酶標(biāo)板A2，并分別移取100ul的樣品和對(duì)照的上清液至酶標(biāo)板A1和酶標(biāo)板A2上的帶有培養(yǎng)液的孔位，并分別加入10ul的NaOH溶液終止反應(yīng)，最后用酶標(biāo)儀于405nm波長(zhǎng)處比色，得到各個(gè)孔對(duì)應(yīng)的Abs值，然后減去對(duì)應(yīng)孔的空白對(duì)照Abs，即可得到樣品Abs，底物對(duì)照Abs和粗酶液對(duì)照Abs；其具體的數(shù)據(jù)如表4所示：表4各組樣品和對(duì)照的Abs數(shù)據(jù)（5）計(jì)算1）計(jì)算OD值根據(jù)表3中的數(shù)據(jù)可分別計(jì)算得到對(duì)應(yīng)組的OD，（以土樣1中第一組為例）所述OD=樣品Abs-（平均底物對(duì)照Abs+粗酶液對(duì)照Abs）=0.137-（0.004167+0.093）=0.0398，其中，由于底物對(duì)照并未加入土壤，其測(cè)定無(wú)需與樣品一一對(duì)應(yīng)，故共只設(shè)置了6組，因此，在計(jì)算時(shí)，只需要將其平均值算出，帶入公式即可。所述OD為樣品吸光度減去對(duì)照吸光度后的吸光度；按照此公式可計(jì)算出其他各土樣中各組樣品的OD值。2）計(jì)算酸性磷酸酶活性：酶活性（umol·h-1·gDOM-1）=（OD×0.25×V）/（EC×h×m×0.1）=（0.0398×0.25×43）/（1.0444×1×1.9156×0.1）=2.1386；其中，m為土壤樣品B的干重，單位為g；m鮮為土壤樣品B的鮮重，單位為g；0.25是指酶標(biāo)板單孔培養(yǎng)液體積為0.25ml；V為粗酶液體積，單位為ml；EC為消光系數(shù)；h為培養(yǎng)液在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的時(shí)間，單位為小時(shí)；0.1是比色所取上清液的體積0.1ml；按照此公式可計(jì)算出其他各土樣中各組的酶活性值，并記錄如表5所示：表5酸性磷酸酶活性本實(shí)施例中，消光系數(shù)的計(jì)算是采用對(duì)硝基酚配制成1.00umol/ml的標(biāo)準(zhǔn)液為基液，在干凈、透亮的酶標(biāo)板中稀釋成不同濃度（具體操作為：在A1-A6孔中分別加入0ul、20ul、40ul、60ul、80ul、100ul標(biāo)準(zhǔn)液，然后加入醋酸鈉緩沖液補(bǔ)充至100ul，得到濃度分別為0umol/ml、0.2umol/ml、0.4umol/ml、0.6umol/ml、0.8umol/ml和1umol/ml的對(duì)硝基酚溶液），再分別向其中加入10ulNaOH溶液終止反應(yīng)顯色后，于酶標(biāo)板405nm處比色。以硝基酚溶液的濃度為橫坐標(biāo)，得到的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其斜率便為消光系數(shù)。由實(shí)施例1可知，本發(fā)明方法采用對(duì)硝基苯磷酸二鈉為底物，與傳統(tǒng)方法采用磷酸苯二鈉作為底物相比，其操作簡(jiǎn)單，使用的試劑種類少，用量小，培養(yǎng)時(shí)間更短，顯色方法簡(jiǎn)單，所需時(shí)間短，具有良好的重現(xiàn)性；而且，比色是采用酶標(biāo)板進(jìn)行，可同時(shí)作出多組對(duì)比試驗(yàn)，不需用以往方法提及的離心管，玻璃試管等，大大減少了試驗(yàn)步驟的繁瑣性。實(shí)施例2本實(shí)施例與實(shí)施例1相似，僅存在以下不同：步驟（4）中，在酶標(biāo)板A1和A2中各新增加了6組緩沖液對(duì)照組，且該緩沖液對(duì)照組中的培養(yǎng)液為250ul的醋酸鹽緩沖液，其余操作均與底物對(duì)照相同，得到緩沖液對(duì)照Abs，記錄數(shù)據(jù)如表6所示：表6緩沖液對(duì)照的Abs數(shù)據(jù)理縣緩沖液對(duì)照-0.0010-0.003-0.0010.0020.002宜賓緩沖液對(duì)照0-0.002-0.0010．001-0.0010.001步驟（5）中OD值計(jì)算公式為：OD=樣品Abs-（緩沖液對(duì)照Abs+平均底物對(duì)照Abs+粗酶液對(duì)照Abs）=0.137-（0.0005+0.004167+0.093）=0.0393將其帶入下述公式即可算得酶活性值：酶活性(umol·h-1·gDOM-1)=（OD×0.25×V）/（EC×h×m×0.1）=（0.0400×0.25×43）/（1.0444×1×1.92×0.1）=2.1493；按照此公式可計(jì)算出其他各土樣中各組的酶活性值，并記錄如表7所示：表7酸性磷酸酶活性上述實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，不應(yīng)當(dāng)用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，但凡在本發(fā)明的主體設(shè)計(jì)思想和精神上作出的毫無(wú)實(shí)質(zhì)意義的改動(dòng)或潤(rùn)色，其所解決的技術(shù)問(wèn)題仍然與本發(fā)明一致的，均應(yīng)當(dāng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3